JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يسمح هذا البروتوكول باحث لعزل وتوصيف المقيم في الأنسجة الضامة في مختلف الأنسجة الملتهبة المستخرجة من نماذج الناجمة عن النظام الغذائي للاضطرابات الأيضية السمة المميزة.

Abstract

السمنة تعزز دولة التهابات مزمنة التي هي إلى حد كبير بوساطة المقيم في الأنسجة الضامة، فضلا عن الوحيدات المستمدة الضامة. السمنة الناجمة عن النظام الغذائي (ديو) نموذج قيمة في دراسة دور تغاير سنخية؛ بلعم كافية العزلة غير صعبة للحصول من الأنسجة الملتهبة. في هذا البروتوكول، نحن الخطوط العريضة للخطوات العزلة والمبادئ التوجيهية اللازمة استكشاف الأخطاء وإصلاحها المستمدة من دراساتنا للحصول على عدد مناسب من مقيم في الأنسجة الضامة من الفئران بعد 18 أسبوعا من الدهون (HFD) أو (الدهون عالية/الكوليسترول العالية التدخل الغذائي هفهكد). ويركز هذا البروتوكول على أنسجة مميزة ثلاث دراسة السمنة وتصلب الشرايين، بما في ذلك الكبد، والأنسجة الدهنية البيضاء (وات)، والشريان الاورطي. نسلط الضوء على الاستخدام المزدوج كيف التدفق الخلوي يمكن تحقيق بعدا جديداً لعزل وتوصيف المقيم في الأنسجة الضامة. قسم أساسي من هذا البروتوكول يتناول التعقيدات الكامنة وراء ديجيسشنز الانزيمية الخاصة بالانسجة والعزلة بلعم، وجسم سطح الخلية اللاحقة تلطيخ لتحليل تدفق سيتوميتريك. هذا البروتوكول يتناول التعقيدات القائمة الأساسية لخلية تنشيط الفلورسنت الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، ويقدم إيضاحات لهذه التعقيدات بغية الحصول على توصيف مجموعة واسعة من السكان خلية تم فرزها على نحو كاف. وترد أساليب الإثراء بديل لفرز الخلايا، مثل الكبد كثيفة، والسماح لإدارة الوقت والمرونة عند العمل مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. باختصار، هذا البروتوكول الإيدز الباحث لتقييم التغايرية بلعم من العديد من الأنسجة الملتهبة في دراسة معينة ويوفر تلميحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الثاقبة التي نجحت لعزل الخلوية مواتية وتوصيف للحصول على الخلايا المناعية في التهاب ديو بوساطة.

Introduction

نماذج الماوس قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة القوى المحركة للأمراض التي تصيب الإنسان. العزل السليم من خلايا الأنسجة المقيمين من الفئران في حالة مريضة يمكن أن توفر منطلقاً لفهم المساهمات الجزيئية والخلوية للآلية المرضية ل المرض1. اضطراب واحد له أهمية حاسمة هو السمنة. الإصابة بالسمنة وتواصل الارتفاع في جميع أنحاء العالم بالتوازي مع مقاومة الأنسولين واكتب 2 مرض البول السكري، وأمراض القلب والأوعية الدموية، ومرض الكبد الدهني2،3. استهلاك المواد الغذائية المفرطة كذلك ينحرف بانخفاض النشاط البدني أحداث تغيير الإشارات الصادرة من الأنسجة الدهنية، والتي يمكن أن يغير الوسط الخلوية للأنسجة المحيطية الأخرى مثل الشريان الاورطي والكبد4. ويؤدي مثل هذا الإخلال بالتوازن الأيضي الالتهابات الجهازية مزمنة منخفضة درجة5.

ثبت ليس فقط بدء التقلبات إشارات الأيضية ولكن أيضا إدامة التهاب6،7الكلاسيكية تفعيل الضامة المقيم للشريان الاورطي والكبد، فضلا عن تجنيدهم للأنسجة الدهنية البيضاء (وات). عدم تجانس المظهرية والوظيفية من الضامة يرتبط ارتباطاً قويا بأمراض السمنة المتصلة المراضات المشارك7. اللدونة دينامية في الاستقطاب بلعم يسمح لهذه الخلايا للمعرض مجموعة واسعة من تنشيط تعمل بتنسيق التقدم والقرار من التهاب8. بينما تقليديا تنشيط الضامة (M1) متورطة في انتشار التهاب، بدلاً من تنشيط الضامة (M2) ارتبطت بالقرار والأنسجة وإصلاح9،10.

كما يخضع الجسم للإجهاد الأيضي، تتراكم الأنسجة الدهنية البيضاء انخفاضا غير عادي. الأنسجة الدهنية الموسعة يجذب ويحتفظ بالخلايا التحريضية التي تغير عميق الدالة adipocyte العادية لتعزيز مقاومة الأنسولين وارتفاع السكر في الدم وفي نهاية المطاف نوع 2 السكري ومقاومة الأنسولين أو، فرط سكر الدم11 12. في موازاة ذلك، تسلل يعيد تشكيل الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة لإشارات التحريضية الصادرة عن المنشط كلاسيكي (M1) الأنسجة الدهنية، الضامة (Atm)13،14. وتمارس هذه الهيئة متعددة الخلايا سلسلة إشارات أن يحرف وظيفة طبيعية لأعضاء الجسم الأخرى مثل الشريان الاورطي و الكبد4.

الكبد هو قوة الأيض التي تكيف في الاستجابة للمحفزات التي تنشأ من قريب dysregulated وات15. الضامة الكبد أو خلايا كوبفر، استجابة للتغيرات الاستقلابية، إفراز السيتوكينات الالتهابية التي تحول كل متني والنمط الظاهري الخلية غير متني وتشجيع إعادة عرض النسيج. تراكم الدهون الكبدية والتهاب ورواسب المصفوفة خارج الخلية المفرط، ونخر ويتبع فقدان وظيفة في نهاية المطاف الشتائم التحريضية المساهمة في طائفة واسعة من تلف في الكبد المرتبطة بمرض الكبد الدهني غير الكحولية 16،،من1718.

وبالتوازي مع الشبهة وات ووظيفة الكبد، الشرايين الكبيرة تتراكم الدهون داخل الجدار الشرياني كما يخضع الجسم للإجهاد الأيضي المزمنة19. مشغلات تراكم الدهن الشرياني إفراز المستقطبات بتنشيط خلايا بطانية والتعيين اللاحق وحيدات20. بمجرد تعيينهم، وحيدات تتكاثر والتفريق، واستيعاب البروتينات الدهنية وتصبح خلايا الرغاوي. بدأت أثيروجينيسيس ولحقت بنشاط برو التحريضية المعينين والأنسجة الضامة محملة بالدهن المقيم. الخضوع لإشارات الإجهاد خارج الخلية وداخل الخلية في هذا المكروية atherogenic، هذه الضامة ثم الانخراط في أبوبتوتيك إشارات تتالي. كما يموت هذه الخلايا الرغوية، وهم يساهمون محتوياتها الدهن شغلها في الصميم نخرية الآفة، مما يؤدي بعد ذلك إلى تمزق اللوحة واحتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية.

جماعياً، ينظم عدم تجانس بلعم تعمل جزئيا السمنة الناجمة عن التغيرات التحريضية التي لوحظت في أنسجة dysregulated مثل وات والكبد والشريان الاورطي8،21. توصيف للمعينين والأنسجة الضامة المقيمين يمكن أن توفر نظرة ثاقبة الأهداف الجزيئية المحتملة التي تعالج بلعم النمط الظاهري1. لوصف فعالية الضامة من الأنسجة الملتهبة الناجمة عن السمنة، يمكن الحصول على تعليق خلية واحدة من خلال الهضم الأنزيمي. يجب أن تكون هذه البروتوكولات تفارق فعالة في تدهور النسيج الضام بما فيه الكفاية مع الحد من موت الخلايا المناعية وتوفير العائد الأمثل الخلية. مزيج الإنزيم يعتمد على نوع النسيج ويشكلون الهيكلية. يتطلب مرونة الأنسجة مثل الشريان الاورطي النشاط الأنزيمي أقوى، بالمقارنة مع الكبد ووات، لتحقيق الانفصال من الأنسجة. من تعليق خلية مفردة، يمكن لبس تتميز الأنسجة الضامة المقيم أو معزولة لمزيد من التحليلات المصب مثل التنميط النسخي.

هنا هو وصف بروتوكول الخاصة بالانسجة يستخدم الهضم الأنسجة تعتمد على كولاجيناز ومجسماته التدفق الخلوي لعزل وتوصيف المقيم في الأنسجة الضامة التي تم الحصول عليها من النظام الغذائي التقليدية الناجمة عن السمنة، بفعالية تصلب الشرايين وذلك بسيط ونماذج الماوس steatohepatitis. متزامنة تلطيخ علامات الخلية السطحية مع الأجسام المضادة ضد الكريات البيض-(CD45 و/أو CD11b) وبلعم-يستخدم لتحديد السكان بلعم22غالباً المستضدات محددة (F4/80). خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) استراتيجية قوية ويستخدم لفرز هذه المجموعات السكانية التي تم تحديدها في درجة نقاء عالية. ثم يمكن تقييم السكان تم فرزها لملامح الجينات محددة النمط الظاهري باستخدام التحليل الجزيئي المتلقين للمعلومات (مثل كمية الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل)23. على الرغم من أن معيار التدفق الخلوي والتدفق الخلوي تقوم الخلية الفرز أدوات قوية في تمييز الضامة ضمن تعليق خلية غير متجانسة إلى حد كبير، يجب أن يكون الأمثل البروتوكولات السابقة لضمان نجاح الإخراج. ويرد في هذه الدراسة، والبروتوكولات التي عزل بفعالية وتميز الضامة محددة الأنسجة قابلة للتطبيق؛ الأهم من ذلك، توفر هذه الدراسة حاسمة من التبصر في المسائل الفنية التي كثيرا ما تنشأ، فضلا عن استراتيجيات استباقية ومبسطة لحل المشاكل منع و/أو حلها.

Protocol

وافق جميع البروتوكولات التجريبية (المادتان 1 و 1.2 و 1.3) "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية بنسلفانيا.

الأنسجةإعداد المخازن المؤقتة للانفصالالحجم النهائيتخزين
الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) المخزن المؤقت للانفصال: 2.5% حبيس، 10 ملغ/مل ألبومين المصل البقري (BSA)، 3 ملغ/مل (0.3%) كولاجيناز "النوع الثاني" في تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) مع الجلوكوز 4.5 غرام/لتر دون بيروفات لام الجلوتامين والصوديوم500 ملناقص 80درجة مئوية (10 مل مختبرين)
الكبد 25 x نضح المخزن المؤقت التركيز (لجنة البرنامج والميزانية): 3.55 م كلوريد الصوديوم، 168 مم بوكل، 240 ملم حبيس، 150 مم هيدروكسيد الصوديوم في المقطر منزوع ح2س500 ملناقص 20درجة مئوية (40 مل مختبرين)
المحافظة على المخزن المؤقت (PRB): 1% جيش صرب البوسنة في 1 × نضح المخزن المؤقت1 L4 درجة مئوية
الانفصال من المخزن المؤقت: 1 × نضح المخزن المؤقت تستكمل مع 4.76 مم كاكل2 و 72 رابعا نوع كولاجيناز U/mL50 مل (للماوس)التحضير قبل الاستخدام مباشرة
الشريان الاورطي المخزن المؤقت للانفصال: 125 يو/مليلتر كولاجيناز النوع الحادي عشر، 60 يو/مليلتر البروتين السكري المثبط النوع الأول، 60 يو/مليلتر الدناز أنا، 450 يو/مليلتر كولاجيناز النوع الأول، 20 مم حبيس في 1 × الفوسفات خفف المحلول الملحي (PBS)500 ملناقص 80درجة مئوية (10 مل مختبرين)

الجدول 1: الأنسجة نضح محددة وصفات المخزن المؤقت.

1-الأنسجة العزلة والانفصال

  1. وات العزلة والانفصال
    1. إعداد المخازن المؤقتة الخاصة بالانسجة وفقا الجدول 1، وتخزينها كما هو موضح.
    2. إعداد الكواشف التالية.
      1. إعداد المخزن المؤقت الهضم بذوبان حجم المناسبة وات الانفصال من المخزن ومخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. فورا قبل الاستخدام، الحارة المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية. إعداد المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية بإعداد 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) الذي يحتوي على 2% مصل بقرى الجنين (FBS).
    3. عزل وات
      1. Euthanize دائرة ماوس في غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) شغلها. التحقق من فعالية قبل الاستمرار إلى مرحلة تشريح.
      2. تراجع الماوس euthanized بإيجاز في كوب يحتوي على الإيثانول 70% حتى غارقة بدقة والمغلفة مع الإيثانول. ضع السطح البطني الماوس حتى في مرحلة التشريح وربط الماوس الصدارة وآثار أقدام هند إلى المجلس التشريح باستخدام الإبر ز 21.
      3. استخدام الملقط نصيحة النقطة المتوسطة لفهم الجلد البطن عرفت افتتاح الاحليل، ثم استخدام مقص تشريح حاد جعل نك في جلد البطن الفهم.
      4. إدراج شفرة المقص السفلي في شق صغير بين الجلد والصفاق، وجعل شق جانبية من البطن إلى القفص الصدري.
      5. سحب بلطف الجلد لفضح التجويف الصفاقى سليمة وجعل شق أفقي عن طريق الصفاق وأما أمثال يعود الغشاء الشفاف أو المكوس الأنسجة لفضح وات البطن.
      6. جمع منصات الدهون بيريجونادال كما هو موضح في مان et al. 24
        1. منصات بيريجونادال الدهون في الفئران الذكور فضفاضة ملزمة إلى البربخ والخصيتين. أولاً تحديد مكان الخصيتين ثم مع المتوسط نقطة الملقط، فهم عقد رأس البربخ وسحب بلطف.
        2. باستخدام مقص تشريح حاد، المكوس كل لوحة الدهون البربخيه بالقطع على طول سطح البربخ (الرأس والجسم والذيل) والخصيتين.
        3. مع الملقط، اجذب على لوحة الدهون في حين قطع من خلال النسيج الضام منضم مباشرة إلى هيكل البربخ.
        4. استخدام الملقط، إيمانا راسخا قبضة نهاية لوحة الدهون الدانية البربخ وقشر بلطف من لوحة الدهون بعيداً عن الغدد التناسلية
        5. في الفئران الإناث، هي منصات بيريجونادال الدهون فضفاضة السندات إلى جسم الرحم والرحم في القرن الأفريقي.
        6. استخدام الملقط نقطة المتوسط، قبضة الأنسجة الدهنية بيريجونادال واجذب الأنسجة بعيداً عن جسم الرحم والرحم في القرن الأفريقي.
        7. المكوس كل لوحة الدهون بالقطع على طول جسم الرحم والرحم القرن باستخدام مقص تشريح حاد.
      7. ضع الدهون منصات في طبق بتري مليئة ببرنامج تلفزيوني والحفاظ على الجليد للحفاظ على الأنسجة الرطبة.
    4. الانفصال وات في تعليق خلية مفردة
      1. إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة من طبق بيتري واستخدام شفرة حلاقة حافة واحدة فرم وات البطن إلى قطع صغيرة.
      2. مع حافة حادة من شفرة حلاقة، بلطف كشط وات البطن مفروم إلى أنبوب جمع البوليبروبيلين مسمى 15 مل يحتوي على 2 مل وات الانفصال من المخزن المؤقت.
      3. احتضان هذا الخليط الهضم الأنسجة العازلة تحت بطيئة التناوب المستمر في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
      4. تصفية الأنسجة هضمها من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب جمع 50 مل بينما يتحرك المكبس المطاط من المكبس حقنه في حركة دائرية وتواصل منخل تعليق خلية عن طريق التصفية.
      5. ويجب غسل الفلتر مع تعليق خلية واحدة بيبيت 2 مل دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم) إلى أنبوب جمع 15 مل، بلطف بيبيت صعودا وهبوطاً.
      6. يجب غسل الفلتر مرتين إضافية مع دميم الباردة ووضع تعليق خلية مفردة على الجليد.
      7. الطرد المركزي بتعليق خلية في 300 غرام x عند 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
      8. استخدام المضخة فراغ عناية إزالة adipocytes العائمة (أولاً)، وتبقى طافية. تأكد من عدم الإزعاج في كسر الأوعية الدموية stromal الأعلاف (التبرعات).
      9. مع ماصة ميليلتر 1,000، بلطف إعادة تعليق بيليه في المخزن المؤقت البوتاسيوم كلوريد الأمونيوم (ACK) الكريات الحمراء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      10. تمييع تعليق خلية أعلاه مع دميم والطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق.
      11. تعليق إعادة الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة التي تحتوي على نسبة 2% FBS (المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية) وحساب الخلايا في دائرة باركر/هيموسيتوميتير.
      12. نقل تعليق الخلية بأكملها (بالنسبة لنظام مراقبة الأصول الميدانية) أو 1 × 106 خلايا (لقياس التدفق الأساسي) إلى المسمى مل 5 أنابيب البوليستيرين القاع المستديرة. يواصل الفرع 2 للتدفق الخلوي تلطيخ البروتوكول.
  2. نسيج الكبد العزلة والانفصال
    ملاحظة: هذا البروتوكول تم تكييفها من Smedsrød25.
    1. إعداد المخازن المؤقتة الخاصة بالانسجة وفقا الجدول 1 وتخزينها كما هو موضح.
    2. إعداد الكواشف التالية.
      1. إعداد 1 x نضح المخزن المؤقت (PB)، بتمييع 40 مل من لجنة البرنامج والميزانية إلى 960 مل عالي النقاوة ح2"الحارة" قبل سين حقنه مليئة 50 مل من الجريدة الرسمية في 37 درجة مئوية، قبل أن يبدأ نضح. إزالة أي فقاعات الهواء الحالية.
        1. للقضاء على فقاعات الهواء، عكس المحاقن حيث يشير تلميح تأمين، إلى أعلى. اضغط أو نفض الغبار حقنه حتى فقاعات الهواء إلى أعلى pf المحاقن. ادفع برفق على المكبس طرد الهواء
      2. إعداد المخزن المؤقت الهضم بإذابة 0.5 مل من 476 مم كاكل2 الحللمل 49.5 1 × نضح المخزن المؤقت. إضافة 3600U كولاجيناز النوع الرابع 4.76 مم كاكل2 – الحل في الجريدة الرسمية. قبل الحارة حقنه مليئة 50 مل من المخزن المؤقت الهضم عند 37 درجة مئوية قبل بدء تشغيل التروية. إزالة أي فقاعات الهواء الحالي كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.1.1.
      3. تعد المحافظة على "المخزن المؤقت" (PRB) بتذويب ألبومين المصل البقري 2.5 g (BSA) في المخزن المؤقت لنضح 1 x 250 مل. تخزين في 4 درجات مئوية أو الحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
      4. إعداد المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية مع FBS PBS و 2% 1 x.
    3. عزل نسيج الكبد
      1. Euthanize ماوس بالخنق2 CO، تشبع الماوس مع الإيثانول 70% لمنع التلوث لأجهزة إينترابدومينال مع الفراء.
      2. موقف الجانب البطني الماوس حتى بوليستيرين الرغوية تشريح المجلس وتأمين الماوس الصدارة وهند الكفوف إلى المجلس التشريح باستخدام الإبر ز 21.
      3. لفضح الجدار الصدري والتجويف الصفاقى، فهم الجلد البطن بالقرب من افتتاح الاحليل استخدام ملقط تلميح نقطة متوسطة. ثم استخدم مقص تشريح حاد لإنشاء شق صغير في الجلد البطني الفهم.
      4. إدراج شفرة المقص السفلي في شق صغير بين الجلد والصفاق، وجعل شق الوحشي من الفخذ إلى الذقن.
      5. سحب بلطف الجلد لكشف التجويف الصفاقى سليمة وجدار الصدر، وجعل شق أفقي عن طريق الصفاق والمكوس الغشاء.
      6. رفع القص ودقيق جداً الحجاب الحاجز، يجب التأكد من عدم الإخلال أدنى الوريد الأجوف (IVC). نقل الأجهزة الجهاز الهضمي إلى الجانب وتحديد موقع IVC سوبهيباتيك. استخدام ملقط مرقئ المشبك سوبراهيباتيك IVC الحفاظ على التروية المترجمة.
        ملاحظة: يمكن غالباً قناع التراكم المفرط للنسيج الدهني الأبيض الحشوي في IVC. أفضل تصور هذه السفينة، يمكن أن تكون اقتطعت مساحة صغيرة من الأنسجة الدهنية بجوار IVC. ثم يمكن وضع الإطار قطعي داخل الأنسجة الدهنية طيعة عبر IVC تعريض السفينة في كانوليشن.
      7. إرفاق حقنه مليئة PB المعالجون مسبقاً إلى مجموعة جمع وضخ الدم ز 23. ادفع برفق على المكبس حتى يتم ملء الأنبوب والإبرة بالجريدة الرسمية.
      8. أدخل الإبرة ز 23، موازية لمستوى IVC سوبهيباتيك. تأمين الإبرة في مكانها باستخدام المشبك مرقئ 4 سم.
        ملاحظة: كانوليشن سوبهيباتيك IVC هو المفضل لدى الفئران التي تغذي النظام الغذائي في ذلك IVC يمكن أن يكون أفضل تصور ومقني داخل تجويف مليئة بالدهون.
      9. دفع بلطف على المكبس يبدأ نضح، وسوف سرعة تدفق اللون من الكبد (الحق الفص الأول) إذا تم وضع الإبرة على نحو ملائم في السفينة. توسيع الفصوص مرئياً أيضا إذا كان إدخال الإبرة بشكل صحيح في IVC سوبهيباتيك.
      10. سرعة قطع الوريد البابي للسماح بالجريدة الرسمية بالتدفق بحرية عن طريق الكبد.
      11. نتخلل في الكبد حتى الدم لم يعد مرئية. في بعض الأحيان بلطف تدليك الفصوص الكبد بين الصدارة-الإصبع والإبهام لتسهيل التروية.
        ملاحظة: من المهم استخدام الأدوات المدببة حادة غير مسننة لمعالجة الكبد لمنع تلف الأنسجة.
      12. عندما يبقى 5 مل من الجريدة الرسمية ضمن المحاقن، تغيير لحقنه مليئة بالانفصال من قبل حرارة المخزن المؤقت. عدم الإزعاج موضع الإبرة المضمون خلال هذا الوقت.
        ملاحظة: توسيع كبد كبيرة تتجاوز 1.5 ز ينبغي أن يكون perfused مع حجم أكبر من المخزن المؤقت الهضم المعالجون مسبقاً لضمان نجاح الانفصال من الكبد.
      13. نتخلل في الكبد حتى يهضم تماما. بلطف تدليك الكبد الفصوص تيسيرا التروية.
        ملاحظة: فصل الكبسولة في جليسون من حمة يمكن ملاحظتها في كبد هضمها بنجاح. لتقييم هذا، استخدم حافة حادة من زوج من الملقط، لاضغط برفق على الفص الجانبي الأيسر. انطباع يجب أن تظهر على السطح وينبغي ملء المسافة البادئة ببطء حالما يتم إزالتها الملقط.
      14. إزالة الإبرة من IVC سوبهيباتيك. لا تقم بإزالة ملقط مرقئ لقط سوبراهيباتيك IVC.
      15. المكوس الكبد كله بقطع بعناية من خلال ربط الأربطة باستخدام شفرة مستقيمة قصيرة تشريح المقص وإزالة المرارة.
      16. وضع الكبد كله في طبق بتري 10 سم التي تحتوي على 10 مل المثلج "المحافظة على المخزن" ومخزن في 4 оC حتى على استعداد لتحرير الخلايا.
    4. تفكك خلية الكبد
      1. نقل الكبد لطبق 10 سم التي تحتوي على 10 مل دميم المثلج.
      2. قبضة سوبراهيباتيك مقطوعة IVC يعلق على الكبد قصت استخدام ملقط مسنن. استخدام الملقط النقطة المتوسطة لإطلاق سراح الخلايا من كبسولة جليسون بتطبيق حركة التمسيد السريع لكل فلقة.
      3. يمر دميم المشبعة 70 ميكرومتر خلية مصفاة تعلق على أنبوب جمع 50 مل.
      4. بيبيت المثلج 10 مل دميم إلى طبق بتري 10 سم وكرر الخطوات 1.2.4.1 إلى 1.2.4.3 حتى لم يعد يتم ملاحظة تشبع وسائل الإعلام. وضع تعليق خلية في الجليد أو عند 4 درجة مئوية.
      5. المزيج بلطف تعليق خلية بعكس أنبوب جمع وثم الطرد المركزي في 54 x ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      6. جمع المادة طافية في أنبوب جمع 50 مل نظيفة. ثم الطرد المركزي بتعليق خلية في 54 x ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية.
      7. كرر الخطوة 1.2.4.6 مرتين إضافية قبل المتابعة إلى الخطوة 1.2.4.8.
      8. نقل المادة طافية إلى أنبوب تنظيف 50 مل-جمع والطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      9. إعادة تعليق خلية غير متني بيليه في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وحسابها في دائرة باركر/هيموسيتوميتير.
      10. نقل الخلايا6 1 × 10 (لقياس التدفق الأساسي) أو 15 × 106 -20 × 106 خلايا (بالنسبة لنظام مراقبة الأصول الميدانية) إلى المسمى أنابيب البوليستيرين أسفل المائدة المستديرة 5 مل. يواصل الفرع 2 للتدفق الخلوي تلطيخ البروتوكول.
  3. الشريان الاورطي العزلة والانفصال
    ملاحظة: هذا البروتوكول تم تكييفها من الجزارet al.26
    1. إعداد المخازن المؤقتة الخاصة بالانسجة استناداً إلى وصفات المنصوص عليه في الجدول 1 وتخزينها كما هو موضح.
    2. إعداد الكواشف التالية.
      1. إعداد المخزن المؤقت الهضم بذوبان حجم المناسبة وات الانفصال من المخزن ومخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. فورا قبل الاستخدام، الحارة المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية.
      2. تحضير حلاً الهيبارين 10 x بتذويب الهيبارين ملح الصوديوم في برنامج تلفزيوني 1 x بتركيز 200 يو/مليلتر. تمييع 10 × الحل الهيبارين الأسهم مع برنامج تلفزيوني 1 x إعداد 1 × الحل الهيبارين. تخزين 10 x و 1 × حلول الهيبارين عند 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      3. إعداد المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية مع برنامج تلفزيوني 1 x يحتوي على 2% FBS.
    3. تسلخ الابهر
      1. Euthanize ماوس في غرفة مليئة غاز ثاني أكسيد الكربون والشطف مع الإيثانول 70%.
      2. ضع الجانب البطني الماوس حتى في مرحلة التشريح وتنتشر الماوس الصدارة وآثار أقدام هند وثبتت لهم إلى المجلس التشريح باستخدام الإبر ز 21.
      3. فور يوثانيزينج الماوس، تنفيذ ثقب القلب. الرجوع إلى الخطوات 1.3.3.4 ل 1.3.3.9، إذا لزم الأمر.
      4. تحديد موقع عملية الرهابه في النهاية السفلي للقص
      5. للقيام بذلك، قم بوضع نقطة وسط إصبع على طول عرض الرقبة للحيوان. تتبع على طول خط الوسط البطني من الرقبة إلى نهاية والذيلية للقص حتى يشعر ملحق عنقية.
      6. استخدام الملقط النقطة المتوسطة لاستيعاب تمديد عنقية، وإذا اقتضى الأمر وضع علامة على موقع عملية الرهابه بإزالة التصحيح للشعر أو الجلد في المنطقة.
      7. جزئيا بإدراج إبرة ز 26 بموجب عملية الرهابه في زاوية 20-30 درجة مئوية.
      8. بلطف تطبيق الضغط السلبي للمحاقن بسحب المكبس ببطء، ثم أدخل إبرة إضافية في التجويف حتى تدفق الدم.
      9. إذا توقف تدفق الدم، بطء تدوير الإبرة أو تتحرك قليلاً في والخروج.
      10. استخدام زوج الملقط للاستيلاء على عقد من الجلد البطن عرفت الاحليل فتح، واستخدام مقص تشريح حاد لقص على طول خط الوسط البطني عن طريق الصفاق من الفخذ إلى الذقن.
      11. سحب الجلد للكشف عن أجهزة البطن والقفص الصدري مع الأصابع أو الملقط حادة بلطف نقل أعضاء البطن إلى الجانب.
      12. استخدام الملقط للاستيلاء على عقد من عملية الرهابه، رفع القص، وجدا الحجاب الحاجز.
      13. باستخدام مقص تشريح، قطع طريق الضلع الأفقي على كلا الجانبين. تجتاح القص، فليب القفص الصدري صعودا وقطع طريق قاعدة الربط. إزالة القفص الصدري تعريض أجهزة الصدر الأساسي.
      14. نتخلل الشريان الاورطي بإبرة 26-قياس يعلق على 10 مل-حقنه مليئة 1 × الحل الهيبارين عن طريق حقن 1-2 مل من محلول في البطين الأيسر (LV) من القلب.
        ملاحظة: يجب التأكد من نتخلل بمعدل بطيء مع الضغط قليلاً التأكد من آفات الابهر تصلب الشرايين سليمة.
      15. المكوس الغدة الصعترية، والرئتين والأنسجة الضامة. الرجوع إلى الخطوات 1.3.3.16 و 1.3.3.17، إذا لزم الأمر.
        1. عرفت القلب موقع ثنائية اللونين الأبيض (أو شكل فراشة) الجهاز والاستيلاء على عقد من الغدة الصعترية مع الملقط بشدة. سحب كل الفصوص إلى أعلى بعيداً عن التجويف وقطع في القاعدة مع المقص.
        2. لإزالة الرئتين، قرصه فص الرئة مع الملقط وسحب الأنسجة بعيداً عن تجويف الصدر وقطع في القاعدة. كرر لكل فلقة المتبقية.
      16. استخدام مجهر تشريح تشريح الصغرى أدوات، وجمع قوس الابهر (بما في ذلك الشريان innominate والشريان السباتي المشترك الأيسر والشريان الأيسر subclavian)، تصاعدي, تنازلي، الشريان الاورطي الصدري والبطن.
        1. قم بتحديد موقع الشريان الاورطي تصاعدي في البطين الأيسر للقلب.
        2. مع زوج من منحنى 0.07 × 0.04 مم-نصيحة أمسك الملقط بلطف الجزء من الشريان الاورطي تصاعدي الخارجة من البطين الأيسر.
          ملاحظة: بالمقارنة مع الأنسجة الدهنية المحيطة الأصفر المشوب، سيكون الشريان الاورطي سفينة بيضاء مشرقة مصدرها LV عند مسح بما فيه الكفاية مع الحل الهيبارين.
          1. إذا لم تم مسح الشريان الاورطي بشكل صحيح قبل التروية القلبية، تدفق الشريان الاورطي مرة أخرى بينما يظل متصلاً التجويف الشريان الاورطي. للقيام بذلك، قص قرب مفرق القلب-الشريان الاورطي وإزالة القلب وتخترق الأدنى حد من الشريان الاورطي البطني ثم أفقياً. أدخل إبرة ز 26 في فتح الشريان الاورطي تصاعدي وتدفق الشريان الاورطي مع 1 × الحل الهيبارين بلطف.
          2. الساحبة برفق في الشريان الاورطي تصاعدي أفضل تميز بين الأنسجة الدهنية وجزءاً لا يتجزأ من الشريان الاورطي.
          3. لا يزال بلطف سحب على الشريان الاورطي تصاعدي، استخدم غيض الربيع مغلقة تشريح مقص لمسح الدهون التي تغلف القوس الاورطي والشريان الاورطي تصاعدي. للقيام بذلك، السكتة الدماغية الأنسجة الدهنية مع غيض شفرات مقص مغلق للدموع بعيداً الدهون الربط.
            ملاحظة: الامتناع عن نسق أي الأنسجة الدهنية بقطع حتى يمكن تصور الشريان الاورطي والقوس تصاعدي واضح. وهذا لمنع قطع الشريان الاورطي.
          4. إذا كان تصاعدي الشريان الاورطي والقوس يمكن أن تكون بوضوح من الأنسجة الدهنية المحيطي، استخدم ربيع تشريح مقص للمكوس الدهون الزائدة.
          5. بلطف الاستيلاء على عقد القوس الاورطي مع الملقط. مرة أخرى باستخدام تلميح مقص الربيع في، السكتة الدماغية في الدهون على طول الشريان الاورطي تنازلي والصدر والبطن إلى نهاية والذيلية للشريان الاورطي البطني، القيام بذلك على الجانب الأيمن من الأكمام الدهون.
          6. مواصلة لفهم على طول الشريان الاورطي عند تمزق بعيداً من الدهون. تأكد من القيام بذلك بلطف لمنع الأضرار بالشريان الاورطي.
          7. اجذب الشريان الاورطي إلى الأعلى نحو المجهر حيث أن الدهون هي الآن في وضع خلف الشريان الاورطي.
          8. إدراج ريش مقص مغلق بين الواجهة الشريان الاورطي الدهون بالقرب من نهاية الأمامي للشريان الاورطي تنازلي، شديدة المرفق في الأنسجة الدهنية إلى السطح في الشريان الاورطي بصراحة استخدام اقتراحا كاسحة.
            ملاحظة: دقة إزالة الدهون الزائدة وتربط الأنسجة بينما لا يزال داخل التجويف الشريان الاورطي هو الموصى بها.
          9. المكوس القلب وخفض العرض في نهاية الشريان الاورطي البطني والذيلية. إزالة الشريان الاورطي كله.
          10. مكان الشريان الاورطي في طبق 35 ملم وندف بعيداً أي الدهون الزائدة في الشريان الاورطي استخدام اثنين 21-قياس الإبر. مكان الشريان الاورطي قصت في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.7 مل على الجليد.
    4. الانفصال من الشريان الاورطي في تعليق خلية مفردة
      1. بيبيت 0.2 مل الشريان الاورطي الانفصال من المخزن المؤقت إلى الأنبوب الذي يحتوي على الشريان الاورطي. إدراج ريش الربيع مقص مدبب نهاية الأنبوب وسرعة فرم الشريان الاورطي لتسهيل الهضم الأنزيمي.
      2. نقل الخليط حل الأنسجة إلى 15 مل جمع الأنبوب وماصة 1.8 مل الشريان الاورطي الانفصال من المخزن مؤقت لإجمالي حجم 2 مل.
        ملاحظة: لسهولة نقل تعليق الأنسجة، قطع 1 سم قبالة نهاية مدبب من طرف ماصة ميليلتر 1,000 القياسية. استخدام تلميح مختصر لنقل التعليق مع ميكروبيبيتي.
      3. احتضان الشريان الاورطي مفروم في المخزن المؤقت للانفصال من الشريان الاورطي لمدة 55 دقيقة في 37 درجة مئوية، تهز 220 لفة في الدقيقة (0.514 س ز).
      4. يمر بتعليق 50 ميكرومتر خلية مصفاة في أنبوب جمع البوليبروبيلين 15 مل. استخدام المكبس المطاط من المكبس حقنه تيسيرا للتصفية.
      5. شطف الأنبوب جمع 15 مل مع المخزن المؤقت 1 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وجمع التعليق وتمر عبر مصفاة الخلية.
      6. أغسل مصفاة خلية ميكرومتر 50 مرتين إضافية مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية 1 مل.
      7. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إعادة تعليق الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية الباردة. عد الخلايا في دائرة بوركير/هيموسيتوميتير.
      8. نقل الخلايا 1 × 106 (لقياس التدفق الأساسي) أو تعليق الخلية بأكملها (بالنسبة لنظام مراقبة الأصول الميدانية) لأنابيب البوليستيرين قاع مستديرة مسمى 5 مل. يواصل الفرع 2 للتدفق الخلوي تلطيخ البروتوكول.

2-التدفق الخلوي وتلطيخ نظام مراقبة الأصول الميدانية

فلوروفوريR-فيكوريثرين (PE)PE/سينين (قبرصي) 7PE/سينين (قبرصي) 5المحيط الهادئ الأزرق (PB)
ليزر (nm)الأزرق (488 نانومتر)/أصفر (561-570 نانومتر)-الأخضر (532 nm)الأزرق (488 نانومتر)/أصفر (561-570 نانومتر)-الأخضر (532 nm)الأزرق (488 نانومتر)/أصفر (561-570 نانومتر)-الأخضر (532 nm)البنفسجي (405 نانومتر)
الإثارةMAX (nm)496496496401
الانبعاثاتماكس (nm)578785667455
علامة المظهريةF4/80CD11cCD11bCD45
EMR1، Ly71ΑX إنتغرين، إنتغرين αX سلسلة، CR4، p150، إيتجاكسΑM إنتغرين، 1 ماك، Mo1، CR3، Ly-40، C3biR، إيتجامT200، لي--5، وتحليل دورة الحياة
نوع الخلية المستهدفةالأنسجة الضامة المقيمالضامة تفعيلها كلاسيكي (M1)حيدات/الضامةالكريات البيضاء (الضامة/وحيدات، والخلايا الليمفاوية والمحببة)
مجموعة فرعية خلايا الجذعيةالخلايا الجذعية، ناغورني كاراباخ الخلايا والخلايا T المنشط ومجموعة فرعية من الخلايا اللمفية للسيتولوجيا المعوية (IEL)المحببة، والخلايا الجذعية، والخلايا ناغورني كاراباخ، ومجموعات فرعية من خلايا تي وب
عامل إضعاف01:501: 1001: 1001: 100
ضوابط ايستبIgG2a الفئران PEمفتش الهامستر اﻷرميني PE/Cy7IgG2b الفئران PE/Cy5IgG2c الفئران الأزرق المحيط الهادئ

الجدول 2: قائمة fluorophore معلم أجسام مضادة محددة لتمييز الأنسجة الضامة المقيم.

  1. جمع وإعداد العناصر التالية: نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت 5 مل القاع المستديرة البوليستيرين أنابيب، مستقبلات Fc CD16/32 الماوس المضادة حجب جسم، fluorophore مترافق أو unconjugated الابتدائي الأجسام المضادة، مترافق fluorophore الأجسام المضادة الثانوية (إذا كان اللازمة)، 1 x مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
    ملاحظة: لتلوين كميات كبيرة من الخلايا، تركيز الأجسام المضادة أهم بدلاً من عدد الخلايا. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا المصبوغة 10 × 106 حجم المخزن المؤقت المصبوغة وينبغي أن يكون تركيز الأجسام المضادة نفسه كما لو كان تلطيخ 1.0 × 106 خلايا في حجم المخزن المؤقت 100 ميليلتر. ويوصي لتلطيخ 1.0 × 108 خلايا، زيادة كمية الأجسام المضادة إضعاف.
  2. إضافة المخزن المؤقت الإضافي المثلج نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل أنبوبة نظام مراقبة الأصول الميدانية إذا لزم الأمر، وبيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 751 x ز لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية). نضح الطرد المركزي التالي طافية.
  3. إضافة مستقبلات CD16/CD32 Fc الماوس المضادة حجب جسم مضاد لجميع العينات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية أو على الجليد.
  4. إضافة عينات كوكتيل مباشرة إلى مستقبلات Fc حظر المحتوية على جسم الخلية تعليق واحتضان الابتدائي جسم مترافق fluorophore عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 30 عينات حماية من الضوء لتقليل تبيض مترافق fluorophore الأجسام المضادة.
    1. في حال استخدمت الأجسام الأولية unconjugated، اتبع هذه الخطوات بعد الانتهاء من "الخطوة 2، 4".
    2. أغسل جسم الابتدائي الملون العينات باستخدام الطرد المركزي في 751 x ز لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية).
    3. إزالة المادة طافية بالصب وإعادة تعليق بيليه في 100 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة.
    4. إضافة جسم الثانوي يضاف إلى جميع العينات اللازمة واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. انتقل إلى الخطوة 2، 5.
  5. إضافة 2 مل من الجليد الباردة نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت التالي جسم الحضانة، ثم بيليه الخلايا في 751 x ز لمدة 5 دقائق (4 درجات مئوية). صب المادة طافية ويجب التأكد من عدم الإخلال ببيليه.
  6. مزيج الخلايا بلطف ثم إعادة تعليق مع 200-400 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت، ثم تبقى هذه في الظلام في 4 درجات مئوية حتى التحليل الخلوي تدفق قياسي أو فرز الخلايا.
  7. لتثبيت قصير من الخلايا الملون، انتقل إلى 2.8 الخطوات إلى 2.10. استخدام التثبيت لقياس تدفق القياسية فقط.
  8. مباشرة بعد "الخطوة 2، 5"، تعليق إعادة الخلايا في مل 0.5% 2-4 بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 15-30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تنبيه: منهاج عمل بيجين إزعاج معروفة بالآثار السمية والمسببة للسرطان. عند استخدام منهاج عمل بيجين، التعامل معها بعناية فائقة. تأكد من استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة والعادم التهوية.
  9. التالي للتثبيت، غسل الخلايا بإضافة 2 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت لجميع العينات والطرد المركزي في 751 x ز في 4 درجات مئوية للحد الأدنى 5 إزالة طافية التالي الطرد المركزي.
  10. ريسوسبيند الخلايا الثابتة في 200 ميليلتر من الجليد الباردة نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن ومخزن في 4 درجات مئوية. إصلاح مخزن الخلايا تصل إلى 1 الأسبوع عند 4 درجة مئوية، من الناحية المثالية أداء التدفق الخلوي اقتناء خلال 48 ساعة لتقليل أوتوفلوريسسينسي.
  11. الحصول على بيانات التدفق الخلوي وفقا لإرشادات الشركة المصنعة سيتوميتير تدفق أو إجراء الفلورسنت تنشيط الخلية الفرز كما وصفها باسو وآخرون. 23

النتائج

عند استخدام الابوليبوبروتين ه ناقص الفئران (الذين كو) C57BL/6 (BL6) الحفاظ على حمية عالية الدهون ارتفاع الكولسترول (هتشفد أو مشاريع التنمية البشرية) لمدة 18 أسبوعا،4 من 1 × 10-2 × 104 CD45++ F4/80 الضامة الابهري يمكن أن تكون معزولة عند عينتين المجمعة. الكبد تشريح من الفئران التي تتغذى هفهكد "كو الذين"، أنتجت أكبر من خلايا كوبفر5 فرز 5 × 10 (الذي يعتمد على الوقت المتاح الفرز). عند استخدام نظام غذائي الدهون عالية (HFD) تغذية الفئران البرية نوع (WT) C57BL/6، يمكن فرز 5 × 105 إلى 1 × 106 الأنسجة الدهنية المقيم الضامة (Atm) من كسر الأوعية الدموية stromal (التبرعات). وكان العدد الإجمالي المذكور من الضامة التي يمكن فرزها من نسيج معين كافية لإجراء تحليل التعبير الجيني باستخدام كمية الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR). للأنسجة حيث يتم استرداد إعداد أقل من السكان بلعم، مثل الشريان الاورطي، من المستحسن استخدام precipitants المشارك (على سبيل المثال الجليكوجين) وهطول الأمطار بين عشية وضحاها عندما عزل الحمض النووي الريبي المسبق لهذه التحليلات.

هنا، آثار اضطرابات التمثيل الغذائي الناجمة عن النظام الغذائي على بلعم النمط الظاهري باستخدام الأساسية التدفق الخلوي والأسفار تنشيط الخلية الفرز (الأصول) والمصب وظيفة الفرز تظهر التحليلات. وتؤكد هذه النتائج الملاحظات المنشورة سابقا أن تغذية الفئران تسلل معرض زادت HFD أو هفهكد لتنشيط كلاسيكي (M1) الضامة في الأنسجة المتضررة مثل الشريان الاورطي (الشكل 1B). الاستفادة من التدفق الخلوي، ونظام مراقبة الأصول الميدانية، والتنميط الجيني التعبير (عن طريق كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR)، غلبة النمط الظاهري رون مستقبلات التيروزين كيناز-الإعراب عن CD45+ + F4/80 الضامة المستمدة من وقد لوحظ الأنسجة المعزولة من الفئران التي تغذي النظام الغذائي. كانت انخفضت رون التعبير عن مستقبلات الابهري الضامة مما يدل النمط الظاهري للالتهابات في الفئران التي تتغذى هفهكد (الشكل 1 ود). الضامة التعبير عن مستقبلات رون مفروزة المستمدة من هضم أورتاس أظهرت زيادة أرجيناسي التعبير الجيني (Arg1) 1، الذي علامة بلعم M2 راسخة (الشكل 1E). برو-التهابات الضامة التي وصفت بأنها CD45+ F4/80+ CD11c+ زادت في أورتاس المعزولة من الفئران التي تتغذى هفهكد (الشكل 1 باء و دال). وصف الضامة المقيم في الكبد مزيد توضيح النمط الظاهري السائد للتعبير عن مستقبلات رون الفئات السكانية الفرعية (الشكل 2A). بلعم برو التحريضية السكان CD11c + أظهر تعبير نقصان من الجينات التي ترتبط بشدة النمط الظاهري (M2) المضادة للالتهابات مثل Arg1 ورون (الشكل 2). ولوحظت اتجاهات مماثلة في السكان بلعم معزولة عن هضم الأنسجة الدهنية البيضاء (الشكل 3). بلعم السكان مع توقيع المحترفين تحريضية أظهرت انخفاض التعبير السطحي من مستقبلات رون (الشكل 3). الجمع بين النهج وقياس التدفق الأساسي ونظام مراقبة الأصول الميدانية، أسفرت عن بيانات قاطعة كذلك التحقق من مستقبلات رون كمنظم للتنشيط (M2) البديلة في الضامة32. لقد ثبت هذا انحياز النمط الظاهري (M2) المضادة للالتهابات القيام بدور وقائي في التنمية والتقدم من السمنة، وتصلب الشرايين، و steatohepatitis31.

figure-results-3267
رقم 1: إزالة توصيف الضامة المعزولة من الشريان الاورطي ينتابها من الفئران "الذين كو" الإبقاء على مشاريع التنمية البشرية لمدة 18 أسبوعا. أولاً كانت بوابات الخلايا (A) في CD45+ الكريات البيضاء، باستثناء الحطام الخلوية. (ب) CD45 تلطيخ بالاقتران مع F4/80 ويستخدم لتحديد السكان إيجابية مزدوجة يفترض أن الضامة. النابضة الإضافية كان يستخدم لإظهار النسبة المئوية ل CD11c+CD45+F4/80+ (M1) و (ج) رون+CD45+F4/80+ (M2 المحتملة) الضامة في أورتاس المستمدة من الفئران تتغذى على أي تشو العادية أو ارتفاع الكولسترول الغذائي لمدة 18 أسبوعا. (د) زيادة النسبة المئوية من CD11c+CD45++ (M1) F4/80 الضامة، فضلا عن انخفاض نسبة رون+CD45+F4/80+ (M2 المحتملة) لوحظت الضامة في أورتاس المستمدة من الفئران التي تغذي مشاريع التنمية البشرية مقارنة بالفئران التي تغذت تشو عادي. (ﻫ) مورثة تعبير تحليل مفروزة رون+CD45+الضامة F4/80+ أظهرت زيادة التعبير عن أرجيناسي أنا (علامة M2 موريني معروفة). تم الحصول على قيم استخدام الاختبار t التحليلات الطالب إجراء باستخدام برمجيات التحليل الإحصائي وممثله كما يعني ± sem. ف < 0.05 يعتبر معتدا به إحصائيا (* P < 0.05، * * * ف < 0.001). وقد تم تعديل الشكل من يو et al. (2016) 31- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-4952
رقم 2: الجينات التنميط نسخة من السكان خلية كوبفر فرز من كبد هضمها تشريح من الفئران "الذين كو" الإبقاء على مشاريع التنمية البشرية لمدة 18 أسبوعا. (أ) مخطط النابضة العامة لتحديد وفرز السكان خلية كوبفر. (ب) تحليل التعبير الجيني مفروزة رون معربا عن (رون+) وغير-إذ تعرب (رون–) CD45++ F4/80 الضامة حسب الكمية RT PCR. أجريت التحاليل اختبار t للطالب باستخدام البرمجيات الإحصائية ومثلت القيم كما يعني ± sem. ف < 0.05 اعتبرت يعتد به إحصائيا (* P < 0.05، * * * ف < 0.001). وقد تم تعديل الشكل من يو et al. (2016) 31 . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-5871
الشكل 3: تغذية "توصيف لأجهزة الصراف الآلي" معزولة من الأنسجة الدهنية البيضاء تشريح من الفئران WT BL6 HFD لمدة 18 أسبوعا. (أ) مخطط النابضة عامة تميز والفرز الأنسجة الدهنية المستمدة بلعم السكان (ب) النسبة المئوية من رون + الخلايا داخل CD45+F4/80+CD11c– و CD45+F4/80+CD11c+ السكان بلعم فرز من وات. وقد تم تعديل الشكل من يو et al. (2016) 31 . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

نماذج اضطراب التمثيل الغذائي الناجمة عن النظام الغذائي التي تحاكي المراضات المشاركة مثل تصلب الشرايين، وذلك بسيطة، steatohepatitis، والسكري من النوع 2 تستخدم على نطاق واسع لتحسين فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور المرض. كولاجيناز يتوقف الهضم يستخدم غالباً لننأى بالانسجة لتحرير الخلايا من16،المصفوفة خارج الخلية (ECM)27. تعطيل الإنزيمات مثل كولاجيناز الكولاجين الذي يوفر الدعم الهيكلي للخلايا المجاورة. تكوين الأنسجة الهيكلية يملي تصلب الأنسجة مصفوفة (مقاومة للتشوه) والمنتج كولاجيناز النفط الخام الذي هو الأكثر فعالية في ضمان نجاح تعطيل ECM28. وكثيراً ما يهضم وات، وهي مؤلفة من "مصفوفة لينة" مع "كولاجيناز النوع الثاني" لتحرير adipocytes والخلايا المناعية المقيم بينما في نفس الوقت الحفاظ على سلامة الخلايا مستقبلات الأنسولين السطحية29. ويساهم المصغرة مكونات فيبريل الشريان الاورطي "مصفوفة قاسية"، الذي يستخدم في تركيبة مع إنزيمات إضافية فعالة الهضم الابهر مع نوع كولاجيناز الحادي عشر (الذي له نشاط كولاجيناز أعلى). خلافا للشريان الاورطي، يستخدم الهضم الكبد كولاجيناز مع نشاط الأنزيمي أضعف، "كولاجيناز النوع الرابع"، لتعطيل المصفوفة وتحرير خلايا قابلة للحياة متني وغير متني30. الأنسجة الملتهبة مزمن المستمدة من النظام الغذائي التي تغذيها نوع البرية أو ضعيف الابوليبوبروتين ه (الذين كو) الفئران في C57BL6 خلفية الخضوع غالباً ما يعيد البناء التي يمكن أن تمنع الهضم الأنزيمي السليم. وسيناقش هذا القسم استراتيجيات تقليل و/أو القضاء على إمكانية تفكك النسيج غير لائق واسترداد خلية منخفض.

سمة مشتركة للأنسجة المستمدة من نماذج النظام الغذائي التي تغذيها الماوس التي تحاكي السمنة وتصلب الشرايين، و/أو غير الكحولية مرض الكبد الدهني، يتم إعادة عرض أنسجة غير طبيعية. في الأنسجة الدهنية البيضاء، والشريان الاورطي، والكبد، يتم تغيير تكوين إدارة المحتوى في المؤسسة، غالباً ما يؤدي إلى ترسب المفرط لمكونات فيبريلار مثل كولاجينس. نوع البرية C57BL6 الفئران الحفاظ على حمية عالية الدهون لمدة ثمانية عشر أسبوعا، تجربة شذوذ الخاصة بالانسجة مثل الأنسجة الدهنية البيضاء الموسعة وتوسيع الكبد الدهني (ذلك بسيطة). في كثير من الأحيان هذه الميزات الأيضية ليست مزعجة عقبات يجب التغلب عليها أثناء عملية تفكك النسيج. من ناحية أخرى، في نماذج أخرى النظام الغذائي الناجم عن مرآة أكثر من تفاقم تعمل، يعيد البناء واسع النطاق للأنسجة يمكن أن تشكل مشكلة أثناء الهضم الأنسجة. هفهكد تغذية الفئران "كو الذين" غالباً ما تستخدم لنموذج تصلب الشرايين و steatohepatitis. سمة مشتركة المرتبطة steatohepatitis متقدمة من ترسب المفرط لإدارة المحتوى في المؤسسة في الكبد (أو التليف). ما ثبت أنه يصعب جداً أثناء تفكك النسيج الانزيمية الكبد تليفية وغالباً ما تنتج الخلية منخفضة الغلة31. تحسين الغلة الخلية، من الأهمية بمكان اتباع بروتوكولات الهضم دون الانحراف. على الرغم من أن يمكن مفروم كبد طبيعية والمغمورة في المخزن المؤقت الهضم لتحقيق الانفصال، التروية مع المخزن المؤقت الهضم يزيد الاتصال بين المصفوفة خارج الخلية الكبد والحل كولاجيناز؛ و لذلك يوصي بشدة هذا النهج. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما 20-30 مل من المخزن المؤقت الهضم حجم مناسب للانفصال الناجح من كبد العادي؛ ومع ذلك، فيما يتعلق بنماذج الماوس أن تطوير كبد الموسع و/أو fibrotic، يفضل التروية مع 50 مل من المخزن المؤقت الهضم لضمان الهضم السليم مع التقليل من موت الخلايا. زيادة حجم المخزن المؤقت الهضم يوصي للكبد مع الأوزان التي تتجاوز 1.5 ز إلى حد كبير، لضمان نجاح عملية الهضم.

الأنسجةالمشكلةالسبب المحتملالحل
الأنسجة الدهنية البيضاء (وات)تفكك خلية الفقراءسوء الهضمتأكد من أن المخزن المؤقت الهضم في 37درجة مئوية
موت الخليةالهضم كولاجيناز المفرطةتقليل الوقت اللازم الهضم
تقليل حجم المخزن المؤقت الهضم
الشريان الاورطيتفكك خلية الفقراءسوء الهضمتأكد من أن المخزن المؤقت الهضم عند 37 درجة مئوية
تم قطع الشريان الاورطي في الهضم المخزن المؤقت كبير جداًتأكد من أن يتم قطع الشريان الاورطي أربا 1 ملم تقريبا
لا تهز قطع الشريان الاورطي في المخزن المؤقت للانفصال من خلال الاحتضانتأكد من قطع الشريان الاورطي تهز في الحل الهضم
موت الخليةالهضم كولاجيناز المفرطةتقليل الوقت اللازم الهضم
تقليل حجم المخزن المؤقت الهضم
الكبدتفكك خلية الفقراءسوء الهضمتأكد من أن المخزن المؤقت الهضم عند 37 درجة مئوية
زيادة حجم المخزن المؤقت الهضم
كانوليشن غير لائق من IVC (تورم أنسجة يحدث IVC المحيطة بها)تأكد من إدخال إبرة بشكل صحيح إلى IVC
IVC تمزقتأمين إبرة في IVC قبل التروية بشكل صحيح
تقليل سرعة التروية
تمزق الأنسجةتقليل سرعة التروية
موت الخليةالإصدار غير لائق من الخلايا في كبسولة جليسونومن المؤكد أن ننأى بالخلايا من استخدام كبسولة سبق الجرة الأسلوب
الهضم كولاجيناز المفرطةتقليل الوقت اللازم الهضم
تقليل حجم المخزن المؤقت الهضم

الجدول 3: استكشاف الأخطاء وإصلاحها تفكك النسيج فاشلة. التدفق الخلوي على أساس فرز الخلايا أو نظام مراقبة الأصول الميدانية تقنية قوية لعزل السكان الخلية حيث درجة نقاء عالية أمر ضروري. عند تنقية الخلايا بالخلية فرز، يتطلب تحقيق خلية عالية الغلة ولكن أيضا أشبه بدرجة نقاء عالية باستخدام استراتيجيات الفرز الصحيح. في هذا القسم، تدفق أساليب لتحسين fluorophore متعدد الخلية على أساس الخلوي الفرز الأنسجة موصوفة بلعم المقيم المستمدة من النظام الغذائي التي تتغذى الفئران. لعزل بلعم المقيم أنسجة متميزة، اختيار علامة السطحية خطوة حاسمة. الضامة المستمدة من وات والشريان الاورطي وهي الكبد وكثيراً ما يميز استخدام CD45+، CD11b+، F4/80+ النابضة الاستراتيجية. لوحات سيتوميتريك تدفق إضافية يمكن استخدامها لتحديد الأنسجة الضامة المقيم. هذه اللوحات تشمل الأجسام المضادة التي التحقيق للتعبير السطحي بلعم glycoproteins محددة (CD64 و CD68 و CD14)، هيستوكومباتيبيليتي الرئيسية المجمعات (مهسيي) وخلية apoptotic تيروزين كيناز المستقبلات (ميرتك)32، 33. النمط الظاهري بلعم محددة ثم يمكن أن تكون رسمتها إلى التدقيق في التعبير السطحي الانتقائي من M2 (CD163 و CD209 و CD206) أو M1 علامات (CD38 و CD40، CD80 و CD86)34،35. السيارات-الأسفار التي تولدها الضامة محملة بالدهن يمكن أن يقدم بعض القضايا عندما النابضة السكان. استخدام الأجسام المضادة الموسومة فلوروتشروميس متحمسون بالليزر الأصفر والأخضر (مثل PE، PE/Cy5، PE/Cy7) أو الليزر الأحمر (مثل آسيا والمحيط الهادئ، APC Cy7) ينتج المنبعثة من الأسفار التي أكثر إشراقا بكثير من السيارات-الأسفار وبالتالي يمكن تحسين 36من نتائج. عند اختيار fluorophore يرتبط مع هذه عالية المصبوغة الفهرس وإمكانات أطياف الانبعاث التداخل، إدراج عناصر التحكم المناسبة أمر بالغ الأهمية. عند تحديد حدود النابضة، إدراج عناصر تحكم مفردة وصمة عار (SS) وضوابط ايستب تسمح لتحديد السكان إيجابية/سلبية وقياس الإشارات الخلفية غير المحددة الناجمة عن الأجسام المضادة الأولية، على التوالي 37-للحالات التي تكون فيها الخلايا النادرة، نوصي باستخدام جزيئات التعويض لضوابط SS وايستب. جسيمات التعويض عادة تنبعث منها إشارات أكثر إشراقا من وسائل المكافحة البيولوجية وأيضا أن يكون أقل الفرق في الخلفية الفلورية. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر مثالية لترسيم الحدود النابضة fluorescence ناقص واحد (FMO) الضوابط. بها بما في ذلك الضوابط FMO، كشفت fluorescence الحد الأقصى المتوقع لمجموعة فرعية المصبوغة في قناة معينة عندما يكون جسم معلم فلوروتشرومي محددة لتلك القناة الأسفار خاصة المستبعدة38. في تجربتنا، بالإضافة إلى ضوابط الجسيمات التعويض الملون واحدة، ينبغي إدراجها عنصر تحكم مقارنة بيولوجية أونستينيد لتعيين حدود إيجابية/سلبية أكثر دقة.

باستثناء الحطام الخلوية ومجاميع الخلية في استراتيجية النابضة أيضا نهج إضافية تستخدم لتصغير تلقائي-الأسفار. التمييز بين الحطام الخلوية من السكان خلية قابلة للحياة، هو استخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) استراتيجية النابضة الأكثر شيوعاً. لعزل الخلايا التي سيتم استخدامها لوظيفة الفرز التحليلات وتتطلب بقاء أعلى لاستخراج الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي، من المستحسن أن بقاء البقع لا يمكن استخدامه مع أية إجراءات التثبيت و/أو بيرميبيليزيشن. فورمالدهايد تحديد الخلايا يمكن أن يعرض للخطر سلامة الحمض النووي نظراً للحمض النووي-بروتين crosslinking ومما يحد من كفاءة العزل والكشف والقياس الكمي الدقيق. خلية المجاميع كما ذكرنا من قبل لا يسهم إلا في إشارات السيارات-الفلورسنت المنبعثة، ولكن يؤدي أيضا إلى في "إحباط من قبيل الصدفة". يحدث مثل هذا الإجراء للحفاظ على درجة نقاء عالية في فرز ولكن إذا كانت متكررة جداً، فهو يقلل من العائد خلية تم فرزها. يمكن تقليل المخزن المؤقت الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة) تستكمل مع الدناز ومجكل2 خلال تلطيخ الخلية تجميع الخلايا. من المستحسن عدم استخدام يدتا في تركيبة مع الدناز كما أنه يثبط نشاط إنزيم. تصفية تعليق خلية مفردة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر قبل الفرز يمكن أيضا تحرير الخلايا من المجاميع. من الضروري ملاحظة أنه للتقليل من التراكم، ينبغي تعليق الخلية بتركيز الخلايا 5 مليون كل مل في حجم الحد أدنى لمل 0.4. الخلايا المعزولة من الأنسجة الدهنية لادن تميل إلى أن تكون أكثر عرضه للتجميع، ويمكن أن ينتج صدفة إحباط وفرز منخفضة الغلة. من المستحسن أن العينات يتم كذلك مخففة إذا استمرت التجميع. يمكن جمع الضامة تم فرزها في أنابيب البولي بروبلين أسفل المائدة المستديرة مجموعة تحتوي على الجنين المتوسطة الغنية الأبقار إلى أقصى حد خلية الإنعاش. بتركيز FBS أولية عالية يضمن استرداد الخلية نظراً للتركيز في نهاية المطاف تصبح مخففة مع كل قطره تم فرزها. جمع الخلايا التي سيتم استخدامها لتحليل الحمض النووي الريبي أو، يمكن فرز الخلايا مباشرة في الكاشف استخراج المناسبة (مثل تريزول) لمنع التلوث رناسي. عند فرز كميات كبيرة، فرز الخلايا أولاً إلى وسائط الثقافة تستكمل بتركيزات أقل من FBS، ينصح. مباشرة بعد الفرز، والخلايا ينبغي ثم القريبون وتفكيك لاستخراج الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي. ثم يمكن أن يكون لمحة عن المادة الوراثية المعزولة للتعبير الجيني غيرت. برو-التهابات الجينات بما في ذلك TNFα IL1-β وايل-6، وايل-12، 1 لتر-23، IFNγ، Nos2، و MCP1 (CCL2) غالباً ما تكون أوبريجولاتيد في الضامة العارضة النمط الظاهري (M1) المنشط كلاسيكي39. من ناحية أخرى، بدلاً من تنشيط النمط الظاهري (M2) في الضامة غالباً ما تتسم بتحريض الجينات ترميز Chi3l3 (Ym1)،34،Fizz1، 1 أرجيناسي، CD206، CD163، CD209 ل 1-10، و TGFβ40. في الآونة الأخيرة، CD38 و Fpr2 و Gpr18 وقد تم التحقق من صحة كجينات محددة M1 وج-حركة و Egr2 ك جينات محددة M234.

على الرغم من أن تدفق متعدد الألوان المستندة إلى الخلوي الخلية الفرز أداة قيمة لعزل الضامة في درجة نقاء عالية، وهذا النهج يمكن أن يكون مكلفاً. مزايا قوية لنظام مراقبة الأصول الميدانية بوساطة الفرز التي تعتمد على أفراد العمليات التي يمكن المناورة أرز خلية بالإضافة إلى التكلفة العالية للخلية فارز صيانة كواشف. يمكن استخدام نهج بديلة في بديلاً مكلفاً التدفق الخلوي على أساس الخلية الفرز. وهي تشمل خلية تنشيط مغنطيسية الفرز (ماك) أو الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. أول خلية البديلة الفرز الطريقة المذكورة تشمل المغناطيسي و/أو مجموعات العزلة عمود ميكروبيد لفصل خلايا فائدة من الدم أو الأنسجة الصلبة41. الخلية الثانية الفرز نهج يفصل تعليق خلية غير متجانسة على أساس كثافة وقوة الطرد المركزي. ولسوء الحظ، توسط الكثافة الطرد المركزي ليست عملية لعزل الضامة من الشريان الاورطي أو وات-المستمدة من تعليق خلية مفردة. في كثير من الأحيان، المنتج التي تم الحصول عليها من الطرد المركزي التفاضلي ملوثة، ومن انخفاض العائد. ونتيجة لذلك، أصغر من الأنسجة (مثل الشريان الاورطي أو وات) التي تؤدي في بعض الخلايا في البداية بعد الهضم الأنزيمي ليست مرشحا مثاليا للطرد المركزي التفاضلي. من ناحية أخرى، يمكن أن تنتج تعليق الخلية المستمدة من كبد ينتابها عدد كاف من الضامة المفروزة التي يمكن استخدامها في وظيفة الفرز التجارب والتحاليل مثل ثقافة التحفيز أو qPCR تحليل النشاف الغربية. يمكن أيضا استخدام هذه النهج البديلة لإثراء السكان قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية، مما يسمح لأنواع أنظف. من المذكرة، تجعل الأنسجة الضامة المقيمين نسبة مئوية صغيرة من السكان الخلية بأكملها في وات والكبد والشريان الاورطي. تم تخصيب الخلايا قبل الفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية نهج المستخدمة عند عزل سكان خلية التي أقل تواترا. قضية واحدة أمر شائع في عزل السكان صغيرة هي تلك الخلية كبيرة يجب معالجتها الأرقام للحصول على ما يكفي من خلايا للتحليل اللاحق. يمكن استخدام التخصيب أو الفرز المسبق لحل هذه مسألة. يساعد هذا الأسلوب في الحصول على عدد سكان أكثر إيجازاً من الخلايا عن طريق تحديد إيجابية وسلبية لكنه يسمح أيضا للحفاظ على الوقت نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز يمكن أن تكون عملية دائمة لمصادر الأنسجة الكثيفة مثل الكبد.

التقدم الذي أحرز مؤخرا في مجال البيولوجيا التهاب تسليط الضوء على أهمية توصيف المظهرية والوظيفية لتغاير سنخية مزيد من الفهم لدور المعقدة لهذه الخلايا المناعية في تنظيم التهاب مزمن. وباختصار، يوفر هذا البروتوكول الشامل اتباع نهج متعدد الأبعاد لوصف الأنسجة الضامة المقيمين من أنسجة مميزة ثلاث درس في الحمية المتبعة الناجمة عن السمنة والتهاب في نماذج. والأهم من هذا البروتوكول ويأخذ في الاعتبار الصعوبة والتدابير اللازمة لعزل نظيف واحد تعليق خلية من dysregulated التهاب الأنسجة مثل وات ولويحات الابهر والكبد الدهني. ويسمح البروتوكول الباحث لتطبيق التدفق الخلوي وأدوات نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز في بعدا مبتكرة تميز الأنسجة الضامة المقيم، المنظمين الرئيسيين لالتهاب في السمنة. توصيف المتعمقة للديناميات السكانية بلعم يمكن أن توفر نظرة ثاقبة الوحيدات الاتجار في الأنسجة الملتهبة وتسمح باستمرار التقييمات آليا من خلال العديد من النهج التجريبي في الضامة المفروزة. يمكن تقديم توصيف المزيد من السكان بلعم فكرة محورية في الأسس البيولوجية التي تنظم تغاير سنخية في الصحة والمرض.

Disclosures

وقد المؤلف لا تضارب في المصالح بالكشف عن.

Acknowledgements

نود أن نشكر "التدفق الخلوي المرفق الأساسية" في "جامعة بنسلفانيا الدولة الألفية العلوم المعقدة".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
26 G x 5/8 in NeedlesBD305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection SetBD367297Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. NeedlesBD305156
1 mL syringe with rubber stopsBD309659
10 mL SyringesBD309604
1 mL SyringeBD309659
F4/80 PEBiolegend123110
CD11c PE/Cy7Biolegend117318
CD11b PE/Cy5eBioscience15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block Biolegend101320
CD45 Pacific BlueBiolegend103126
PE Rat IgG2aBiolegend400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgGBiolegend400922
PE/Cy5 Rat IgG2bBiolegend400610
Pacific Blue Rat IgG2cBiolegend400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)Cellgro21-031-CV
70 μm cell strainersCorning, Inc.352350
1.7 mL microcentrifuge tube DenvilleC2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16xElectron Microscopy SciencesCAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp Stoelting52132-10PUsed for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mmStoelting52102-37P Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge Fine Science Tool15000-10Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip ForcepsFine Science Tool11297-10Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved)Fine Science Tool13021-12
Heparin Sodium SaltFischer Scientific9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri DishesFischer Scientific12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lidFischer Scientific08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)Fischer Scientific14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)Fischer Scientific14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes Fischer Scientific14-959-5
Fetal Bovine SerumGemini Bio-Products100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)MilliporeEX0285-1
Bovine Serum AlbuminRocklandBSA-50
HEPESSigma-AldrichH3375
Collagenase Type IISigma-AldrichC6885
Collagenasse Type XISigma-AldrichC7657
Hyaluronidase Type ISigma-AldrichH3506
DNAseSigma-AldrichDN25
Collagenase Type ISigma-AldrichC0130
NaOHSigma Aldrich1310-73-2 
CaCl2Sigma Aldrich449709-10G
500 mL beaker Sigma Aldrich02-540M
4 cm Hemostatic clampStoelting52120-40
Toothed forcepsStoelting52104-33P
50 μm Disposable filtersSystemex04-0042-2317
Collagenase Type IVThermoFischer Scientific17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK)ThermoFischer Scientific A1049201
Razors (0.22 mm (0.009"))VWR International55411-050
Texas Red Live/Dead stainRed viability stain (in Figure 1A)

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546(2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174(2014).
  25. Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: http://munin.uit.no/handle/10037/4575 1-10 (2012).
  26. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848(2011).
  27. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).
  28. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  29. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
  30. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  31. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
  32. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
  33. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
  34. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
  35. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  36. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
  37. Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
  38. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
  39. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13(2014).
  40. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
  41. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved