ヒト子宮頸管ガンマ・デルタT細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

女性の生殖器官（FRT）粘膜免疫系は防御の第一線として機能します。性器粘膜のより良い知識は、HIVを含む異なる病原体の病原性を理解するために不可欠です。ガンマデルタ（GD）T細胞が「非在来型」T細胞の原型であり、γおよびδ鎖からなるヘテロ二量体、T細胞受容体（TCR）の発現によって定義されるT細胞の比較的小さな部分集合を表します。これは、α-βのTCRによって定義される古典的なはるかによく知られているCD4 ⁺ヘルパーT細胞およびCD8 ⁺細胞傷害性T細胞から離れてそれらを設定します。 GD T細胞は、多くの場合、組織特異的局在化を示し、上皮に濃縮されます。 GD T細胞は、炎症、腫瘍監視、感染性疾患、および自己免疫における免疫応答を調整します。

ここでは、再現性のヒト子宮頸管上皮内GD Tリンパ球を分離し、分析するための方法を提示します。我々ヘクタール女性の省庁間のHIV感染に関する研究（WIHS）に参加した女性から使用子宮頸管細胞採取用ブラシサンプルVEの。膣粘膜の傷害が存在である条件中GD T細胞相互作用についての知識は、粘膜GD T細胞応答についての知識があり、膣microbicides.In追加の開発を含む、粘膜の脆弱性に対処している任意の臨床試験に適用することができます感染性疾患の治療におけるGD T細胞ベースの免疫療法の適用のための潜在。

我々は、上皮内GD T細胞を評価するために、子宮頸管ブラシサンプルを使用する方法を開発しました。子宮頸管は円柱上皮の単層によって裏打ちされています。上皮内リンパ球は急速に病原性微生物^7、8に遭遇すると、免疫応答を開始することができ、上皮層内に存在する現場のリンパ球を表します。子宮頸管上皮内コンパートメントの免疫学的事象を理解することは、HIVを含む感染を防止するための効果的な戦略の設計のために重要です。

私たちの方法は、さらに、HIV感染またはHIV感染のリスクがある女性では上皮内GD T細胞の役割を探求するために新鮮に採取したヒト子宮頸管のサンプルと同様に凍結した子宮頸管細胞に適用することができます。このプロトコルの主な目的は、子宮頸管上皮内コンパートメントにおける新規免疫学的事象を発見し、evaluatことですHIV感染女性における粘膜の脆弱性のマーカーとしての電子GD T細胞応答。

FGTの免疫周りの知識の大幅なギャップが部分的に成功した粘膜サンプルを収集し、処理の難しさに起因しています。また、複雑な粘膜免疫細胞の不均一性、および互いにそれらの相互関連性は、免疫系の状態と機能を反映する臨床的に関連する測定値を識別することに大きな課題です。我々はさらに、FRT免疫の基礎となるメカニズムを同定するために重要であり得る非常に多重化され、単一細胞技術を用いて分析することができる高度に精製された上皮内GD T細胞を得るための方法を開発しました。

研究活動は、マイアミの女性のHIV省庁間研究（WIHS）と承認が前に得られたエイズ研究のためのマイアミセンター（CFAR）.Institutional審査委員会（医学のマイアミミラー科大学）と共同で大学マイアミのHIV研究ユニットで開催されました募集及び任意の評価や研究関連手順へ。

1.子宮頸管ブラシサンプル採取

注：参加者は、訓練を受けたMDや婦人科医と細胞採取用ブラシを挿入することにより、鏡検査下で実施した上皮内リンパ球の集合によって行わ膣の検査を受けました。

1. 参加者の特徴
   1. 性的に、アクティブ妊娠していないではなく、避妊薬上または子宮内のデバイスとの年齢、18〜45年を老化させる女性の参加者を募集。
   2. 膣の検査の前に、参加者は緑で10 mLの採血を受けています末梢血単核細胞（PBMC）を単離するためのトップヘパリンバキュテナー。子宮頸管上皮内分析⁹の制御として機能します。
2. 子宮頸管サンプルの収集
   1. 無給油で膣内に適当なサイズの滅菌鏡を挿入します。粘液をきれいに検鏡し、滅菌ガーゼの挿入を容易にするために暖かい水を使用してください。鏡の位置は、OSや子宮膣部の完全な可視化を可能にします。
   2. 手に最も近いだけ毛が表示されるまで、子宮頸管に子宮頸管ブラシを挿入します。 360°用のブラシを時計回りに回転させます。 IMDM培地5mlを含む15 mLのチューブにブラシを転送します。
   3. すぐに収集した後、氷上で細胞採取用ブラシを含むチューブを置きます。収集した上皮内細胞の高い生存率を得るためには、1時間以内に研究室およびプロセスへの細胞採取用ブラシを提供します。

2。子宮頸管細胞採取用ブラシサンプル処理

1. 4短い（10秒）ストロークを適用頸管細胞採取用ブラシを含む渦管。
2. 250×gで10分間、細胞採取用ブラシを含む遠心チューブ。
3. 慎重にチューブから細胞採取用ブラシを削除する（チューブの底にペレットを乱さないでください）、IMDM培地の1ミリリットルを追加し、チューブを氷上に置きます。
4. 50mlのチューブの上に100ミリメートルのセルストレーナーに細胞採取用ブラシを置きます。
5. 20ミリリットルのIMDMで細胞採取用ブラシを洗ってください。
6. 250×gで10分間遠心分離管。
7. 上清を除去し、ペレット化した細胞を1mLのIMDMに再懸濁し、2.3に記載され、すでに再懸濁ペレットと組み合わせます。
8. 自動細胞計数器^10を用いて細胞数をカウントしたり、トリパンブルー色素の10μLでの細胞懸濁液10μLを組み合わせることにより、血球計数器を用いて細胞数を計測します。優しく細胞と色素を混合するまでピペット上下10倍。負荷10μL2血球計数器のチャンバのいずれかの開口部に混合物の。 5グリッド領域内のすべてのセルを数えます。実行可能な非生存細胞の別々のカウントを保持。以下の式を用いて細胞生存率を決定する：％生存細胞=非生存細胞×100 /総細胞数の細胞。
   以下の計算を使用して、1ml当たり、その後の細胞濃度（細胞の合計数）を決定します。 1ml当たりの全細胞は=全細胞カウントX（希釈係数/カウント正方形の数）は10,000細胞/ mlにxは。
9. 10％DMSOおよび90％FBSを含む凍結培地を用いて、単離された子宮頸管細胞を凍結します。

3.フローサイトメトリー

1. 再懸濁1％ウシ血清アルブミンを含有する100μLのFACS緩衝液中に1-3×10 ⁵子宮頸管細胞（PBS
2. 1μL/ 10 ⁶ 表1に記載の濃度で表面マーカーのためのLIVE / DEAD修正可能イエロー死細胞染色キットおよび抗体を追加します。
3. 光から保護して4℃で30分間、細胞をインキュベートします。
4. 350×gで5分間、1mLのFACS緩衝液細胞および遠心管を追加
5. 300μLの1％パラホルムアルデヒドで細胞ペレットを再懸濁します。
6. FACS緩衝液100μLビーズの一滴、サンプル染色のために使用される抗体と同じ濃度を添加することにより、染色に使用されるビーズと抗体を使用して補正制御を準備します。
7. 405 nmで、488 nmの、および635nmのレーザーを搭載したフローサイトメーター、上の染色されたビーズとサンプルを取得します。

4.子宮頸管ガンマデルタT細胞の単離

1. 磁気ビーズ分離
   1. 再懸濁材料および試薬の表で参照TCRガンマデルタマイクロビーズキットに含まれるバッファの40μLで、2.6で説明した子宮頸管細胞ペレット^（≤107総細胞）を、。
   2. まず、ウィット：2段階の染色プロトコールのためのキットの指示に従ってください抗ハプテンマイクロビーズ-FITCを有する第二のH抗TCRガンマデルタハプテン - 抗体と、
   3. 4~8℃で15分間インキュベートした後、10分間、300×gで遠心分離緩衝液の1ミリリットルを加えることによって細胞を洗浄します。チューブを反転させて上清を除去し、一枚の紙の助けを借りて乾燥タップします。
   4. 提供バッファーの500μLで細胞ペレットを再懸濁し、ベンダーのプロトコルに従って適切な磁気分離器に置くことで磁気カラムを準備します。
   5. カラムに細胞懸濁液を適用し、通過する非標識細胞を収集し、バッファの適切な量（500μL）でカラム3回洗います。列のリザーバが空になると、バッファたびに3回を追加することにより、洗浄工程を実行します。総流出物を収集します。これは非標識、負の細胞画分であります
   6. 列を削除するカラムに磁気分離器およびピペット1mlの緩衝液を形成し、直ちに磁気ラベルで端数を洗い流しますしっかりカラム付属のプランジャーを適用することによって細胞を編
      注：磁気標識された抗ハプテンマイクロビーズを蛍光色素FITCとコンジュゲートされているため、単離されたガンマデルタT細胞は、すでに蛍光フローサイトメトリー分析のために染色されています。
2. 細胞選別
   1. セクション3で説明したように細胞選別のために、生存能力のダイと抗体パネルと子宮頸管細胞を標識。
   2. ライブ、CD45 ⁺ CD3 ^+、ガンマデルタ陽性細胞上の電子ゲートを設定し、細胞選別を行います。

最近、我々は子宮頸管上皮内GD T細胞を分析し、我々はHIVに感染した女性では子宮頸管ガンマデルタT細胞の喪失^9、11について報告する最初のものでした。ここでは、隔離し、子宮頸管ガンマデルタT細胞のサブセットを分析するためのプロトコルについて説明します。 図1に示すように 、GD T細胞は、容易にヒト子宮頸管細胞サンプル中で検出することができます。

子宮頸管ガンマデルタV1（GD1）T細胞のユニークな集団はmultiparametarサイトメトリーベースの免疫表現（ 図1）を用いてフローについて説明しました。 HIV感染していない子宮頸管試料についての代表的なゲーティング戦略は、図1に示されています。分析は、トンに続いて前方/側方散乱（ 図1A）に電子ゲートを設定することにより、全子宮頸管細胞について行きました細胞ダブレット（ 図1B）の彼は除外。生存細胞は、LIVE / DEAD修正可能イエローアミン死細胞染色（ 図1C）を使用して、死細胞の排除によって定義されていました。 CD45発現の分析は、CD3発現の分析（ 図1E）、続いてライブゲート細胞（ 図1D）で行いました。ガンマデルタ1（GD1）またはガンマデルタ2（GD2）陽性細胞はGD TCR（TCRガンマデルタV1またはTCRガンマデルタV2）を発現するCD3 ⁺細胞の亜集団と定義しました。さらに、それは唯一のCD3 ⁺ T細胞がゲートさCD3からTCRガンマデルタを発現することが確認された^- T細胞は、TCRガンマデルタV1またはデルタV2を発現しません。 CD8 ^-明らかにゲートさCD3 ⁺ GD1 ⁺細胞（ 図1G）の表現型分析は、GD1細胞の大部分（約74％）は、CD4 ^-です。

利用endoceの本研究では、実現可能性正の磁気選択により上皮内GD T細胞を精製するrvicalブラシサンプルを（ 図2）証明されました。

図1： ガンマデルタ（GD）、フローサイトメトリーによって分析子宮頸管粘膜におけるT細胞亜集団。以下のゲーティング戦略は、識別された子宮頸管のT細胞集団を使用した：（A）子宮頸管細胞採取用ブラシ細胞はサイズと粒度（FSC、SSC対前方側方散乱、側方散乱）に従ってゲートしました。 （B）細胞ダブレットは、SSC-W対FSC-A（面積）（幅）に電子ゲートを設定することによって除外されました。 （C）ライブ細胞が生存性色素陰性集団にゲートされます。 （D）電子ゲートは、ライブ、CD45陽性細胞にセットしました。 CD45陽性細胞のための（E）電子ゲートは、CD3陽性細胞にセットし、（F）TCRVD1（GD1）とTCRVD2（GD2）の発現は、CD3 ⁺細胞上で分析しました。 （G）、CD4及びCD8の発現はGD1 +細胞上で分析しました。 （H）TCRVD1とTCRVD2発現は、ゲーティングCD3陰性細胞で分析しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2： 正の磁気分離による子宮頸管ガンマデルタT細胞（GD）の単離。子宮頸管GD T細胞の頻度は、正の磁気分離の前後を確認しました。子宮頸管細胞を最初に抗TCRガンマデルタ抗体で標識し、次いで蛍光抗ハプテンマイクロビーズ-FITCで染色しました。 TCR GD + T細胞のパーセントは、Mの前後に報告されましたagnetic分離。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

女性の下部生殖管の粘膜の脆弱性の評価は、HIV取得送信のリスクに対処する臨床試験の必須成分です。典型的には、HIV感染にFGTの脆弱性が性器分泌物（サイトカイン、ケモカインおよび抗菌ペプチド^）12、13中の可溶性免疫調節を測定することによって評価されます。しかし、これらのバイオマーカーは、膣の炎症しか示している生理学的および病理学的事象の影響を受けている、と常に直接粘膜損傷を表すものではありません。粘膜因子がHIVを取得し、送信のリスクを増加させる方法の我々の理解を向上させるために、粘膜損傷の細胞マーカーを開発する必要があります。 GD上皮内T細胞は、上皮細胞間のインターカレーFGTに存在し、ホメオスタシスにだけでなく、環境問題に対する防御の第一線に貢献すると考えられています。 GD T細胞はpotenを持っています FGT内粘膜の脆弱性を評価するための追加のバイオマーカーを構成するのTiAl。

このプロトコルでは、ヒト子宮頸管細胞採取用ブラシサンプルから上皮内リンパ球を調製するために、容易に習得する方法を示しています。このプロセスの最も重要な点は、サンプルの高速処理によってだけでなく、全体の手順の間、氷上で細胞を維持することによって細胞生存率を維持することです。細胞収率は、スキルだけでなく、感染性の状態（HIV感染または他のウイルス感染、細菌や真菌感染）を取り扱い、細胞採取用ブラシコレクションの技術に依存します。私たちのグループと他の人が人間の生殖器^9、14、15に異なるリンパ球集団を記述する種々の研究を発表しています。私たちの手で、1子宮頸管細胞採取用ブラシのサンプルは、80〜90％の生存率は0.5〜5×10 ⁶個^の細胞を提供することができます。一般的に使用される単離法と比較してクラスは、= "外部参照"> ^14、15、我々の方法により、生存率および細胞収量を増加させます。

この方法は、強力かつ子宮頸管上皮内ガンマデルタTリンパ球を研究するため、感染および/または炎症中にこの区画に移行する他の免疫細胞への洞察を提供することができる効率的なツールを提供します。粘膜組織のインビボの細胞組成物は、多くの場合、包括的かつ定量的な方法で調査することは困難です。例えば、および免疫組織化学のような技術は、フローサイトメトリー、抗原特異的なモノクローナル抗体の利用可能性によって、および個々のセルに対して行うことができる並列測定の小さい数によって制限されているフロー。このような遺伝子発現アレイなどの伝統的なハイスループットアッセイ、平均遺伝子発現レベルに関する情報を提供し、組織全体で実行され、間接的にのみ細胞の亜集団の量的改変に相関させることができます。これらの制限は、少数派集団、または排他的なマーカーを欠く細胞集団を研究する際に克服するために特に困難になります。 （FACS）、「蛍光活性化細胞選別」と「シングルセルPCR遺伝子発現解析」を組み合わせることにより、1は子宮頸部上皮内におけるGD T細胞のハイスループット転写解析を行うことができます。この方法は、それによって、最大96の遺伝子の発現の平行分析を可能にする、mRNAの微量から高感度多重PCRをプリフォームするために、マイクロ流体技術の使用と一緒に、正確さと精度を持つ個々の単一細胞を選別するために近代的なフローサイトメーターの能力を活用します個々のセル¹⁶のために。

著者らは、利害の衝突をもたらす可能性がありコマーシャルまたは他の関連を持っていない（ 例えば 、製薬株式所有権、コンサルティング、アドバイザリーボードのメンバーシップ、関連特許、または研究資金）。

私たちは、この作業に参加する意欲のためにマイアミWIHSの研究参加者に感謝します。この原稿のデータは、マイアミの女性の省庁間HIV研究（WIHS）により回収しました。本書の内容はもっぱら著者の責任であり、国立衛生研究所（NIH）の公式見解を示すものではありません。この作品は、前進のための国立アレルギー感染症研究所と女性の省庁間のHIV感染の研究（WIHS）[助成金番号U01のAI103397]、アレルギーと国立感染症研究所、国立衛生研究所[助成金番号P30AI073961]、ナショナルセンターによってサポートされていましたトランスレーショナル科学とマイノリティの健康と健康格差に国立研究所、国立衛生研究所[助成金番号UL1TR000460と1KL2TR000461]、および国立小児保健発育研究所、国立衛生研究所[承認番号K23HD074489]。