肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ ホールマーク食事誘発代謝疾患モデルから抽出された組織の炎症。

肥満は、主として単球由来マクロファージと同様に、住民組織マクロファージによる慢性的な炎症状態を促進します。食餌誘導性肥満 (DIO) はマクロファージの多様性; の役割を勉強の貴重なモデルただし、分離十分なマクロファージは炎症を起こした組織から取得する困難です。このプロトコルでは、私達は分離手順と必要なトラブルシューティングのガイドライン 18 週間の高脂肪 (HFD) または高脂肪高コレステロール (マウスから住民組織マクロファージの適切な人口を得るため私たちの研究から派生した輪郭を描くHFHCD) 食事介入。このプロトコルは、肥満や動脈硬化、肝、白色脂肪組織 (WAT)、大動脈などで学んだ 3 つのホールマーク組織に焦点を当てください。我々 はどのように二元的な使用を強調流れの cytometry 分離の新しいディメンションと住民組織マクロファージの性質を達成できます。このプロトコルの基本的なセクションは、フローサイトメトリーによる解析の染色後の細胞表面抗体とマクロファージの分離、組織固有の酵素の消化力の基になる複雑さを扱います。このプロトコルは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの基になる既存の複雑さに対処し、適切に並べ替えられた細胞集団から幅広い評価を得られるようにこれらの複雑さへの明確化を提案します。豊かな代替メソッドは、並べ替え FACS を操作するときの柔軟性と時間の管理を可能にする高密度の肝臓などの細胞に含まれています。簡単に言えば、このプロトコルを特定の研究では炎症を起こした組織の多数のマクロファージの不均一性を評価する研究者を助けるし、良好な細胞の単離と解析の成功している洞察力のトラブルシューティングのヒントを提供しますDIO を介した炎症における免疫細胞。

マウス モデルは、人間の病気の研究に広く使用されています。病気の状態のマウスから常駐細胞の適切な分離は、病¹の病態を分子・細胞の貢献を理解するためのプラットフォームを提供できます。重要です 1 つの障害は、肥満です。肥満の発生率は、インスリン抵抗性と並行世界的に上昇、タイプ 2 の糖尿病、心血管疾患、脂肪肝疾患^2,3を継続します。過剰栄養摂取はさらに減らされた身体活動⁴大動脈および肝臓などの末梢組織の細胞環境を変更することができます脂肪組織から発せられる変更された信号をトリガーによって偏っています。代謝恒常性のような混乱は、慢性低学年全身性炎症⁵の結果します。

古典的活性化マクロファージの白色脂肪組織 (WAT) の募集と同様に大動脈および肝臓に居住者だけでなく代謝シグナルの調節不全を開始、また炎症^6,7を維持する示されています。大食細胞の表現型および機能の多様性は肥満の病因に強く関連付けられている関連する併存⁷。マクロファージ偏波の動的塑性進行を調整するアクティブ化された表現型の範囲と炎症⁸の解像度を展示するこれらの細胞が可能です。一方、古典的活性化 (M1) マクロファージは炎症の進展に関与している、あるいはマクロファージ (M2) が解像度と組織修復^9,10に関連付けられています。

体は代謝ストレスを受けると白色脂肪組織が異常蓄積されます。拡張の脂肪組織を引き付ける、インスリン抵抗性、高血糖、最終的に 2 型糖尿病、インスリン抵抗性や高血糖^{11を促進するために通常の脂肪細胞機能を深く変更炎症細胞を保持 12}。並行して、白色脂肪組織改造によって解放の炎症性反応では古典的活性化 (M1) 脂肪組織マクロファージ (Atm)^13,14を浸透させた。この多細胞器官は肝⁴大動脈などの他の臓器の正常な機能を derails シグナルのカスケードを発揮します。

肝臓は、近くの調節不全ワット¹⁵発刺激への応答の適応代謝パワーハウスです。肝マクロファージまたは代謝の変化に対応した、クッパー細胞実質の両方を変換する炎症性サイトカインと非実質細胞表現型を分泌して組織リモデリングを促進します。肝臓への脂肪蓄積、炎症、過剰な細胞外マトリックス預金、壊死、肝臓障害の広い範囲に貢献して炎症性の侮辱は、非アルコール性脂肪性肝疾患^{に関連付けられている最終的な関数の損失次のよう16,17,18}。

並行して侵害されたワットと肝機能、太い動脈累積動脈壁内の脂質、体は慢性的な代謝ストレス¹⁹を受けます。動脈の脂質の蓄積は、活性化された血管内皮細胞によるケモカイン分泌および単球²⁰の後の採用をトリガーします。募集、一度単球増殖を区別するため、リポ蛋白を摂取、泡沫細胞になります。粥状動脈硬化を開始され、プロ炎症性活動による持続的な募集と組織マクロファージ脂質荷を積んだ。この動脈硬化の微小環境の中継細胞外と細胞内ストレス信号に屈して、これらマクロファージは、アポトーシスのシグナル伝達カスケードに従事しています。これらの泡の細胞が死ぬと、プラーク破裂、心筋梗塞や脳卒中につながる病巣の壊死性コアに満たされた脂質内容を貢献します。

総称して、マクロファージの表現型の多様性は一部ワット、肝臓、大動脈^8,21などの調節不全組織における炎症性変化による肥満を調整します。特性の採用し、組織マクロファージは、大食細胞の表現型の¹を操作する分子標的の可能性への洞察を提供すること。効果的に炎症を起こした組織の肥満によるマクロファージを特徴付ける、酵素消化による単一細胞懸濁液が得られます。このような分離のプロトコルは免疫細胞死を最小限に抑えながら、最適な細胞収率を提供する結合組織を十分に分解に効果的である必要があります。酵素の混合、組織とその構造のメイクアップの種類に依存します。大動脈など弾力性のある組織では、肝組織の解離を達成するためにワットと比較してより強力な酵素活性を必要があります。単一細胞懸濁液から組織マクロファージが明確に特徴するまたは、転写プロファイリングなどさらに下流解析の分離します。

ここで組織固有のプロトコルは説明を効果的に分離し、伝統的な食生活による肥満、住民組織マクロファージを特徴付けるコラゲナーゼ依存組織消化と多色フローサイトメトリーを使用します。アテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝と肝炎マウス モデル。同時白血球 - (CD45 や CD11b) やマクロファージに対する抗体と細胞表面のマーカーの染色 (F4/80) 特定の抗原は、しばしばマクロファージ人口²²を識別するために使用されます。蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは、高純度でこれらの特定の集団を並べ替えるために使用する強力な戦略です。並べ替えられた人口は、表現型特異的遺伝子プロファイル (量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応) などの下流の分子分析²³を使用して評価できます。標準フローサイトメトリー ・ フロー フローサイトメトリーを用いた細胞のソーティングは非常に異種細胞懸濁液内マクロファージを区別する強力なツールであるが、正常な出力を確保するため元のプロトコルを最適化する必要があります。本研究では効果的に分離し、実行可能なティッシュ特定の大食細胞を特徴付けるプロトコルを説明します。もっと重要なは、この研究は、しばしば発生を防ぐおよび/またはそれらを解決するプロアクティブとトラブルシューティング戦略だけでなく、技術的な問題に重要な洞察を提供します。

すべての実験的プロトコル (セクション 1、1.2、および 1.3) 承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ペンシルベニア州立大学で。

表 1: 組織の特定の灌流のバッファー調理法。

1. 組織分離と解離

1. ワットの分離と解離
   1. 表 1に従って組織固有のバッファーを準備し、前述の保存します。
   2. 次の試薬を準備します。
      1. 消化バッファーを準備するには、使用するまでワット解離バッファーと 4 ° C でストアの適切なボリュームを融解します。使用前にすぐに暖かい 37 ° c. にバッファーリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2% ウシ胎児血清 (FBS) を含む x 1 を準備すること、FACS バッファーを準備します。
   3. ワットの分離
      1. 充填中の二酸化炭素 (CO₂) マウスの商工会議所を安楽死させます。郭清のステージに続行する前に有効性を確認します。
      2. 簡単に徹底的に浸漬し、エタノールでコーティングまでの 70% エタノールを含むビーカーの euthanized マウスを浸しなさい。郭清ステージ上をマウスの腹側表面に配置、前面のマウスと後足は前足 21 G の針を使用して解剖基板に固定します。
      3. 尿道口の前方の腹部の皮膚を把握する中ポイント先端の鉗子を使用し、ニックネームは、把持の腹部皮膚に鋭い解剖はさみを使用します。
      4. 小切開の皮膚と腹膜の間にはさみの下刃を挿入し、胸郭、腹部から外側切開。
      5. そっとそのまま腹腔内を公開、横切開、腹膜を介して、いずれか透明な膜を折り返し、または腹部のワットを公開する組織を切除して皮膚を引き戻します。
      6. マンらの説明に従って perigonadal の脂肪パッドを収集します。²⁴
         1. 雄マウス perigonadal 脂肪パッドは、精巣上体や精巣に緩くバインドされます。まず精巣を検索し媒体鉗子、精巣上体頭の把握し、ポイントを軽く引いてください。
         2. 鋭い解剖はさみを使用して、(頭、胴、尾) は精巣上体や精巣の表面に沿って切断することによって各副睾丸脂肪パッドを切除します。
         3. 鉗子、脂肪パッドを引いて精巣上体構造直接バインドする結合組織を切削中。
         4. 鉗子を使用すると、精巣上体に近位の脂肪パッドの端をしっかりとつかんで、生殖腺からの脂肪パッドを慎重にはがします
         5. 雌マウスの perigonadal 脂肪パッドが緩く子宮体と子宮角への結合です。
         6. 中ポイント鉗子を使用して、perigonadal の脂肪質のティッシュを握り、軽く子宮体と子宮角から組織を引いてください。
         7. 子宮体と子宮角の鋭い解剖はさみを使ってに沿って切断することによってそれぞれの脂肪パッドを切除します。
      7. パッド、ペトリ皿の PBS で満たされ、組織の潤いを保つために氷の上を保つ脂肪を配置します。
   4. 単一細胞懸濁液にワットの解離
      1. ペトリ皿から余分な PBS を外し、小さな断片に腹部のワットをミンチにシングル エッジかみそりの刃を使用します。
      2. かみそりの刃の鋭い端、2 mL ワット解離バッファーを含むラベル 15 mL ポリプロピレン コレクション チューブにみじん切りにした腹部ワットに優しく擦る。
      3. 45 分の 37 ° C の低速連続回転の下でこの組織消化バッファー混合物を孵化させなさい。
      4. 円形の動きでシリンジのプランジャーのゴム製ピストンを移動しながら 50 mL のコレクション チューブに 70 μ m 携帯こし器を通って消化組織をフィルターし、フィルターを通して細胞懸濁液をふるい続けます。
      5. ピペット 2 mL のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 15 mL 管、優しく上下にピペットで移しなさい、単一細胞懸濁液とフィルターの洗浄に。
      6. 冷たい DMEM に追加で 2 回フィルターを洗浄し、単一細胞懸濁液を氷の場所します。
      7. 8 分の 4 ° C で 300 x g で細胞懸濁液を遠心します。
      8. 真空吸引装置を使用して慎重に (最初の) 浮動脂肪細胞を削除して、残りの上清。小球形にされた間質血管分数 (SVF) の邪魔をしないことを確認します。
      9. 1,000 μ L ピペット優しく再中断ペレット アンモニウム塩化カリウム (ACK) バッファーに製造元の指示に従って赤血球を溶解します。
      10. DMEM に上記細胞懸濁液を希釈し、8 分の 4 ° C で 300 g の細胞懸濁液を遠心分離します。
      11. 2% を含む冷 PBS のセルを再停止 FBS (FACS バッファー) Burker 商工会議所/検定のセルをカウントします。
      12. ラベルを 5 mL 丸底ポリスチレン管 (の基本的な流れの cytometry) 1 x 10 の⁶セルまたは (FACS) の全体細胞懸濁液を転送します。プロトコルを汚すフローサイトメトリー用セクション 2 に進みます。
2. 肝組織の分離と解離
   注: このプロトコルは、Smedsrød²⁵から適応されました。
   1. 表 1に従って組織固有のバッファーを準備し、前述の保存します。
   2. 次の試薬を準備します。
      1. 1 x 血流バッファー (PB) 960 mL 超純水 H₂o. 前暖かいシリンジに PBC の 40 mL の希釈でいっぱい 37 ° C で PB の 50 mL の灌流を開始する直前の準備します。存在空気の泡を排除します。
         1. 空気の泡をなくすため、leur ロック ヒントが上向きシリンジを反転します。タップまたは気泡が頂上に注射器まで注射器をフリックします。空気を抜くためのプランジャーを軽く押します
      2. 476 mM CaCl₂ソリューションの 0.5 mL を希釈して消化バッファーを準備49.5 mL 1 x 血流バッファーにします。4.76 mM CaCl₂ -PB ソリューションに IV 型コラゲナーゼの 3600U を追加します。前灌流を開始する直前に 37 ° C で消化バッファーの 50 mL の満たされた注射器を温めます。1.2.2.1.1 の手順で説明するよう、現在空気の泡を排除します。
      3. 250 mL 1 x 血流バッファーで 2.5 g ウシ血清アルブミン (BSA) を溶解することにより保全バッファー (PRB) を準備します。4 ° C で保存または使用するまで氷の上を保ちます。
      4. 1 × PBS と 2 %fbs で FACS バッファーを準備します。
   3. 肝組織分離
      1. CO₂窒息によってマウスを安楽死させる、毛皮の腹腔内の臓器の汚染防止を 70% エタノールでマウスを飽和させます。
      2. 21 G の針を使用して解剖基板に足の位置、ポリスチレンをマウスの腹側発泡ボードを解剖と前部と後部のマウスを保護します。
      3. 胸壁と腹腔内に公開するには、媒体のポイント先端の鉗子を用いた尿道口近くの腹部の皮膚を把握します。鋭い解剖はさみを使用して把持の腹部の皮膚に小さな切開を作成します。
      4. 小切開の皮膚と腹膜の間にはさみの下刃を挿入し、あごを脚の付け根から横切開。
      5. そっとそのまま腹腔と胸壁を公開側腹膜切開、膜を切除し、皮膚を引き戻します。
      6. 胸骨を持ち上げると慎重に横隔膜を切開、下大静脈 (IVC) を邪魔しないようにしてください。消化器官を側に移動し、#22. IVC を探します。Suprahepatic 局在の灌流を維持するために下大静脈をクランプするのに止血鉗子を使用します。
         注: 内臓の白色脂肪組織の過剰な蓄積はしばしば下大静脈をマスクできます。この船をよりよく視覚化するには、下大静脈の横にある脂肪組織の小さな領域を切除することができます。しなやかな脂肪組織内切開のウィンドウは、穿刺用容器を公開する下大静脈に配置できます。
      7. 23 G 血のコレクションおよび輸液セットに予め温めておいた PB でいっぱい注射器を取り付けます。プランジャーのチューブと針 PB で満ちているまで軽く押します。
      8. #22. IVC のレベルに平行 23 G 針を挿入します。4 cm 止血クランプを使ってその場で針を固定します。
         注: 食飼育マウスの下大静脈を優先すると、下大静脈が良いこと、肝胆のカニュレーション可視化し、脂肪で満たされた空洞内 cannulated。
      9. 灌流を開始するプランジャーの慎重に押し、色は肝臓から急速にフラッシュされます (右葉最初) 針が容器に適切に配置されている場合。葉の拡大、針が正しく #22. 下大静脈に挿入されて場合表示されますも。
      10. 速やかに肝臓を自由に通過する PB を許可する門脈をカットします。
      11. 肝臓を灌流、血液が表示されなくなるまでです。前面の指と親指の血流を容易にする肝葉を機会に優しくマッサージします。
          注: 鋸歯状にされた非鈍い刃物を使用して、組織の損傷を防ぐために肝臓を処理することが重要です。
      12. PB の 5 mL 注射器内に残ります、注射器に予め温めておいた解離バッファーでいっぱいに変更されます。この時間の間にセキュリティで保護された針の位置が不可でした。
          メモ: 拡大肝 1.5 g を大幅に上回る成功の肝解離を保証するために予め温めておいた消化バッファーの大きいボリュームに灌流する必要があります。
      13. 完全に消化するまで肝臓を灌流します。血流を促進する肝葉を優しくマッサージします。
          注: 政教分離グリソン鞘の柔組織からは正常に消化肝臓の観測可能なオブジェクトです。これを評価するために、鉗子のペアの鈍端を使用して、左葉外側を軽く押して。印象、表面に出現し、鉗子を取り外したら、インデントはゆっくりと記入してください。
      14. #22. IVC から針を抜きます。Suprahepatic 下大静脈をクランプ止血鉗子を削除しないでください。
      15. 慎重に靭帯解剖はさみ短いまっすぐな刃を使用しての接続を切断することによって全体の肝臓を切除し、胆嚢を削除します。
      16. 10 cm のシャーレに全体の肝細胞を解放するために冷たい保全バッファーと 4 ^оC までで店の準備 10 mL を含みます。
   4. 肝細胞解離
      1. 10 mL を含んでいる 10 cm 皿に肝臓を転送冷たい DMEM。
      2. 下大静脈は歯の鉗子を使用して摘出した肝臓に接続切断の suprahepatic をグリップします。各葉になでるの急速な動きを適用してから、グリソン鞘の細胞を解放するのに中ポイント鉗子を使用します。
      3. 50 mL のコレクション チューブに接続されている 70 μ m セル ストレーナーを飽和 DMEM を通過します。
      4. ピペット 10 mL 冷たい DMEM 10 cm シャーレと 1.2.4.3 に 1.2.4.1 メディア飽和は発生しなくなるまで、ステップを繰り返します。細胞懸濁液または 4 ° C で氷の上の場所
      5. 優しくコレクション チューブを反転による細胞懸濁液を混合し、4 ° C で 2 分間 54 × g で遠心分離
      6. きれいな 50 mL のコレクション チューブに上清を収集します。4 ° C で 2 分間 54 x g で細胞懸濁液を遠心分離します。
      7. 手順 1.2.4.6 1.2.4.8 の手順に進む前に追加で 2 回。
      8. クリーン 50 mL コレクション チューブに上清を転送し、4 ° C で 10 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心分離
      9. 再 FACS バッファーに非実質細胞ペレットを中断し、Burker 商工会議所/検定でそれらを数えます。
      10. ラベル 5 mL 丸底ポリスチレン管 (の基本的な流れの cytometry) 1 x 10 の⁶セルまたは 15 x 10⁶ - 20 x 10⁶セル (FACS) に転送します。プロトコルを汚すフローサイトメトリー用セクション 2 に進みます。
3. 大動脈隔離と解離
   注: このプロトコルは、肉屋から適応されました。et al.²⁶
   1. テーブル 1で提供されるレシピに基づいて組織固有のバッファーを準備し、前述の保存します。
   2. 次の試薬を準備します。
      1. 消化バッファーを準備するには、使用するまでワット解離バッファーと 4 ° C でストアの適切なボリュームを融解します。使用前にすぐに暖かい 37 ° c. にバッファー
      2. 200 U/mL の濃度で 1 × PBS でナトリウム塩ヘパリンを溶解することにより 10 倍、ヘパリン溶液を準備します。ヘパリン溶液 × 1 を準備する 1 × PBS でヘパリン原液 x 10 を希釈します。使用するまで 10 倍と 4 ° C でヘパリン溶液 x 1 を格納します。
      3. 2% を含む 1x PBS で FACS バッファーを準備政府短期証券。
   3. 大動脈解離
      1. 炭酸ガス充填室、70% エタノールでリンスでマウスを安楽死させます。
      2. 郭清ステージ上をマウスの腹側に配置、前面マウスと後足は前足を広める、21 G の針を使用して解剖基板に固定します。
      3. マウスを使い果たせば、直後後心臓穿刺を行います。必要に応じて 1.3.3.9 に 1.3.3.4 の手順を参照してください。
      4. 胸骨の下端の剣状突起を検索します。
      5. これを行うには、動物の首の幅に沿って指の中間点を配置します。軟骨の拡張子が感じられるまで胸骨尾側に首から腹側正中線に沿ってトレースします。
      6. 軟骨拡張機能を把握する中ポイント鉗子を使用し、必要に応じて髪または領域の皮膚のパッチを除去することによって、剣状突起の位置をマークします。
      7. 部分的に 20-30 ° の角度で剣状突起下 26 G 針を挿入します。
      8. ゆっくり注射器に、プランジャーをゆっくり引き出すことによって否定的な圧力を適用し、血流まで空洞にさらに針を挿入します。
      9. 血流が停止した場合ゆっくりと針を回転またはわずかに移動し、アウトします。
      10. 尿道の前方の腹部の皮膚のホールドをつかむための鉗子のペア使用を開くと、あごに脚の付け根から腹膜を介して腹側正中線に沿ってカットする鋭い解剖はさみのペアを使用.
      11. 腹部臓器との指で胸郭を公開する皮膚を引き戻すか、鈍い鉗子は優しく側に腹部臓器を移動します。
      12. 剣状突起のホールドをつかむ鉗子の使用は、胸骨を持ち上げて横隔膜を切開します。
      13. 両側に横リブをカット、解剖はさみを使用します。胸骨をつかんで、胸郭を上向きに反転、接続ベースでカットします。基になる胸部臓器を公開する胸郭を削除します。
      14. 心臓の左心室 (LV) に 1-2 mL の溶液を注入することで、ヘパリン溶液 × 1 でいっぱい 10 mL のシリンジに接続されている 26 g 注射針と大動脈を灌流します。
          注: 必ず少し圧力がそのまま動脈硬化大動脈病変を確認すると遅い速度でを灌流してください。
      15. 胸腺、肺および結合組織を切除します。必要に応じて手順 1.3.3.16 と 1.3.3.17 を参照してください。
          1. 中心前方検索白双裂 (または蝶の形) オルガンとしっかりとつかむ鉗子による胸腺のホールド。両葉をキャビティから引き上げて、基部にハサミでカットします。
          2. 肺を取り外す、生検鉗子で肺の葉をピンチ、胸腔内から組織を引いて、ベースでカットします。各残りの葉に繰り返します。
      16. 解剖顕微鏡とマイクロ分析ツール、および収集、昇順、降順、胸部、腹部大動脈、腕頭動脈、左総頚動脈、左鎖骨下動脈)、(を含む大動脈アーチを使用します。
          1. 心臓の左心室に大動脈を探します。
          2. 湾曲した 0.07 × 0.04 mm チップのペアで鉗子はそっと左心室から出て上行大動脈の部分を把握します。
             注: は、黄色を帯びた周囲の脂肪組織と比較して、大動脈はヘパリン溶液を十分にフラッシュされたとき LV から明るい白い容器になります。
             1. 大動脈は、心臓の血流によって正しくフラッシュされなかった場合、は、大動脈の空洞に接続されたままに大動脈をもう一度フラッシュしています。これを行うには、心臓大動脈ジャンクション付近をカット、心を取り除き、腹部大動脈のローエンドを水平方向に切ってください。上行大動脈の開口部に 26 G 針を挿入し、優しくヘパリン溶液 x 1 大動脈をフラッシュします。
             2. 良い脂肪組織および埋め込まれた大動脈の間で区別する上行大動脈を慎重に引っ張って。
             3. まだ、上行大動脈に引き上げて、昇順大動脈および大動脈弓をカプセル化する脂肪をオフに閉じた春解剖はさみの先端を使用します。これを行うには、接続の脂肪を離れて引き裂く閉じたシザーの刃の先端で脂肪質のティッシュをストロークします。
                注: 昇順大動脈およびアーチを明確に視覚化できることまでを切断することによって任意の脂肪質のティッシュの切除を控えます。これは、大動脈を切断を防ぐためです。
             4. 昇順大動脈およびアーチは、サラウンドの脂肪質のティッシュから明確に線引きすることができる場合、は、解剖はさみばねを使用して余分な脂肪を切除します。
             5. 優しく、鉗子で大動脈弓のホールドをつかみます。脂肪のスリーブの右側で行います春シザーの先端、腹部大動脈の尾の端に降順、胸部、腹部の大動脈の長さに沿って脂肪でストロークを使用しています。
             6. 脂肪を離れて引き裂くとき大動脈に沿って把握し続けます。大動脈の損傷を防ぐために優しく行うようにしてください。
             7. 脂肪が大動脈の後ろに今すぐ表示されるように、顕微鏡に向かって上向きの大動脈をゆっくり引き抜きます。
             8. にべもなく抜本的な動きを使用して深刻な下行大動脈の前方終わり近く脂肪大動脈インターフェイス間閉じたシザー ブレード大動脈の表面に脂肪質のティッシュの添付ファイルを挿入します。
                注: 徹底的に余分な脂肪を削除して、大動脈がまだ空洞内にある組織の接続を推奨します。
             9. 心を消費税し、横置き腹部大動脈の尾側端でカットします。全大動脈を削除します。
             10. 35 mm ディッシュの大動脈を置き、2 つの 21 ゲージ針を使用して大動脈に余分な脂肪をいじめます。氷の上の 1.7 mL 遠心チューブに摘出した大動脈を配置します。
   4. 単一細胞懸濁液に、大動脈の解離
      1. ピペット 0.2 mL 大動脈解離バッファー、大動脈を含むチューブ。テーパ管末春シザー ブレードを挿入し、急速に酵素消化を容易にする大動脈をミンチします。
      2. 組織の溶液を 15 mL コレクション チューブ ・ ピペット 1.8 mL 大動脈解離のバッファー容量 2 ml に転送します。
         注: 組織懸濁液の簡単な転送は、標準的な 1,000 μ L ピペット チップのテーパー端から 1 cm をカットします。短縮のヒントを使用すると、マイクロ ピペットの懸濁液を転送します。
      3. 220 rpm (0.514 x g) で揺れ、37 ° C で 55 分の大動脈解離バッファーにみじん切りにした大動脈を孵化させなさい。
      4. 50 μ m の細胞のストレーナを通過して懸濁液 15 mL ポリプロピレン コレクション チューブに。シリンジのプランジャーのゴム製ピストンを使用すると、フィルター処理を容易にします。
      5. 1 mL FACS バッファーで 15 mL コレクション チューブを洗浄、懸濁液を収集し、セル ストレーナを通過します。
      6. 50 μ m の細胞のストレーナーを 1 mL FACS バッファーを追加で 2 回洗います。
      7. 4 ° C で 5 分間 300 × g で遠心分離によって細胞をペレットします。再冷たい FACS バッファー内セルを中断します。Burker 商工会議所/検定のセルをカウントします。
      8. 1 x 10⁶ (基本的な流れの cytometry) セルまたは (FACS) の全体細胞懸濁液をラベル付き 5 mL 丸底のポリスチレン管に転送します。プロトコルを汚すフローサイトメトリー用セクション 2 に進みます。

2. フローサイトメトリーおよび FACS 染色を流れ

表 2: タグ付き差別組織マクロファージの特異抗体の fluorophore の一覧。

1. 収集し、次の項目を準備: FACS バッファー 5 mL 丸底ポリスチレン チューブ、抗マウス CD16/32 Fc 受容体抗体・蛍光体共役または一次抗体、二次抗体の蛍光標識 (場合を非抱合型へリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 必要)、1 は。
   注: 大量の細胞を染色抗体濃度は最も重要な細胞の数ではなくです。たとえば、染色 10 × 10⁶細胞染色バッファー量や抗体濃度は 1.0 × 10 を汚すかのよう同じをする必要がある場合、⁶は 100 μ L バッファーのボリュームでセルします。1.0 x 10 の汚損のため⁸細胞、抗体量を 5 倍に増やすことをお勧めします。
2. 5 分 (4 ° C) 751 × g で遠心分離によって細胞のペレット、必要に応じて各 FACS 管に追加冷たい FACS バッファーを追加します。清次遠心分離を吸い出しなさい。
3. 製造元の指示に従ってすべてのサンプルに抗体抗マウス CD16/CD32 Fc 受容体を追加します。氷または 4 ° C で 15 分間インキュベートします。
4. 蛍光標識一次抗体カクテル直接 Fc 受容体に細胞懸濁液とインキュベート ブロッキング抗体を含む試料 4 ° C、30 分で保護蛍光色素標識された抗体の漂白を最小限に光からを追加します。
   1. ステップ 2.4 の完了後、次の手順に従って、非標識一次抗体が使用されたイベント。
   2. 洗浄一次抗体染色し、5 分間 (4 ° C) 751 × g で遠心分離によるサンプル。
   3. 上清をデカントで削除し、再 100 μ L FACS バッファー内のペレットを中断します。
   4. すべての必要な試料に共役二次抗体を追加し、4 ° C で 30 分間インキュベート2.5 の手順に進みます。
5. 次抗体の孵化、2 mL の氷冷 FACS バッファーを追加し、5 分間 (4 ° C) 751 x g で細胞のペレットします。上清をデカントし、ペレットを邪魔しないようにしてください。
6. 細胞を優しくミックスに FACS バッファーの 200-400 μ L で再停止し、標準フロー フローサイトメトリー解析や細胞選別まで 4 ° C で暗闇の中でこれを維持します。
7. 陽性細胞の短期固定、2.10 に 2.8 の手順に進みます。標準フローサイトメトリー用固定を使用します。
8. 4 ° C で 15-30 分の 0.5 mL 2-4% パラホルムアルデヒド (PFA) のセルを中断直後ステップ 2.5 再
   注意: 注意: PFA は、発ガン性や毒性の効果で知られている刺激。PFA を使用する場合は、細心の注意と処理します。必ず適切な個人用保護具を使用し、換気してください。
9. 次の固定は 2 mL FACS バッファーをすべてのサンプルに追加することによって細胞を洗って 5 分削除清次遠心分離のための 4 ° C で 751 × g で遠心分離機します。
10. 氷冷 FACS バッファーと 4 ° C でストアの 200 μ L に固定細胞を再懸濁しますストア修正プログラム細胞 4 ° C で最大 1 週間、理想的には蛍光を最小限に抑えるために 48 時間以内の流れ cytometry 買収を実行します。
11. Basu et alによって記述された蛍光活性化細胞のソートを実行または流れの cytometer 製造元の指示に従って流れ cytometry データを取得します。²³

アポリポ蛋白 E 欠損 (アポ島) C57BL/6 (BL6) マウス 18 週間、1 x 10 の⁴ - 2 × 10⁴ CD45 (HCHFD または HCD) 高脂肪高コレステロール食で維持を使用する場合⁺F4/80⁺ 2 つのサンプルは、大動脈マクロファージが分離することができますプール。HFHCD 給電アポ KO マウスの胃から肝臓生産 (これは、使用可能な並べ替え時間異なります) 5 x 10⁵並べ替えクッパー細胞より大きかった。うんざりした野生型 (WT) c57bl/6 マウスの高脂肪食 (HFD) を使用して、間質血管の分画 (SVF) 5 x 10⁵ 1 x 10⁶居住者の脂肪組織マクロファージ (Atm) を並べ替えることができます。指定された組織から並べ替えることができますマクロファージの述べられた合計数は量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を用いた遺伝子発現解析を実行するため十分なだった、大動脈など、マクロファージの人口のより少ない数字が回復の組織は、これらの解析で必要な RNA を隔離する場合共同沈殿 (たとえばグリコーゲン) と一晩沈殿物を使用することをお勧めします。

ここでは、基本的なを使用してマクロファージの表現型に及ぼす食事誘発代謝異常フロー フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分別 (FACS) とダウン ストリーム ポスト並べ替え分析が表示されます。これらの調査結果は、マウスでは管内大動脈 (図 1 b) などの影響を受けたティッシュの古典的活性化 (M1) マクロファージの HFD または HFHCD 増加展示浸透以前に発行された観察を裏付けます。フローサイトメトリー、FACS、および遺伝子発現解析の活用 (量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) ロン受容体チロシンのキナーゼ - CD45 を表現するための支配的な表現型を経由⁺ F4/80⁺マクロファージに由来します。食事与えられたマウスから分離した組織が観察されました。ロン受容体発現大動脈マクロファージ炎症表現型を示したが (図 1とD) HFHCD 給電マウスで減少した.並べ替えられたロン受容体を発現したマクロファージ由来消化大動脈実証増加アルギナーゼ (図 1E) 確立された M2 マクロファージ マーカー 1 (Arg1) 遺伝子発現しています。CD45 として特徴付けられたプロ炎症性マクロファージ⁺ F4/80⁺ CD11c⁺ HFHCD 給電マウス (図 1 bとD) から分離された大動脈に増加しました。ロン受容体発現集団 (図 2 a) の支配的な表現型を解明さらに肝臓居住者マクロファージを特徴付けます。CD11c + プロ炎症性マクロファージ集団は、Arg1 とロン (図 2 b) などの抗炎症 (M2) 表現型に強く関連付けられている遺伝子発現減少を示した。同様の傾向は、消化の白色脂肪組織 (図 3) から分離されたマクロファージ集団で観察されました。マクロファージ炎症性のシグネチャを持つ人口は、ロンの受容体 (図 3) の表面発現の低下を示した。アプローチ、基本的なフローサイトメトリー、FACS を組み合わせ、さらにロン受容体を活性化マクロファージ³²(M2) 代替のレギュレータとして検証する決定的なデータで起因しました。抗炎症 (M2) 表現に向かってこのようなバイアスは、開発と肥満、動脈硬化、肝炎の³¹の進行で保護の役割を果たすことに示されています。

図 1:解離大動脈由来マクロファージの特性が、HCD の 18 週間維持アポ KO マウスから削除します。(A) セルされた CD45 のゲート最初⁺白血球、細胞残屑を除きます。(B) CD45 マクロファージと推定される二重肯定的な集団を描くため F4/80 と一緒に染色します。CD11c の割合を示すために使用した追加ゲート⁺CD45⁺F4/80⁺ (M1) と (C) ロン⁺CD45⁺F4/80⁺ (潜在的な m 2) 大動脈由来のマウスにおけるマクロファージがいずれかの供給、通常の食事や、18 週間高コレステロール食。(D) CD11c の割合を増加した⁺CD45⁺F4/80⁺ (M1) ロン⁺CD45⁺F4/80⁺ (潜在的な m 2) の減少割合と同様に大食細胞、マクロファージを認めた大動脈通常食事飼料飼育マウスに比べて HCD を飼育マウスから派生します。(E) の遺伝子発現解析並べ替えられたロン⁺CD45⁺F4/80⁺マクロファージは、アルギナーゼ活性の発現の増加を示した私 (よく知られているマウス M2 マーカー)。< 0.05 を有意と考えられた学生の t テスト分析統計解析ソフトウェアを使用して実行、± SEM. P を意味として表されるを使用して得られた値 (* P < 0.05、* * * P < 0.001)。図は、ゆうらから変更されています。(2016)³¹.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 18 週間、HCD の維持アポ KO マウスから解剖消化肝臓からソート クッパー細胞集団の遺伝子転写プロファイリングします。(A) 特性およびクッパー細胞集団をソート用の一般的なゲート方式。(B) の並べ替えられたロン (Ron⁺) を表現して非発現 (Ron^-) CD45 遺伝子発現解析⁺F4/80⁺定量的 RT-PCR によるマクロファージ。学生の t テスト分析を行った統計ソフトウェアを使用して、値が ± 0.05 < は、統計的に有意と考えられていた SEM. P を意味として表された (* P < 0.05、* * * P < 0.001)。図は、ゆうらから変更されています。(2016)³¹.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3:特性の Atm WT BL6 マウスから解剖白色脂肪組織より分離した飼育 18 週間、HFD 。(A) 一般的なゲート方式の特性および脂肪組織をソート用派生マクロファージ集団 (B) 割合のロン + CD45 の細胞⁺F4/80⁺CD11c^-と CD45⁺F4/80⁺CD11c⁺ワットからソート マクロファージ集団。図は、ゆうらから変更されています。(2016)³¹.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

病気の進行の分子メカニズムを理解するアテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝、肝炎などの併存を模倣し、タイプ 2 の糖尿病の食事誘発代謝性疾患モデルが採用されます。コラゲナーゼの消化力依存は細胞外マトリックス (ECM)^16,27から細胞を解放するために組織を分離するによく使用されます。コラゲナーゼなどの酵素は、隣接する細胞の構造的なサポートを提供するコラーゲンを混乱させます。組織の構造指示組織マトリックス剛性 (変形抵抗)、成功した ECM 混乱²⁸を確保する上で最も効率的な粗コラゲナーゼ製品です。「ソフト ・ マトリックス」で構成されているワットはしばしば同時にセル表面のインスリン受容体²⁹の整合性を維持しながら脂肪細胞と免疫細胞を解放するために II 型コラゲナーゼで消化されます。大動脈の線維成分のマイクロ アーキテクチャは、「硬いマトリックス」、その他酵素との組み合わせで使用する (最も高いコラゲナーゼ活性のある) XI 型コラゲナーゼと効果的な大動脈の消化力に貢献します。大動脈とは異なり、肝臓消化はマトリックスを混乱させると実行可能な実質および非実質細胞³⁰を解放する弱い酵素活性、タイプ IV コラゲナーゼと、コラゲナーゼを使用します。慢性的な炎症を起こした組織は、適切な酵素の消化力を防ぐことができる背景は多くの場合改造を受ける C57BL6 のマウス野生型の食事供給またはアポリポ蛋白 E 欠損 (アポ島) から派生します。このセクションは、最小化および/または不適切な組織解離と低細胞回復の可能性を排除するための戦略について説明します。

肥満、動脈硬化症、および/または非アルコール性脂肪性肝疾患を模倣する食事供給のモデルマウス由来組織の共通の特徴は、異常組織の改造です。白色脂肪組織、大動脈および肝臓、コラーゲンなどの繊維成分の過剰沈着に ECM の構成は変更されます。野生型 C57BL6 マウス 18 週間高脂肪の食事を維持拡張白色脂肪組織などの組織固有の異常が発生して脂肪肝 (単純な脂肪肝) を拡大します。しばしばこれらの代謝機能は組織解離過程中に克服するために厄介な障害物です。その一方より悪化させた表現型をミラー化する他の食事誘発性モデルで組織の大規模な改造問題を提起できる組織消化中。アポ KO マウスを供給 HFHCD が頻繁に使用されるモデル アテローム性動脈硬化、肝炎。高度な肝炎に関連付けられている共通の特徴は、肝臓 (または線維症) の ECM の過度の沈着です。線維肝酵素組織解離中にかなり問題があることが示されているし、しばしば低細胞収量³¹が生成されます。細胞収率を高めるためには、偏りなく消化力のプロトコルに従う必要です。消化バッファーによる血液灌流が肝臓の細胞外マトリックスとコラゲナーゼ溶液との接触を最大化正常な肝臓をみじん切り、解離を達成するために、消化バッファーに浸漬することができます、・したがってこの方法は、強くお勧めします。さらに、20-30 mL の消化バッファーはしばしば; 正常な肝臓の正常な解離の十分なボリュームただし、肝臓の肥大や線維化を開発マウス モデルに関しては、細胞死を最小限に抑えながら適切な消化力を確保するための消化バッファーの 50 mL による血液灌流を好んだ。1.5 g を大幅に超えることの重みと肝臓、消化バッファーのボリュームを増やすことが正常な消化を保証する推奨されます。

テーブル 3: トラブルシューティング失敗した組織解離します。フローサイトメトリーによる細胞選別フローまたは FACS が細胞集団を隔離するための強力な技術高純度が必要であります。ときにセルを並べ替えることにより細胞を浄化、細胞の高も高純度の並べ替えを実現する適切な並べ替え方法を使用して必要があります。このセクションでマルチ蛍光体を改善する方法は、フローサイトメトリーを用いた細胞組織食飼育マウスから派生した居住者のマクロファージは、説明の並べ替えをフローします。異なる組織常駐マクロファージ分離表面マーカーの選択は重要なステップです。マクロファージに由来するワット、大動脈および肝臓がしばしば区別、CD45 を使用して⁺、CD11b⁺、F4/80⁺戦略をゲートします。追加のフロー フローサイト メーター パネルは、常在型マクロファージ組織を識別するために使用できます。これらのパネルは、マクロファージ特定の糖蛋白質 (CD64、CD68、および CD14)、主要組織適合性複合体 (動的) の発現を検出する抗体とアポトーシス細胞のチロシンのキナーゼ受容体 (MerTK) の^{32, 33}. 特定の大食細胞の表現型は M2 の選択的な発現の調査によって、線引きできます (CD163、CD209、および CD206) または M1 マーカー (CD38、CD40、CD80、CD86)^34,35。自動蛍光脂質荷を積んだ大食細胞によって生成されるは、集団をゲーティングといくつかの問題を提示できます。(PE、PE/Cy5 PE/Cy7 など) 黄緑色のレーザーで励起される蛍光色素が付いた抗体を使用してまたは (など APC の, APC Cy7) 赤色レーザー自動蛍光よりも著しく明るいは、放出される蛍光の結果、このように改善することができます。結果³⁶。このような高い染色インデックスと潜在的な発光スペクトルの重複と共役 fluorophore を選択、適切なコントロールを含めることが重要です。単一染色 (SS) コントロールおよびアイソタイプ コントロールを含めることは、正/負の集団の描写とそれぞれ一次抗体によって引き起こされる非固有バック グラウンド信号の測定ゲートの境界を識別するとき³⁷。 セルが不足している状況の SS およびアイソタイプ コントロールの補償粒子を使用してお勧めします。補償粒子は、通常生物学的コントロールよりも明るい信号を発する、また蛍光バック グラウンドで以下の差異があります。さらに、マイナス 1 つ (FMO) コントロールの蛍光は、ゲートの境界の輪郭を描くに最適です。FMO コントロールを含めるには、その特定の蛍光チャネルの螢光色素付き抗体が除外された³⁸最大蛍光染色のサブセットに対する期待はチャンネルにで明らかにしました。単一の染色補正粒子コントロールに加えて、我々 の経験で無染色の生物学的比較制御をより正確な正/負の境界を設定するため記載します。

細胞残渣およびゲートの戦略で細胞凝集塊を除く自己蛍光を最小限に抑えるために使用される追加アプローチしています。実行可能な細胞集団から細胞の残骸を区別するには、前方散乱 (FSC) と側方散乱 (SSC) を使用して、最も一般的なゲート戦略です。記事並べ替え解析に使用する、DNA ・ RNA の抽出の高い生存率を必要とする隔離されたセルの固定および/または透過操作性汚れを使用しないことをお勧めします。ホルムアルデヒド固定細胞の核酸-タンパク質架橋による核酸の整合性を妥協でき、分離効率、検出、および正確な数量が制限されます。細胞凝集塊の前に述べたようにことはできません生成された自動蛍光信号に貢献するだけがまた「偶然を中止」.一種の高純度を維持するためにこのようなアクションが発生しますが、並べ替えられた細胞収量を減らす場合はあまりにも頻繁に。並べ替えバッファー (FACS) 細胞染色中に DNAse と MgCl₂を添加した細胞凝集を最小化できます。それは酵素の活性を阻害すると、DNAse との組み合わせで EDTA を使用しないことをお勧めします。並べ替えの前に 70 μ m セル ストレーナーを介して単一細胞懸濁液をフィルタ リングも集計から細胞を解放できます。集計を抑える細胞懸濁液が最小限の量 0.4 mL の mL あたり 500 万セルの濃度にする必要があります注意してくださいすることが不可欠です。脂質荷を積んだ組織から分離した細胞は集計になりやすい傾向があり、この結果は偶然、中止され、低い収量。サンプルをさらに希釈する集計が解決しない場合は、それをお勧めします。並べ替えられた大食細胞は、細胞回復を最大化する胎児の牛の豊富な媒体を含んでいるポリプロピレンの丸底コレクション チューブで収集できます。濃度は、最終的に各ソートされた液滴と希釈になりますので、初期の高 FBS 濃度は細胞回復を保証します。DNA または RNA の解析に使用する細胞を採取、RNAse の混入を防ぐために適切な抽出試薬を (例えばTriZol) に直接セルを並べ替えることができます。高ボリュームをソートするには、セルを並べ替え最初政府短期証券のより低い集中を添加した培地にお勧めします。すぐに次の並べ替え、セル、ペレット、DNA ・ RNA 抽出分離します。遺伝子発現変化の分離の遺伝物質のプロファイルをすることができます。Tnf α など IL1 β、il-6、IL 12, 1 L 23、肝腎、Nos2、MCP1 プロ炎症性遺伝子 (CCL2) 出展古典的活性化 (M1) 表現型³⁹マクロファージで亢進が多い。その一方で、表現型 (M2) または活性化マクロファージは頻繁に Chi3l3 をコードする遺伝子の誘導によりマーク (Ym1)、Fizz1、アルギナーゼ 1、CD206、CD163、CD209 1 L-10、および TGFβ^34,40。最近、CD38、Fpr2 と Gpr18 は、M1 固有遺伝子 C-myc と M2 固有遺伝子³⁴として Egr2 として検証されています。

マルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた細胞選別高純度でマクロファージを隔離するための貴重なツールですが、この方法は高価なことができます。FACS による並べ替えの強力な利点に加えて、細胞選別機メンテナンス用試薬の高費用のセルソーターを操縦できる運用担当者に依存しています。代替的なアプローチは、高価な流れフローサイトメトリーによる細胞選別の代わりに使用できます。磁気活性化細胞 (MAC) を並べ替えまたは密度勾配遠心法が含まれます。並べ替え方法を述べた最初の代替セル包含磁気および/または血または固体ティッシュ⁴¹から興味のセルを分離するマイクロ ビーズ列分離キット。アプローチを並べ替える 2 番目のセルは、密度と遠心力に基づく異種細胞懸濁液を分離します。残念ながら、密度を介した遠心分離は大動脈またはワットに派生した単一細胞懸濁液からの大食細胞を分離するため実用的ではありません。多くの場合、差動遠心分離から得られる製品が汚染されているし、低収量します。その結果、最初酵素の消化力の後いくつかのセルの結果 (大動脈またはワット) などより小さい組織は差動遠心分離のための理想的な候補者ではありません。一方、解離肝臓由来細胞懸濁液は、記事並べ替え実験と文化の刺激、qPCR、または西部のしみが付く分析などの解析で使用することができます並べ替えられた大食細胞の適切な数を作り出すことができます。これらの代替アプローチは、FACS、クリーナーのソートを可能にする前に人口を豊かにも使用できます。注記のうち、組織マクロファージは、ワット、肝臓、大動脈全体のセル人口の小さい割合を構成します。FACS 並べ替えする前に細胞の濃縮がそれほど頻繁にセルの人口を隔離するときに使用されるアプローチをされています。小集団に分離するが一般的である 1 つの問題は、大規模なセル番号は、その後の分析のための十分なセルを取得する処理が必要です。濃縮または事前の並べ替えは、このような問題を解決する使用できます。このメソッドは、正と負の選択をセルのより簡潔な人口を得ることでエイズが、FACS 並べ替え肝臓などの密なティッシュ ソースに永続的なプロセスをすることができます、それはまた時間の保全をことができます。

炎症の生物学の最近の進歩は、慢性的な炎症を調節するこれらの免疫細胞の複雑な役割の理解を促進するマクロファージの多様性の表現型および機能特性の重要性を強調表示します。簡単に言えば、この包括的なプロトコルは、マクロファージ組織 3 つの特徴から確立された食事誘発性肥満および炎症モデルで検討組織を特徴づけるに多次元的なアプローチを提供します。さらに重要なこの議定書、難易度を考慮ときれいな隔離措置単一細胞懸濁液調節不全からワット、大動脈のプラークや脂肪肝などの組織の炎症します。プロトコルでは、cytometry 流れと組織マクロファージ、肥満の主調整装置を特徴付けるための革新的な次元で FACS 並べ替えツールを適用する研究者をことができます。マクロファージの動態の詳細な特性評価は、単球の炎症を起こした組織に人身売買に洞察力を提供でき、ソートされたマクロファージに対する実験的アプローチの多くを継続的な機械論的評価を可能にします。マクロファージの個体群の更なる特性は、健康と病気におけるマクロファージの不均一性を規制する生物的基盤に重要な洞察力を提供できます。

著者は明らかに利害の衝突があります。

ペンシルベニア州立大学ミレニアム科学複雑な流れの Cytometry 中核施設に感謝したいと思います。