Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

El tracto reproductivo (FRT) del sistema inmune de la mucosa femenina sirve como la primera línea de defensa. Un mejor conocimiento de la mucosa genital tanto, es esencial para la comprensión de la patogenicidad de diferentes patógenos, incluyendo el VIH. Gamma delta células (GD) T son el prototipo de células T "no convencionales" y representan un grupo relativamente pequeño subconjunto de células T definidas por su expresión de receptores de células T (TCR) heterodiméricas compuestas de cadenas gamma y delta. Esto los diferencia de las células T clásicos y mucho mejor conocidos CD4 ⁺ helper y células T citotóxicas CD8 ⁺ que están definidas por los TCR alfa-beta. GD células T a menudo muestran la localización específica de tejido y se enriquecen en el epitelio. células T GD orquestan la respuesta inmune en la inflamación, la vigilancia de tumores, enfermedades infecciosas, y la autoinmunidad.

A continuación, presentamos un método para aislar y analizar los linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos GD T reproducible. nos hacinco muestras endocervicales cytobrush utilizados de mujeres que participan en el Estudio de la Infección por VIH Interinstitucional de la Mujer (WIHS). El conocimiento acerca de GD células T interacciones durante las condiciones en las que hay un insulto a la mucosa vaginal se podría aplicar a cualquier estudio clínico en el que se dirige la vulnerabilidad de la mucosa, incluyendo el desarrollo de la adición microbicides.In vaginal, el conocimiento de las respuestas de células de la mucosa GD T tiene potencial para la aplicación de la terapia inmune basada en células T GD en el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Desarrollamos metodología de la utilización de muestras de cepillo endocervical para evaluar las células T intraepiteliales GD. El canal cervical está recubierto por una sola capa de epitelio columnar. Linfocitos intraepiteliales representan linfocitos de primera línea que residen dentro de la capa epitelial que rápidamente pueden iniciar la respuesta inmune al encontrarse con microbios patógenos ^{7, 8.} La comprensión de los eventos inmunológicos del compartimiento intraepitelial endocervical es importante para el diseño de estrategias eficaces para prevenir las infecciones, incluido el VIH.

Nuestro método se puede aplicar para muestras endocervicales humanas recién recogidos, así como células endocervicales congelados para explorar aún más el papel de las células T GD intraepiteliales en mujeres con infección por VIH o en riesgo de infección por el VIH. El principal objetivo de este protocolo es descubrir nuevos eventos inmunológicos en el compartimiento intraepitelial endocervical y para evaluatlas respuestas de células T e GD como un marcador de la vulnerabilidad de la mucosa en mujeres con infección por VIH.

Las lagunas en el conocimiento en torno a la inmunidad FGT se deben en parte a la dificultad en la recolección y procesamiento de muestras de mucosa con éxito. Por otra parte, el complejo de la heterogeneidad de las células inmunológicas de las mucosas, y su interconexión con otros, son los principales retos para la identificación de medidas clínicamente relevantes que reflejan el estado y la capacidad del sistema inmunológico. Hemos desarrollado un método para obtener células T intraepiteliales GD altamente purificadas que pueden ser analizados utilizando tecnologías altamente multiplexados, unicelulares que pueden ser críticos para la identificación de los mecanismos subyacentes de la inmunidad FRT más.

Las actividades de estudio se llevaron a cabo en la Universidad de la Unidad de Investigación del VIH de Miami, en colaboración con Estudio de Mujeres Miami VIH Interagencial (WIHS) y el Centro de Miami para la Investigación del SIDA (CFAR) .Institutional Junta de Revisión (Universidad de Miami Miller School of Medicine) se obtuvo la aprobación previa a la contratación y los procedimientos de evaluación o estudio relacionado.

1. Recogida de muestras endocervicales Cepillo

NOTA: Los participantes se sometieron a un examen vaginal realizado por MD entrenado o ginecólogo y colección de los linfocitos intraepiteliales fueron realizadas bajo examen con espéculo mediante la inserción de citocepillo.

1. características de los participantes
   1. Reclutar mujeres participantes que tienen edades comprendidas de 18 a 45 años de edad, sexualmente activas, no embarazadas y no en medicamentos anticonceptivos o con un dispositivo intrauterino.
   2. Antes de la exploración vaginal, pida a los participantes se someten a un retiro de 10 ml de sangre en verdetop tubos al vacío de heparina para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). para servir como control para el análisis intraepitelial endocervical ^9.
2. Recolección de las muestras endocervicales
   1. Insertar un espéculo estéril del tamaño adecuado en la vagina sin lubricación. Use un agua caliente para facilitar la inserción del espéculo y gasa estéril para limpiar el moco. La posición del espéculo permite la visualización completa del sistema operativo y el exocérvix.
   2. Inserte cepillo endocervical en el conducto cervical hasta que sólo las cerdas más cercanos a la mano son visibles. Girar el cepillo de las agujas del reloj para 360 °. Transferir el cepillo en un tubo de 15 ml que contenía 5 ml de medio IMDM.
   3. Inmediatamente después de la recolección, se coloca el tubo que contiene citocepillo en hielo. Para obtener una alta viabilidad de las células intraepiteliales recogidos, entregar el citocepillo al laboratorio y proceso dentro de 1 h.

2. Endocervical Procesamiento de Muestras citocepillo

1. tubo de vórtice que contiene citocepillo endocervical la aplicación de 4 tiempos (10 seg) cortos.
2. Centrifugar el tubo, que contiene cytobrush, durante 10 minutos a 250 x g.
3. Retire cuidadosamente la cytobrush desde el tubo (no molestar el sedimento en el fondo del tubo) y se añade 1 ml de medio IMDM y colocar el tubo en hielo.
4. Coloque el cytobrush en el filtro de células 100 mm en la parte superior del tubo 50 ml.
5. Lavar el citocepillo con 20 ml de IMDM.
6. Tubo de centrífuga durante 10 min a 250 x g.
7. Se decanta el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 1 ml de IMDM y se combinan con el sedimento se volvió a suspender ya descrito en el punto 2.3.
8. Contar las células usando un contador de células automatizado ¹⁰ o contar las células usando un hemocitómetro mediante la combinación de 10 l de la suspensión celular con 10 l de colorante azul de tripano. pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo diez veces para mezclar las células y el tinte. Carga de 10 lde la mezcla en la abertura de una de las dos cámaras de hemocitómetro. Contar todas las células en las cinco áreas de la cuadrícula. Mantenga un recuento separado de las células viables y no viables. Determinar la viabilidad celular utilizando la siguiente fórmula:% de células viables = células no viables x 100 células totales / número de células.
   Determinar la concentración posterior de células por ml (y el número total de células) usando los siguientes cálculos. Las células totales por ml x = células totales contadas (factor de dilución / número de cuadrados contados) x 10.000 células / ml.
9. Congelar las células endocervicales aislados utilizando medio de congelación que contiene 10% de DMSO y 90% de SFB.

3. citometría de flujo

1. Vuelva a suspender 1-3 x 10 ⁵ células endocervicales en 100 l de tampón FACS (PBS que contiene 1% de albúmina de suero bovino
2. Añadir 1 l / 10 ⁶ LIVE / DEAD kit Muerto Amarillo corregible de la mancha de células y anticuerpos para marcadores de superficie en las concentraciones descritas en la Tabla 1.
3. Se incuban las células durante 30 minutos a 4 ° C, protegido de la luz.
4. Añadir 1 ml de tampón FACS y las células y los tubos de centrífuga durante 5 minutos a 350 xg
5. Vuelva a suspender el sedimento celular en 300 l 1% de paraformaldehído.
6. Preparar los controles de compensación usando perlas y los anticuerpos utilizados para la tinción mediante la adición de 100 l de tampón de FACS y una gota de las perlas y la misma concentración de los anticuerpos utilizados para la tinción de la muestra.
7. Adquirir perlas de colores y muestras en un citómetro de flujo, equipado con 405 nm, 488 nm y 635 nm láseres.

4. aislamiento de células endocervicales gamma delta T

1. Aislamiento de perlas magnéticas
   1. Vuelva a suspender el sedimento celular endocervical (≤10 ⁷ células totales), se describe en 2.6, en 40 l de tampón incluido en el kit de microperlas gamma delta TCR referencia en la tabla de Materiales y Reactivos.
   2. Siga las instrucciones del juego para protocolo de tinción de dos pasos: en primer lugar, el ingenioh anti-TCR gamma delta hapteno-anticuerpo y el segundo, con anti-hapteno microperlas-FITC
   3. Después de la incubación de 15 min a 4-8 ° C, se lavan las células mediante la adición de 1 ml de tampón y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. Decantar el sobrenadante invirtiendo el tubo, y toque seco con la ayuda de un trozo de papel.
   4. Vuelva a suspender el sedimento celular en 500 l de tampón proporcionado y preparar la columna magnética, colocándolo en un separador magnético adecuado de acuerdo con el protocolo del proveedor.
   5. Aplicar la suspensión celular en la columna y recoger las células no marcadas que atraviesan la columna y lavar 3 veces con cantidad apropiada de tampón (500 l). Realizar las etapas de lavado mediante la adición de tampón tres veces, cada vez una vez que el depósito de la columna está vacía. Recoger efluente total. Esta es la fracción de células sin marcar, negativo
   6. Eliminar la columna forman el separador magnético y una pipeta de 1 ml de tampón en la columna y de inmediato a eliminar fracción con la etiqueta magnéticamentecélulas ed aplicando firmemente el émbolo suministrado con la columna.
      NOTA: gamma-delta, aislada de células T ya están manchadas con fluorescencia para el análisis por citometría de flujo, ya marcadas magnéticamente microperlas anti-hapteno se conjugan con FITC colorante fluorescente.
2. la clasificación de células
   1. Para la clasificación de células, la etiqueta células endocervicales con troquel viabilidad y panel de anticuerpos tal como se describe en la sección 3.
   2. Configurar puertas electrónicas en el vivo, CD45 ⁺ CD3 ⁺ y delta gamma células positivas y llevar a cabo la clasificación de células.

Recientemente, se analizaron las células T intraepiteliales GD endocervicales y que fueron los primeros en reportar sobre la pérdida de células T gamma delta endocervical en mujeres infectadas por el VIH ^{9, 11.} Aquí, se describe el protocolo para aislar y analizar el subconjunto de células T gamma delta endocervical. Como se muestra en la Figura 1, las células T GD pueden ser detectados fácilmente en las muestras de células endocervicales humanos.

Una población única de células de V1 (GD1) T gamma delta endocervical fue descrito utilizando multiparametar flujo immunophenotyping basado en citometría (Figura 1). Una estrategia gating representante para el VIH muestra endocervical no infectado se muestra en la Figura 1. El análisis se realizó sobre las células endocervicales totales mediante el establecimiento de la puerta electrónica de dispersión frontal / lateral (Figura 1A), seguido de tque la exclusión de dobletes de células (Figura 1B). Las células viables se definen por exclusión de células muertas utilizando LIVE / DEAD corregible amarillo Amina las manchas Dead Cell (Figura 1C). Análisis de la expresión CD45 se realizó en células vivas cerradas (Figura 1D), seguido por el análisis de la expresión de CD3 (Figura 1E). Gamma delta 1 (GD1) o gamma delta 2 se definieron (GD2) células positivas como un subpoblación de células CD3 ⁺ que expresan GD TCR (TCR gamma delta V1 o TCR gamma delta V2). Además, se confirmó que sólo las células T CD3 ⁺ expresan TCR delta gamma desde CD3 cerrada ^- células T no expresan TCR gamma delta V1 o V2 delta. El análisis fenotípico de las células CD3 ⁺ cerradas GD1 ⁺ reveladas (Figura 1G), que la mayoría de las células GD1 (~ 74%) son CD4 ^- CD8 ^-.

En el presente estudio, la viabilidad de la utilización de endocervical muestras del pincel a las células intraepiteliales purificados GD T por selección magnética positiva se demostró (Figura 2).

Figura 1: Gamma Delta subpoblación de células (GD) T en la mucosa endocervical analizadas por citometría de flujo. Siguiendo la estrategia de gating se utilizó para poblaciones de células T identificados endocervical: fueron cerrada células endocervicales cytobrush (A) según el tamaño y la granularidad (FSC, delantero dispersión lateral vs SSC, dispersión lateral). (B) dobletes de células fueron excluidos mediante el establecimiento de las puertas electrónicas en el FSC-A (área) frente al SSC-W (ancho). (C) Las células vivas son una verja en la población de tinte negativo viabilidad. (D) Puerta electrónica se encuentra en las células positivas en vivo, CD45. (E) Puerta electrónica de células CD45 positivas se fijó en las células CD3 positivas(F) TCRVD1 (GD1) y TCRVD2 expresión (GD2) se analizó en las células CD3 ^+. (G) CD4 y CD8 expresión se analizó en las células GD1 +. (H) TCRVD1 y expresión TCRVD2 se analizó en las células CD3 negativas cerradas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Aislamiento de células gamma delta T endocervicales (GD) por separación magnética positiva. Frecuencia de células T GD endocervicales se confirmó antes y después de la separación magnética positiva. Células endocervicales se marcaron primero con el anticuerpo gamma-delta, anti-TCR y luego con fluorescencia teñidas con anti-hapteno microperlas-FITC. Porcentaje de células T TCR GD se informó antes y después de magnetic separación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Evaluación de la vulnerabilidad de la mucosa del tracto genital inferior femenino es un componente esencial de los estudios clínicos que abordaron riesgo de adquisición y transmisión del VIH. Típicamente FGT vulnerabilidad a la infección del VIH se evalúa midiendo moduladores inmunes solubles en las secreciones genitales (citoquinas, quimioquinas y péptidos antimicrobianos) ^{12, 13.} Sin embargo, estos biomarcadores son sólo indicativos de inflamación vaginal, se ven afectados por los acontecimientos fisiológicos y patológicos, y no siempre representan daño de la mucosa directa. Con el fin de mejorar nuestra comprensión de cómo los factores de la mucosa aumentan el riesgo de contraer y transmitir el VIH, marcadores celulares de la lesión de la mucosa necesitan ser desarrollados. células GD intraepitelial T están presentes en el FGT, se intercalan entre las células epiteliales, y se cree que contribuyen a la homeostasis, así como a una primera línea de defensa contra el medio ambiente. GD células T tienen el poten TIAL para constituir un biomarcador adicional para evaluar la vulnerabilidad de la mucosa en la FGT.

En este protocolo, se muestra cómo preparar los linfocitos intraepiteliales de la muestra endocervical citocepillo humana y es fácil de dominar. El punto más crítico de este proceso es para mantener la viabilidad celular mediante el procesamiento rápido de la muestra, así como manteniendo las células en hielo durante todo el procedimiento. El rendimiento celular dependerá de la técnica de recolección citocepillo, habilidad, así como el estado infecciosa (infección por el VIH u otras infecciones virales, bacterianas o infecciones por hongos) la manipulación. Nuestro grupo y otros han publicado varios estudios que describen diferentes poblaciones de linfocitos en el tracto genital humana ^{9, 14, 15.} En nuestras manos, una muestra endocervical cytobrush puede proporcionar 0,5-5 x 10 ⁶ células con 80 a 90% de viabilidad. En comparación con el método de aislamiento utilizado comúnmenteclass = "xref"> ^{14, 15,} por nuestro método se aumenta el rendimiento y la viabilidad celular.

Este método proporciona una herramienta eficaz para estudiar intraepitelial gamma delta T linfocitos endocervicales y podría dar una idea de otras células inmunes que migran a este compartimiento durante la infección y / o inflamación de gran alcance y. La composición celular in vivo de tejidos de las mucosas es a menudo difícil de investigar de manera exhaustiva y cuantitativa. Las técnicas tales como inmunohistoquímica y citometría de flujo están limitadas por la disponibilidad de anticuerpos monoclonales específicos de antígenos y por el pequeño número de mediciones paralelas que se pueden realizar en cada célula individual. ensayos de alto rendimiento tradicionales, tales como arrays de expresión génica, cuando se realiza en tejidos en su conjunto, proporcionan información sobre el nivel de expresión del gen normal, y se pueden correlacionar sólo indirectamente a modificaciones cuantitativas en subpoblaciones celulares.Estas limitaciones se hacen particularmente difícil de superar en el estudio de las poblaciones minoritarias, o la población de células que carecen de marcadores exclusivos. Mediante la combinación de "fluorescencia clasificación de células activada" (FACS) y "una sola célula de análisis PCR de expresión génica" se puede realizar un análisis de la transcripción de alto rendimiento de las células T intraepiteliales GD en endocérvix. Este método aprovecha la capacidad de los citómetros de flujo modernos para ordenar las células individuales individuales con exactitud y precisión, junto con el uso de tecnologías de microfluidos para preformas de alta sensibilidad PCR multiplexada de pequeñas cantidades de ARNm, lo que permite el análisis en paralelo de la expresión de hasta 96 genes para cada célula individual ^16.

Los autores no tienen asociación comercial o de otro tipo que puedan suponer un conflicto de intereses (por ejemplo, la propiedad de existencias de productos farmacéuticos, de consultoría, de miembros del Consejo Asesor, las patentes pertinentes, o financiación de la investigación).

Agradecemos a los participantes en el estudio Miami WIHS por su disposición a participar en este trabajo. Los datos en este manuscrito fueron recogidos por el Estudio Interinstitucional VIH en Mujeres Miami (WIHS). Los contenidos de esta publicación son de la exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas y el Estudio de la Infección Interagencial del VIH de la Mujer (WIHS) [beca número U01 AI103397], Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud [número de concesión P30AI073961], Centro Nacional para el Avance Ciencias de transferencia y el Instituto Nacional de Salud para Minorías y disparidades de Salud, Instituto Nacional de Salud [número de concesión UL1TR000460 y 1KL2TR000461], y el Instituto Nacional de Salud infantil y Desarrollo humano, Instituto Nacional de Salud [número de concesión K23HD074489].