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要約

ここで哺乳類細胞における一括 autophagic 貯留活性を測定する簡単なよく検証されたプロトコルが記述されています。メソッドは、sedimentable セル画総細胞 LDH レベルと比較して乳酸脱水素酵素 (LDH) の割合を定量化に基づいています。

要約

一括オートファジーは、ダブル/多 membrane 構造オートファゴソームと呼ばれる細胞質の大部分の隔離によって特徴付けられます。ここでこのプロセスを監視する単純なプロトコルを説明します。また、典型的な結果と各種培養細胞におけるオートファジー誘導下法の実験的検証を提供します。一括オートファジーの中にオートファゴソームは、細胞質、およびそれによりまた他のオートファジーの貨物と一緒に、可溶性細胞質蛋白質を隔離します。LDH は、安定と高い非選択的にオートファゴソームに隔離されます豊富な水溶性のゾル性細胞質酵素です。LDH 貯留量したがって一括 autophagic 貯留量が反映されます。Sedimentable 中の酵素活性の測定に続いて、ゾル性細胞質の LDH から sedimentable から効果的に分離分別の electrodisruption ベース プロトコルを用いて効率的かつ正確にセルで LDH 隔離の決定、全細胞サンプル対分数。オートファジーの隔離は、sedimentable その扱われた細胞から未処理細胞の LDH の割合を減算して決定されます。LDH 隔離アッセイの利点は、どちらかが隔離プローブまたは半定量的なプロテアーゼの異所性発現を含む他の方法ではなく、内因性の貨物のオートファジーの隔離の定量的測定を与えることオートファジーのマーカーや受容体の解析を保護。

概要

オートファジー (「自己を食べる」のギリシャ語) は、細胞内物質の液胞/ライソゾームの分解の進化保存されたプロセスです。酵母とヒトのオートファジーのために重要であるオートファジー関連 (「ATG」) 遺伝子の発見時に実現オートファジーは、人間の健康と病気 (2016年ノーベル医学・生理学によって認められる重要な役割を果たしています。大隅良典)、オートファジーは細胞生物学1,2で最も激しく学びのプロセスの 1 つになるすぐに。

Macroautophagy (以下「オートファジー」といいます) 延長で特徴づけられると効果的に隔離密閉、ダブル membrane の構造 (「オートファゴソーム」) に細胞内膜 cisternae ("phagophores") の折りたたみ、細胞質の残りの部分からそのただ中の材料。オートファゴソーム リソソームとの融合、時に内側 autophagosomal 膜と隔離の貨物は劣化や再生します。オートファゴソームは、ランダムな (非選択的オートファジー) と選択 (選択的オートファジー) マナーの両方で細胞質材料を隔離することができます。最も可能性の高い一括オートファジーは、非選択的、選択的オートファジーのミックスを表します。

1960 年代および 70 年代 (「形態」の時代オートファジー研究)、オートファジー隔離主に微細構造分析によって評価しました。1980 年代と 1990 年代 (「生化学的時代」) あたり Seglen と同僚の初め-初代ラット肝細胞でオートファジーを勉強した-定量的 autophagic 隔離アクティビティ3を測定する最初方法を開発しました。これらの試金を使用して、Seglen 定義しオートファジー ・ リソソーム経路4、5の異なるステップを特徴と、発見し amphisome6 (エンドソーム オートファゴソーム融合の製品) を鋳造し、初めてオートファジー規制7蛋白質のリン酸化の役割を説明します。ただし、1990 年代に ATGs (「分子時代」) の発見と哺乳類 ATG8 蛋白質の最初の特徴の後微小管結合蛋白質 1A 1B 光鎖 3 (LC3) の 2000年8、ATG タンパク質ためのマーカーとしての使用、オートファジーの古いより困難な生化学的置き去りになったプロセスはすぐに人気を得た。実際には、過去 18 年間、西部のしみ、LC3 の蛍光顕微鏡による解析で最も人気となっている (と多くの場合、唯一) 哺乳類細胞におけるオートファジーの勉強の手段。利点は、これらの方法を実施したことが比較的容易です。欠点は、1 つは実際のオートファジーの貨物ではなくカート コンポーネント (LC3) を勉強しています。これは、状態や隔離対経路を介して LC3 のフラックスと貨物のフラックスとの関係は非常に不透明なためより深刻な不利な点です。実際には、我々 はバルク貨物フラックスを条件下で高いレベルで保つことが、示されているセル9共役 LC3 の存在にもかかわらず、LC3 フラックスがないです。さらに、我々 はバルク オートファジー効率的 LC3 枯渇による影響はありません、したがって可能性が高い LC3 独立9を示した。この発見は後 LC3 ノックアウト研究10、11、パーキン依存 mitophagy (ミトコンドリアの選択的オートファジー) は LC310,11 の独立をも示すによって確認されています.

要約すると、明確な貨物に基づく試金 autophagic 活動を監視するために必要です。最適適用、明確、かつ簡単に実行、このような試金を広くする必要があります。最後の数年間で121980 年代にあたり Seglen によって開発された、sedimentable、autophagic 液胞を含む細胞へのゾル性細胞質の LDH の転送を測定に基づく LDH の隔離の試金に特に興味を採用して分数。LDH は、phagophores enwrap 細胞質の貨物と共同隔離が容易に安定した、水溶性ゾル性細胞質蛋白質であります。したがって、LDH の隔離です autophagic 隔離の一般的なメジャーです。オートファジー ・ リソソーム経路12LDH は低下のみ。したがって、ライソゾームの分解阻害剤バフィロマイシン A1などの存在下で (Baf)13日実験的治療の効果の直接 autophagic 隔離活動に変更を反映します。分解阻害剤がない場合は、LDH の隔離と劣化の変化の正味の効果を測定できます。

LDH はすべての細胞型で高度と普遍的表現され酵素アッセイ14,15によって LDH レベル、正確に定量化することができますので、LDH 隔離アッセイは広く適用可能で。しかし、元プロトコル12 -初代ラット肝細胞の確立、かなり時間がかかるは、開始材料としてカスタムメイド放電コンデンサーを大量を必要があります。段階的に徐々 に簡単で汎用性の高い方法にアッセイを変換している私たち。まず、元のプロトコルは哺乳類の細胞ライン16で使用用に脚色されました。第二に、メソッドは、大幅に縮小した3,9だった。第三に、プロトコルのいくつかの手順が排除された、手順17を骨の折れる密度クッションなど。これは同時に、さらにダウンスケー リング サンプル (すなわちより少ない約 15-fold を開始あたり 12 ウェル プレートから単一の井戸を使用してサンプル16あたり 10 cm の板を使用しての最初の出発点から、メソッドの有効になっています。素材)17。第四に、カスタムメイド放電コンデンサー17を置き換えることができます商業エレクトロポレーション機器を識別されます。

ここで LDH 隔離アッセイは、以前に公開された17と比較してメソッドのいくつかのさらなる簡略化が含まれています私たちの最新のプロトコルが表示されます。さらに、異なる種類の細胞の数で得られた典型的な結果のセットを表示すると、重要なは、薬理学的として遺伝子ノックダウンとノックアウト アプローチを用いた手法の実験的検証の複数行が提供されます。全体のプロトコルの全体フロー方式、図 1を参照してください。

プロトコル

1. 細胞と治療

  1. 5% CO2問題のセル型の最寄りの培養液を使用して、37 ° c で加湿のインキュベーターで 75 cm2培養フラスコに細胞を付着。合流の近くの細胞層に達するまで成長する細胞を許可します。
    注: を使用して、10% 牛胎児血清 (FBS) LNCaP HEK293、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) BJ の RPMI 1640 培 MCF-7、および網膜色素上皮 - 細胞。
    1. 3 mL 37 ° C リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、pH 7.4 でセルを洗浄します。PBS に置き換えて 3 mL 0.25% (w/v) トリプシン-エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、セルをデタッチ (2-5 分) まで、37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターでフラスコを孵化させなさい。
    2. 10% を含む 7 mL 培養液中の剥離細胞を再懸濁します FBS。10 μ L で 10 μ L 細胞懸濁液因数をミックス 0.4 %0.5-20 μ L ピペット チップを用いた微量遠心チューブにトリパン ブルー。カウント チェンバー スライドをすぐに埋めるため同じピペット チップを使用し、自動化された細胞カウンターでセルをカウントします。
  2. 適切な準備希釈 1.1.2 のステップを使用してから細胞懸濁液の (下のメモを参照) 文化媒体含む 10 %fbs と種子無菌希釈セル中断 12 ウェル培養プレート (表面積 ~3.8 cm2) を使用しての各ウェル内の 1 mL技術。37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターで目的のセル密度に到達するまで、収穫の例えば、合流地点の 60-90% の成長を許可します。
    メモ: セルの種類だけでなく、期間および実験的治療の種類によると、収穫目的のセル密度を与える細胞の懸濁液の適切な希釈がセル型から変動をします。したがって、これは経験的各場合で評価されなければなりません。
    1. 実験の両方は扱われ、収穫 2 日後のシード、種子 2.5 x 105 LNCaP、HEK293、MCF 7 セル、5 × 104 MEFs、4 x 105 BJ、または 1.5 x 10 12 ウェル プレートの各ウェルに5 RPE 1 セル。
    2. 緩く付着細胞の細胞型の問題のため推奨コーティングの種類でプレートをコートします。LNCaP ・ HEK293 細胞ポリ-D-リジン (PDL) をコーティングしたプレートを使用します。
    3. そのために、各ウェル滅菌 H2O で 2.5 μ g/mL で 500 μ L PDL に追加し、室温 (20-25 ° C) で 30 分滅菌環境でプレートを孵化させなさい。吸引、PDL を取除き、洗浄も簡単に各 1 mL 滅菌 H2o.
      注: 一般に、ステップ 1.2.1 は、任意の実験的治療することがなく行われます。しかし、RNAi を実行している場合、播種9逆トランスフェクションを開始する便利な場合があります。
  3. 帳票の写しの井戸 1 つの条件で実験的治療を実行します。
    1. 例えば、50 のセルを扱う一般にオートファジーの隔離の効率的な誘導または 1 ml のアミノ酸無料アールの細胞を洗浄することにより急性の血清およびアミノ酸飢餓のセルを対象 mTOR 阻害剤 Torin1 の nM のバランスソリューション (EBSS) 媒体を塩し、その後 37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターで EBSS の 1 mL の細胞をインキュベート
    2. Sedimentable LDH のバック グラウンド レベルを定義するために未処理井戸の 1 つのセットをままにします。
    3. 後隔離阻害剤バフィロマイシン A1 (Baf) の飽和量の追加有無実験的治療のセルの前に 3-4 時間で3,13,16,18収穫。37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターで細胞をインキュベートします。
      1. 使用 100 nM LNCaP、HEK293、BJ、MCF 7 と RPE 細胞の Baf と 10 nM MEFs 向け。
      2. 同時に治療で Baf のみ 3-4 h (のようなそれらでステップ 1.3.1 は通常ある) の期間を持つ実験的治療の追加。実験的治療になった収穫前に、3 4 h まで待つし、500 x の 2 μ L 媒体に直接 Baf 株式の集中を追加します。
      3. Baf の添加後すぐにプレートを攪拌して混ぜます。この時点でコントロール、例えば、パン ホスホイノシチド 3-キナーゼ (PI3K) 阻害剤 3-メチル アデニン (3 ma)19、10 mM または選択 PI3K クラス III の 10 μ M として macroautophagic 隔離阻害薬を追加する推奨もSAR 40520阻害剤。

2. 細胞の収穫と Electrodisruption のための準備

  1. 治療期間の終わりに、吸引中の吸引、200 μ L 細胞剥離液 (37 ° C に予熱) を各ウェルに追加します。セルをデタッチ (通常約 5 分) までは、37 ° C で孵化させなさい。
    注: 0.25% (w/v) トリプシン-EDTA は、細胞剥離液の代わりに使用することがあります一方、後者が含まれます DNase には、剥離細胞の粘度を減らすことができます。媒体は吸気徹底的に限り、トリプシン EDTA または細胞の剥離溶液添加する前にセルを洗浄する必要はありません。
  2. 500 μ L 室温 (20-25 ° C) PBS、pH 7.4 では、各ウェルに 2% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) を含むを追加し、細胞塊が表示されませんまでピペットで再懸濁します。すぐに氷の上 1.5 mL 容マイクロ チューブに細胞懸濁液を転送します。
    メモ: 特記されない場合は、氷の上のすべての後続の手順を実行します。
  3. 土砂 4 ° C で 5 分間 400 × gで遠心分離によって細胞
  4. 徹底的に細胞ペレットをできるだけ乾燥させる (吸引)、上清を吸引します。
  5. 各チューブに 400 μ L 10% (w/v) スクロース (超純水 H2O) を追加します。

3. プラズマ膜 Electrodisruption と Sedimentable と合計細胞画分の分離

  1. 近い単一細胞懸濁液を取得するピペットで細胞ペレットを再懸濁し、4 mm エレクトロポレーション キュベットにそれを転送します。
    注: ピペッティング上下 ~ 10-15 回、100-1,000 μ L ピペット チップを使用して通常十分です。
  2. キュヴェットを指数関数的減衰波遺伝子導入装置と 800 で単一電気パルス放電 V、25 μ F、400 Ω;これらの設定は、持続時間 〜 8 ms のパルスを生成します。
  3. セル disruptate を 400 μ L 冷たいリン酸スクロース溶液 (100 mM ナトリウム一リン酸、2 mM ジチオトレイトール (DTT)、2 ミリメートルの EDTA、1.75% のサッカロース、pH 7.5)、1.5 mL 遠心チューブに転送する新しいピペット チップを使用し、簡単にミックスピペッティング。
    1. 省略可能: 効率的なプラズマ膜 electrodisruption17を確認するには、ミックス 10 μ L ステップ 3.3 から希薄セル disruptate の 10 μ L 0.4% トリパン ブルー 1.5 mL 遠心チューブに。カウントの商工会議所に転送し、トリパン ブルー陽性細胞の割合があることを確認 > 99%。
      1. 室温 (20-25 ° C) で 30 分のカウントの商工会議所にサンプルを残し、トリパン ブルー陽性細胞の割合が残っていることを確認してください > 99%。
    2. (省略可能)、electrodisruption は、あまりにも過酷されていない、それが細胞内オルガネラが中断されないことを確認、前述のように、手順 1.1-3.3 が大きい原料 (~ 80% コンフルエントの細胞層を 6 ウェル プレートからも) を使用して、手順 3.3 で DTT なしステップ 2.5 と 150 μ L ショ糖リン酸緩衝溶液中 150 μ L の 10% ショ糖溶液を使用します。
      1. 2 mL の遠心分離機のリン酸バッファー 8% (w/v) 密度勾配媒体 (例えば8 %nycodenz、50 mM リン酸ナトリウム、2.2% ショ糖、1 mM EDTA) の 1.2 mL 密度のクッションの上に希釈したセル disruptate ソリューションの慎重に層 200 μ L をピペットを使用します。チューブ。20,000 × g遠心機で 4 ° C の 45 分の (穏やかな加速、減速の)、ソフト ・ モード機能付きで遠心し、慎重に氷にチューブを入れてください。
      2. 作るの密度勾配の中のソリューションをピックアップし、新鮮な遠心管に転送しないようにしてください 〜 200 μ L のトップ画分の 60 μ L を慎重に取り外します。
        注: これは、「細胞液"21と呼ばれる例外的な純度の細胞質を含める必要があります。
      3. 標準的な手法と 4-20% 勾配ゲル16を使用して細胞器官に含まれる蛋白質の西部のしみの分析を実行することによって上記の手順で得られた画分の純度をテストします。
      4. カテプシン B21シトクロム c とタンパク質ジスルフィド異性化酵素、3.2 で電気ショックが中断されないリソソーム、ミトコンドリアや小胞体、それぞれを確認するための immunoblot にたとえば免疫ブロットを実行します。LDH 細胞液のゾル性細胞質蛋白質の存在を確認します。
      5. 並行して、使用抗体がどう評価している細胞小器官に含まれるタンパク質を検出できることを確認する [集計] セルの disruptate ソリューション16から作られた蛋白質のエキスで免疫ブロットを実行します。
  4. 各サンプルの手順 3.1-3.3.
  5. 900 μ L 冷たい再懸濁バッファー (50 mM ナトリウム一リン酸、1 mM DTT、1 mM EDTA および 5.9% のショ糖、pH 7.5) 0.01% と 0.5 %bsa を添加したを含む 2 mL 遠心チューブに (3.3 のステップで得られる) 各希釈セル disruptate ソリューションから 550 μ L を削除します。トゥイーン 20、および簡潔にでピペッティング ミックス。
  6. 18,000 × gで遠心するを生成する 4 ° C の 45 分のペレット"堆積 LDH"を含みます。徹底的にペレットをできるだけ乾燥させる (吸引)、上清を吸引します。-80 ° C のフリーザーにサンプルを配置します。
  7. (3.3 のステップで得られる) 各希釈セル disruptate ソリューションから新しい管に 150 μ L を転送し、-80 ° C のフリーザーにサンプルを配置します。セルに「LDH 総」レベルを決定するには、これらのサンプルを使用します。
    注: この時点で実験を一時停止できるため必要な限り。

4. LDH 抽出と LDH 酵素活性の測定

  1. 雪解け (ステップ 3.6) から"堆積 LDH"と (ステップ 3.7) から氷の上の「LDH 総」サンプルです。
  2. 1.5% Triton X-405"総 LDH"サンプル (トリトン X-405 の最終濃度 1% の降伏) を含む冷たい再懸濁バッファーの 300 μ L を追加します。30 分の冷蔵室 (4-8 ° C) でローラーのサンプルを回転させます。
  3. 冷たい再懸濁バッファー 1% トリトン X-405"堆積 LDH"サンプルとの 750 μ L を追加し、均質なソリューションに到達するまでにピペットでペレットを再懸濁します。
  4. 不溶沈殿物細胞の残骸に 4.2 と 4.3 18,000 × g 4 ° C で 5 分間でのステップからサンプルを遠心します。
  5. 冷たい 65 mM のイミダゾールのミックス 4 の部分 (冷たい 65 mM のイミダゾール (pH 7.5) の 1 つの部分を持つ pH 7.5)/0.75 mM ピルビン酸/1.8 mM 4 ° C で、少なくとも 3 週間は安定した、実用的なソリューションを取得する NADH
  6. 上清 200 μ L で 4.5 の手順作業ソリューションの 4.4 ステップからの 3 – 30 μ L をミックスします。
  7. ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (還元型) の減少、LDH 酵素活性を測定することにより LDH の量を決定する (NADH) 吸光度 340 nm LDH 濃度が既知の標準と比較して 37 ° C で。反応、すなわち吸光度 340 まで完了に近づいているまで吸光度測定を実行 nm はもはや時間とともに変化します。
    注: これは LDH 活性を測定する古典的な生化学的方法です。現在のプロトコルは、37 ° C で反応を行う、それも実行できます室温 (20-25 ° C) で手動による吸光光度法を行う場合であります。現在のプロトコルを使用して、ロボット multianalyzer の楽器は、自動化された方法で 96 ウェル プレートで実用的なソリューションとサンプルを混合し、340 で吸光度を測定する 37 ° C で nm 毎 20 秒 3 分で。その後、計測器ソフトウェア計算単位 (U) として表現される LDH 濃度 L、知られている LDH の標準校正を通じて得られた標準曲線と比較して時間をかけて吸光測定の斜面を比較することによって濃度。これにより検出の線形範囲は 30-1,500 U/l. です。代わりに、さまざまな LDH を測定する市販のキットが存在します。それらのいくつかはカップリング色または蛍光検出の他の線形範囲と紫外線吸光光度法より他の手段によって検出を有効にする製品の世代に酵素反応に基づいています。

5. LDH 隔離の計算

  1. 希釈を取って、考慮をサンプリング、各サンプルの総 LDH に堆積 LDH の割合を計算します。
    堆積 LDH (%) =figure-protocol-7234
    注: 手順中に 3.1 – 3.3 約 50 μ L はエレクトロポレーション キュベットの内外への転送のため失われます。したがって、手順 3.3 で希薄化後のセル disruptate の (800 μ L) ではなく 750 μ L の合計から計算します。
  2. Baf の割合を取得すると処理時間によって実験的に扱われた細胞、および分割からのサンプルで得られた沈殿の LDH の割合から未処理細胞 (ステップ 1.3.2) からサンプルで得られた沈殿の LDH の割合を減算します。サンプリング周期で時速 LDH を隔離します。
    隔離 LDH (%/h) =figure-protocol-7595

結果

プロトコルを使用して記載、LAPC4、DU145、Huh7、PNT2A、hela 細胞、VCaP、H3122、Hec1A を含む、別の哺乳類の細胞ライン数の一括 autophagic 隔離活動 MCF 7 T47D、U2OS、PC3、G361、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs)、網膜色素上皮-1LNCaP、BJ、HEK293 細胞を測定しました。隔離された (完全な栄養豊富な媒体) の基底条件下で査定や細胞における血清およびアミノ酸 ( bona fideオートファジー誘導条件22) 飢えた鋭く。その結果, ldh 飢餓条件下での隔離は広く異なる細胞株、LAPC4, DU145, Huh7 かろうじて検出可能レベルに至るによって異なります、PNT2 細胞 LNCaP 細胞 (図 2 ~1.6%/h (データは示されていない) A)。飢えた初代ラット肝細胞の観察率、上記細胞と通常 2.5–4%/h23から範囲内よりも高いです。基底条件下で LDH 隔離されたテストし、他の半分に ~0.5%/h 〜 ~0.2%/h からの細胞の半分の事実上検出不可能 (データは示されていない)。検出可能な基底 autophagic 貯留活性を示す細胞系統急性血清およびアミノ酸飢餓は、通常 LDH 隔離率の 3-4 倍の増加を誘導 (たとえば、図 2Aに示す LNCaP 実験を参照)。テスト細胞 (上記)、未処理細胞 (ステップ 1.3.2) からのサンプルで得られた沈殿の LDH の背景の割合は通常約 2-3%。様々 な細胞、堆積 LDH 値の変動 (CV) 内実験係数で 22 の独立した実験から (% 沈殿 LDH) 治療複製の 5.8% ± 1.7% (平均 %cv ± 標準偏差)、3.0-からであった9.0%。一緒に、これらの数字は、哺乳類細胞の LDH 隔離分析を実行するときに期待することの指示を与えます。

よくとして遺伝子のノックダウンとノックアウトとして化学剤の使用のアプローチ、広範囲 LDH 隔離アッセイが確実に隔離 autophagic 活動を測定していることを確認します。オートファゴソーム形成にアクティブな PI3K が必要とする細胞内 Ca 2 +の恒常性16のバランスし同様、クラス III (PIK3C3) および Unc 51 オートファジー活性化キナーゼ (ULK)24のような。隔離はパン PI3K 阻害剤の 3 ma が完全に廃止される図 2A、基底と飢餓による LDH のように、選択的 PIK3C3 阻害剤 SAR 40520、または小胞体 Ca2 +ポンプ阻害剤アーゼファミリー (TG)25 LNCaP 細胞。飢餓状態 (アミノ酸無料アールのバランスの取れた塩ソリューション (EBSS) 媒体へのスイッチ) の下で LDH 隔離は、TG、HEK293 細胞 (図 2B) で ULK 阻害剤 MRT67307 にも強く減る。また、飢餓による LDH の隔離は一貫して MEFs (図 2C) BJ (図 2D) で 3 ma によって阻害される MCF 7 (図 2E) と RPE-1 (図 2F)セルです。一般に、(すなわち、 Baf または他後隔離阻害剤の不在で) EBSS 培地での細胞の培養にはつながらない隔離 LDH のすべての測定可能な蓄積 (例図 2に示す LNCaP 実験を参照してA). 急性アミノ酸飢餓が加速 autophagic ライソゾーム フラックス、人里離れた LDH の急速かつ継続的な劣化の結果につながるので、これは可能性が高い。

次に、さまざまな ATG 遺伝子ノックアウト (KO) MEFs は LDH 隔離がオートファゴソーム形成のために不可欠とされるオートファジー関連遺伝子があるかどうかをテストするため採用されました。確かに、飢餓による LDH の隔離、ATG5 KO MEFs26 (図 3A)、私たちの以前の調査結果9を確認する廃止されます。また、図 3B 3 Cのように、飢餓による LDH の隔離は、また atg 7生島 MEFs27で ATG9A 島 MEFs28鈍化です。

最後に、LDH 隔離アッセイは、かどうかに隔離の飢餓誘導活性を阻害するキーの ATG 遺伝子転写のサイレンシング RNAi によるでだろうに関連してテストされました。確かに、ATG9A を対象とした siRNA、または ULK1、ULK2、LNCaP 細胞 (図 3D) 飢餓条件下での強く減らされた LDH 隔離の複合ターゲットをトランスフェクションします。さらに、我々 は照準する焦点付着のキナーゼ家族 (FIP200) 200 kDa の蛋白質の相互作用の私達の前の調査結果3,9を確認または γ-アミノ酪酸系 A (GABAA) 受容体関連タンパク質 (ターゲットを組み合わせるGABARAP) 家族のメンバーは、飢餓による LDH 隔離 (図 3D) を阻害します。

figure-results-3354
図 1: 全体の LDH の隔離のプロトコル スキームの流れ。プロトコルは (1 つの井戸) からサンプルごと指定されたボリュームを使用して、12 ウェル培養プレート形式に基づいています。示されているように、2 つの別の作業日に試金のプロトコルを分ける便利なことが。しかし、それも 1 日で全体の手順を実行する可能です。略語: ABB、ブラスト バッファーの後 (食材のためのプロトコルの手順 3.3 を参照)。RSB、再懸濁バッファー (成分のプロトコル 3.5 を参照)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-3911
図 2: オートファジー阻害化合物を用いた LDH 隔離アッセイの検証します。未処理の (A) LNCaP 細胞が残っていたか (背景差分の目的のため: ステップ 1.3.2 参照) 完全な成長媒体 (CM;RPMI 1640 + 10% ウシ胎児血清 (FBS))、または彼らは DMSO 車両 (0.1%) または 100 と扱われた nM Baf CM または血清およびアミノ酸の自由な媒体 (EBSS)。さらに、細胞の一部は、3 ma と扱われた (10 mM) の SAR-405 (10 μ M)、またはアーゼファミリー (300 nM) 示される。治療の 3 h 後セルが収穫されたと現在のプロトコルの詳細な料金として決定された LDH 隔離。(B) HEK293 細胞投与を cm、DMSO 車両 (0.1%)、100 nM Baf EBSS、示されるで。さらに、細胞の一部は 10 μ M を受信した MRT67307 (ULK 阻害剤) または 300 nM アーゼファミリー。治療の 3 h 後 LDH 隔離率を求めた。(C F)MEF (C)、BJ (D)、MCF 7 (E)、または RPE 1 (F) 細胞投与を cm、DMSO 車両 (0.1%)、Baf (10 C、100 nM nM D ~ F の) EBSS とや 10 mM 3 ma、示されるなしで。治療の 3 h 後 LDH 隔離率を求めた。A、B、D、E、および F は 1 つの実験から 3 つの生物学的複製 (帳票井戸) の平均値を示す (n = 1)、エラーバーは標準偏差を表すとします。C は、3 つの独立した実験から平均値を示しています (n = 3)、誤差、平均値の標準誤差を表すとします。p < 0.05 * * *p < 0.001、繰り返される一方通行 ANOVA のサンプルします。

figure-results-4973
図 3: ノックアウト (A ~ C) や (D) の打撃のアプローチで LDH 隔離法の検証します。(A ~ C)ATG5 野生型 (WT) またはノックアウト (KO) MEFs (A)、ATG7 WT または KO MEFs (B)、または ATG9A WT KO MEFs (C) DMSO 車両 (0.01%) cm、または 10 を扱われた nM Baf EBSS、示されるで。治療の 3 h 後 LDH 隔離率を求めた。4 つの値の平均 (A; n = 4) または 3 つ (B および C; n = 3) 平均値の標準誤差を表すエラーバーつきの独立した実験。p < 0.05、繰り返される二元のサンプルします。N. s.、重要ではないです。(D) LNCaP 細胞が逆 5 をトランスフェクトした nM nontargeting コントロール siRNA (siCtrl) の 5 nM の各 ATG9A、FIP200-、ULK1-、ULK2-、GABARAP-、GABARAPL1、または GABARAPL2 を対象とした siRNA の oligoes、示されるの。48 時間後のセルどちらか扱われた cm、DMSO 車両 (0.1%)、100 nM Baf EBSS、示されるで。治療の 3 h 後 LDH 隔離率を求めた。1 つの実験から 3 つの生物学的複製 (帳票井戸) の平均値が示されている (n = 1)、エラーバーは標準偏差を表すとします。

ディスカッション

要約するは、ここで説明されているプロトコルは哺乳類セルの一括 autophagic 隔離アクティビティを監視する信頼性が高く、広く適用できるメソッドを表します。元法12,16と比較して、いくつかの不要なステップを削除、残りの手順のいくつかを簡略化して実質的なダウンスケー リング手法を導入します。結果として、プロトコルが大幅に効率に関連してコスト- と時間- と同じサンプル量は、元のプロトコルと比較すると半分以下の時間で処理できるようです。24 サンプル手順 2-3 (1 日目) が必要になります準備プラスの約 1/2 h 効率的な作業の 3 h ~ 2 h でステップ 4 (2 日目) を実行できるに対し (時間のことを考えると必要なすべてのバッファーはあらかじめ準備された見積もり)。1 通常 baf は 3-4 時間培養 autolysosomal LDH 劣化の他の阻害剤など細胞治療で前の日に試金から 2 日連続でアッセイを分割すると便利です。しかし、それも、同じ日に全体の分析を実行する可能です。その場合は、それはスナップ凍結サンプルをステップ 3.6、3.7 で液体窒素中に時間を節約でしょう。現在のプロトコルをテストしていませんが、凍結融解の手順はすべて省略可能性があります、初代ラット肝細胞の試金のバージョンがこのステップ23せず行われている手の込んだのでそうです。

ここで提示されたプロトコルは、比較的容易に実行できます。注記のうち、ピペッティング、アッセイにいくつかサンプリングし、希薄化の手順が含まれているために正確に重要です。また、培養上清中の願望は、徹底的に、ステップ 2.5、ショ糖細胞懸濁液に存在しているイオンの量が少ない、ので、できるだけ少しのゾル性細胞質 LDH として手順 3.6 で堆積物の汚染に行ってください。前述のように試験は開始材料の広い範囲のため柔軟性があります。たとえば、LNCaP 細胞で正常に使いましたアッセイの収穫は、細胞のさまざまな量の範囲で (105セル6セルを 10 × 2.5 × 2.5) からの 10 倍差までに 。必要な材料を開始する最小は、LDH 酵素活性の方法は、どのように高感度の検出によって定義されます。プロトコルことができます非常に高い実質的にさらにダウン、2.5、3.3、3.5 3.7、4.2、4.3 の手順で使用されるボリュームを縮小します。

最も重要な要因と分析と技術的な課題は、electrodisruption ステップです。無料のイオン、等張溶液中の細胞の強いが、簡単に、電気ショックの細胞構造と細胞小器官 (autophagic 液胞を含む) そのまま12、残しながらプラズマ膜の均一、選択的な中断の結果します。 29。付着性のセルを使用して、酵素的及び機械的治療 2.1-3.1 の手順で (細胞の剥離、遠心分離、再懸濁) を容認することが不可欠です。ステップ 3.1、それは完全に単一細胞懸濁液を取得する重要ではありません。たとえば、これは LNCaP 細胞を達成するために非常に難しいです。それにもかかわらず、細胞のほぼ 100% の成功 electrodisruption は物理的に接続されたセルの数十を含む細胞の塊の中でも、常に得られます。新しいセル型をテストする場合、それは、electrodisruption の効率を確認することをお勧め (手順 3.3.1 参照)17。100% の細胞に近いする必要があります完全にトリパン ブルー正、electrodisruption ステップ17後。これは場合ではない、遺伝子導入装置の設定が変更される最も可能性が高い必要があります。20 別の哺乳類の細胞のタイプの試金を使用して、遺伝子導入装置の設定を変更する私たちが決してあった。したがって、右の設定は、1 つの哺乳類セルラインの発見されている、一度、哺乳類細胞の他のすべてのタイプのために働く可能性が高いです。Electrodisruption 条件があまりにも過酷ではないことを確認するにステップ 3.3.2 はすなわち、ことだけ膜と細胞内オルガネラの膜ではなく乱れています。

一括オートファジーは、他の貨物と細胞質のかなりの量を共同隔離オートファゴソームによって実行されます。これは細胞質の部分の純粋な選択的オートファジーを介して発生可能性があります。 または方法の選択と非選択的オートファジーのミックスを表します。それまでは、選択性と非選択的オートファジーがオートファジーの 2 つの異なるモードと共存するかどうか、または、どの程度または原則としてオートファゴソームが選択性と非選択性の両方の方法で貨物を同時に隔離かどうかに不明です。しかし、最近の研究は重要なは、選択的オートファジーの活性剤が特定貨物30の隔離のように一括ゾル性細胞質の貨物隔離の同じような増加を誘発すると報告しました。私達の自身の実験室からの結果は、これと一致している (当社の未発表の結果)。水溶性ゾル性細胞質蛋白質の隔離の分析 (例えばLDH) したがって可能性がありますに macroautophagic 隔離活動、多数の下でそうでない場合はすべての条件の変化を検出する可能性を秘めています。しかし、それはまだ証明される、条件の特定の種類が一意に排他的な選択的オートファジーどこ貨物は非常に緊密にによってラップ、phagophore もその細胞質の種類を引き起こす可能性を排除できないもののから除外です。オートファゴソームに隔離されています。このような条件が存在するかどうかのプローブ、LDH 隔離アッセイのようなバルク オートファジーの試金を選択的オートファジーの試金と並行して実行してください。

LDH 隔離アッセイの主な利点の 1 つはその内因性貨物、広範に適用されるメソッドの隔離対策です。また、アッセイは、非常に定量的方法で隔離活性を測定します。LDH 隔離アッセイ メカニズムとオープン以来のオートファゴソーム形成の調節を研究するための重要なツールは、phagophores は、LDH を隔離できません。非常に煩雑で困難なオートファゴソームのような構造が密閉されたエンティティかどうかまたは電子顕微鏡観察ではなく評価不可能です。オートファゴソームが閉じているかどうかの分析に使用される別の方法 (例えばLC3) オートファジーのマーカーの感度や受容体をテストすることです (例えばsequestosome 1 (p62/SQSTM1) またはドットの核蛋白質 (NDP52) 52) プロテアーゼ10 に ,,3132。本法の欠点は、1 つはオートファジーの貨物ではなくカート コンポーネントのプロテアーゼ保護の勉強です。また、アッセイは西部にしみが付くことに基づいているのでそれは半定量的なだけです。

内因性貨物のオートファジーを分析する能力は利点の LDH 隔離アッセイと内因性貨物の隔離を評価する他のアッセイに伴う制限は分解阻害剤に含まれているある必要があります。オートファジー隔離に対する特異的効果ではなく隔離と劣化の純効果を見分けます。LDH 分解の効率的な阻害剤には、クロロキンと塩化アンモニウムの33のような lysosomotropic やコンカナマイシン3,16,18Baf のエージェントのようなプロトン ポンプ阻害薬が含まれます。プロテアーゼ阻害剤 leupeptin 初代ラット肝細胞23でも動作しますが、一般的に我々 がテストしている哺乳類セルラインで効率的ではありません。我々 は日常的に Baf13、急速に機能し悪性と悪性の細胞に非常に効率的ですを使用します。ただし、LDH 分解阻害薬のどれも完全に固有、自食作用の阻害剤の推定の効果を除くことができないことを心に保つために重要です。非特異的影響のリスクを最小限に抑えるため、飽和レベルはちょうど、阻害剤の濃度を使用して実験の最後の数時間 (3-4 h) にのみ阻害物質が含まれてお勧めです。Baf の飽和濃度は、セル タイプごとに決定する必要があります。ガイドとして 50-100 nM が満杯になって我々 がテストしている培養細胞ラインのほとんどのいくつかのセル型 MEFs 10 のみを必要とするように対し nM Baf LDH 劣化で完全ブロック。

LDH 隔離アッセイと明白な制限はそれのみ行えること生きている細胞の固定細胞や組織におけるオートファジーの分析のための使用を排除します。その一方で、現在の試金が確立されていますない固定細胞における機能のオートファジー活性を測定することができます。現在のプロトコルをテストしていませんが、実験生物の生体内でオートファジー隔離活動を評価する LDH 隔離アッセイを使用して完全に可能こと推奨します。制限になる有機物がライソゾームの LDH 分解の阻害剤による治療を容認しなければならないし、そのような治療とアッセイのパフォーマンスの期間の潜在的な非固有のエフェクトを最小限に抑えるため、比較的短いこと阻害剤。興味深いことに、小南ら、による初期の研究は示した leupeptin (腹腔内投与体重の 2 mg/100 g の) ラットの 3-6 h 治療は肝 autophagically 人里離れた LDH の効率的な集積を観察する適切です内分 autophagic 液胞34の濃縮します。

ローゼラ35など pH 敏感な蛍光隔離の異所性発現プローブまたは桂馬36を含む分解阻害剤を必要とせず autophagic 隔離の視覚化に使用できます。また、LDH 隔離アッセイとは異なり単一細胞におけるオートファジーの隔離を視覚化するそのようなアプローチを使用できます。さらに、特定の細胞器官の隔離を監視するオルガネラ ターゲット シーケンスにプローブの融合を利用できます。強力な顕微鏡のプラットフォームは、高スループット スクリーニング分析にもできます。欠点は、異所性プローブ式としてリソソーム システムにおけるプローブの蓄積がオートファジー経路に影響を及ぼすことです。また、LDH 隔離アッセイとは異なり、効率的に導入することができます細胞に依存して 1 つです。最後に、LDH 隔離アッセイ隔離割合細胞質のストレートな定量的な結果を提供するのに対しイメージ ベースの方法でこのタイプの絶対定量出力を提供できない一般に。それを作ることは勧められるアプローチの両方のタイプを使用して、相互に補完します。分解阻害剤を必要とせず autophagic 隔離を検討する別の優れた方法は可逆電気透過3,23,37、細胞に標識のラフィノースを導入、します。 38。ラフィノースは、ライソゾーム酵素に強い膜非透過性と代謝的に不活性の砂糖です。したがって、そのオートファジーの隔離は、sedimentable セル画3,23,37,38からゾル性細胞質の分離によって続くことが。このアプローチは、ただし、LDH 隔離法よりも時間がかかる、放射能の使用のための追加の安全対策が必要です。老舗タンパク質ラベリング法39,40 により一括 autophagic 隔離と遮るもののない autophagic 貨物フラックス、寿命の長いタンパク質の分解の結果を正確に測定することができます最後に、 ,41,42,43。しかし、LDH 隔離アッセイとは異なりこのメソッドはありません特定の読み出し autophagic 活動のため寿命の長いタンパク質の劣化はプロテアソーム システムによって最も特にオートファジーより他のメカニズムによってまたので (一方 LDH隔離のみ発生するオートファジー) です。したがって、治療を日常的にする必要があるコントロールの番号が含まれ、オートファジー ・ リソソームの化学的阻害剤などプロテアソームや遺伝的オートファジー3,16に干渉。

ライソゾーム LC3 劣化 (Baf はほとんど阻害剤の有無で蛍光イメージングで西部にしみが付くことや LC3 涙点形成で LC3 II レベルを測定 LC3 の一般的に使用されるフラックス アッセイと LDH 隔離法を比較します。頻繁に使用される)、または酸性環境22蛍光タグ LC3 亜種の変遷。これらの LC3 ベースのアッセイによって有益な情報を得られる、LC3 フラックスの度合いと量貨物フラックスの種類の関係が不明なため特に解釈が困難できます。導入で述べたように、一括オートファジーとパーキン依存 mitophagy は LC3 ファミリータンパク質9,10、11,44を必要ありません。さらに、絶食ラット肝細胞における LDH 隔離と劣化進行中断期間 LC3 フラックス9いいえ autophagic リソソームがあります。したがって、この場合、貨物フラックスは、LC3 フラックスから完全に分離することができます。貨物フラックスの異なる種類の LC3 フラックスを比較するより多くの研究より良い LC3 フラックス測定法で得られた結果を解釈する必要です。

現在の形で LDH 隔離アッセイが必要な実践的な時間とコストの面で西部のしみと同等です。一括オートファジーを測定の面で隔離のラフィノース ベースの試金として少なくとも効率的だまたは長命蛋白質分解の試金が上記します。一括 autophagic 隔離アクティビティの特定の測定および閉じたオートファゴソーム形成、それはより効率的かつ LC3 フラックス アッセイや LC3 またはオートファジーの受容体のプロテアーゼの保護試金よりもストレート以来後者の試金カートのコンポーネントではなく、実際の貨物を測定します。LDH 隔離法のスループットを大幅に改善、我々 も高スループット試金から遠くだし、それは上記画像に基づく試金の効率と競うことができません。ただし、画像に基づく試金および LDH 隔離アッセイ、長所と短所、有し従って両方のタイプの試金の独自の値。LDH 隔離アッセイ半ハイスループットを作る将来の調整を介して可能性がありますが可能です。たとえば、96 ウェル フォーマットで electrodisruption を実行する可能であるべきし、人里離れた LDH からゾル性細胞質の LDH を代わりに、遠心分離、濾過により分離が、または 96-遠心分離のステップを実行することが考えられます井戸のフォーマット。また、現在のプロトコルを使用するよりはるかに敏感、LDH 活性を測定するアッセイ開発されている、市販されています。アッセイの他に興味深い将来可能性が酵母や他の単細胞生物で、哺乳類の細胞よりも他の細胞型の推定使用または植物細胞、オートファジーの生体内測定での使用だけでなく、隔離実験生物の組織で活動。

結論としては、改善し復活した形で LDH 隔離アッセイ将来オートファジー関連研究に重要なツールをなると考えています。

開示事項

著者は利害の対立があります。

謝辞

この作品は、ノルウェーの研究評議会、オスロ大学、Anders Jahre Foundation、ナンセン財団、ヘンリック ・ ホーマンのメモリで従来によって支えられた財政的に。我々 は、ATG5 の水島昇先生に感謝 + MEFs、ATG5/MEFs、ATG7 の小松雅明博士の + + + MEFs と atg 7生/MEFs、審良静男教授、ATG9A の + + MEFs と ATG9A/MEFs。建設的な方法論的議論のためのテクニカル サポートは、o. Seglen あたり博士フランク Sætre をありがちましょう。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes Eppendorf211-2130 and 211-2120
12-well plates Falcon353043
Accumax  cell detachment solutionInnovative Cell TechnologiesA7089Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1EnzoBML-CM110-0100Dissolve in DMSO
BJ cellsATCCCRL-2522use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA)VWR422361V
Burker counting chamberFisher Scientific139-658585
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermoFisher ScientficC10228
Countess II Automated Cell CounterThermoFisher ScientficAMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamberFisher Scientific139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L) Bio-Rad3450034
DTTSigma-AldrichD0632
Earle's balanced salt solution (EBSS)Gibco24010-043conatains 0.1% glucose
EDTASigma-AldrichE7889
Electroporation cuvette (4 mm)Bio-Rad1652088
Exponential decay wave electroporatorBTX Harvard Apparatus EMC 630
Fetal bovine serum (FBS)SigmaF752410% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cellsATCCCRL-1573
ImidazoleSigma-Aldrich56750Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubatorNuAireNU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentThermoFisher13778150
LNCaP cellsATCCCRL-1740use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA)Sigma-AldrichM9281Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated MicrocentrifugeBeckman Coulter Life Sciences368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode functionEppendorf Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi)Sigma-AldrichSML0702Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrumentErba DiagnosticsPL-II
MCF7 cellsATCCHTB-22
NADHMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzAxis-Shield1002424
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermoFisher31985062
Phosphate-buffered saline (PBS)Gibco20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL)VWR732-2223Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL)VWR732-2207 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL)VWR732-2355 Thermo Fischer ART Barrier tips
PipettesThermoFisher4701070Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysineSigma-AldrichP6407-10X5MGMake a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
PyruvateMerck-Millipore1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1)ATCCCRL-4000
RPMI 1640Gibco21875-037
SAR-405ApexBio A8883Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl)ThermoFisher/Ambion4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A)ThermoFisher/Ambions35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200)ThermoFisher/Ambions18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1)ThermoFisher/Ambions15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2)ThermoFisher/Ambions18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP)ThermoFisher/Ambions22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1)ThermoFisher/Ambions24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2)ThermoFisher/Ambions22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) Merck-Millipore1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) Prolabo28014.291
SucroseVWR443816T10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
ThapsigarginSigma-AldrichT9033Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405 Sigma-AldrichX4051% final
Trypan Blue stain 0.4%Molecular ProbesT10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin)Gibco25200-056
Tween-20Sigma-AldrichP22870.01% final

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