Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

L'appareil reproducteur (FRT) système immunitaire muqueux femelle sert de la première ligne de défense. Une meilleure connaissance de la muqueuse génitale est donc essentiel pour la compréhension de la pathogénicité des différents agents pathogènes, y compris le VIH. delta Gamma cellules (GD) T sont le prototype de cellules «non conventionnelles» T et représentent un relativement petit sous-ensemble de cellules T définies par leur expression de récepteurs de cellules T (TCR hétérodimères) composées de chaînes gamma et delta. Ce qui les distingue des cellules T classiques et bien mieux connus auxiliaires CD4 ⁺ et de cellules T cytotoxiques CD8 ⁺ qui sont définis par les TCR alpha-bêta. GD cellules T montrent souvent la localisation spécifique des tissus et sont enrichis dans l'épithélium. GD cellules T orchestrent la réponse immunitaire à l'inflammation, la surveillance de la tumeur, les maladies infectieuses, et l'auto-immunité.

Ici, nous présentons une méthode pour isoler de manière reproductible et d'analyser les lymphocytes humains endocervicales intraépithéliale GD T. Nous have des échantillons de cytobrosse endocervicales utilisés par des femmes participant à interagences VIH Étude de l'infection des femmes (WIHS). La connaissance de GD cellules T interactions dans les conditions dans lesquelles il est une insulte à la muqueuse vaginale pourrait être appliquée à toute étude clinique dans laquelle la muqueuse vulnérabilité est abordée, y compris le développement de plus de microbicides.In vaginale, les connaissances sur les réponses des cellules muqueuses GD T a potentiel d'application de GD T immunothérapie à base de cellules dans le traitement de maladies infectieuses.

Nous avons développé une méthodologie de l'aide d'échantillons de pinceau endocervical pour évaluer les cellules GD T intraépithéliale. Le canal endocervical est bordée par une seule couche d'épithélium. Lymphocytes intraépithéliaux représentent les lymphocytes de première ligne résidant dans la couche épithéliale qui peut rapidement initier des réponses immunitaires lors de la rencontre des microbes pathogènes ^{7, 8.} Comprendre les événements immunologiques du compartiment intraépithéliale endocervical est important pour la conception de stratégies efficaces pour prévenir les infections, y compris le VIH.

Notre méthode peut être appliquée à des échantillons endocervicaux humains fraîchement récoltés ainsi que des cellules endocervicales congelés pour explorer davantage le rôle des cellules T GD intraépithéliale chez les femmes infectées par le VIH ou à risque d'infection par le VIH. L'objectif principal de ce protocole est de découvrir des événements immunologiques nouveaux dans le compartiment intraépithéliale endocervical et évaluatles réponses des lymphocytes T e GD comme un marqueur de la muqueuse de la vulnérabilité chez les femmes infectées par le VIH.

Les lacunes importantes dans les connaissances autour de l'immunité de FGT sont partiellement en raison de la difficulté dans la collecte et le traitement des échantillons muqueux avec succès. En outre, l'hétérogénéité complexe des cellules immunitaires de la muqueuse, et leur interconnexion avec l'autre, sont des défis majeurs pour l'identification des mesures cliniquement pertinentes qui reflètent l'état et la capacité du système immunitaire. Nous avons développé une méthode pour obtenir des cellules intraépithéliales hautement purifiées GD T qui peuvent être analysées plus en utilisant des technologies hautement multiplexées, unicellulaires qui peuvent être critiques pour identifier les mécanismes sous-jacents de l'immunité FRT.

activités d'étude ont eu lieu à l'Université de Miami Unité de recherche sur le VIH, en collaboration avec l'étude des femmes Miami Interagency HIV (WIHS) et le Centre de Miami for AIDS Research (CFAR) Conseil d'examen .Institutional (Université de Miami Miller School of Medicine) l'approbation a été obtenue avant au recrutement et à toutes les procédures d'évaluation ou d'études connexes.

1. Endocervical Brush Collection Sample

NOTE: Les participants ont subi un examen vaginal effectué par MD ou un gynécologue formé et la collecte des lymphocytes intraépithéliaux ont été réalisées en cours d'examen au spéculum en insérant cytobrosse.

1. Caractéristiques des participants
   1. Recruter les participantes qui sont âgés de 18 à 45 ans, sexuellement actives, pas enceinte et non sur les médicaments contraceptifs ou avec un dispositif intra-utérin.
   2. Avant l'examen vaginal, demandez aux participants sont soumis à un tirage de 10 ml de sang en verttop vacutainers d'héparine pour périphérique de cellules mononucléaires du sang (PBMC) l'isolement. pour servir de contrôle pour l' analyse intraépithéliale endocervical ^9.
2. Collecte des échantillons endocervicales
   1. Insérer un spéculum stérile de taille appropriée dans le vagin sans lubrification. Utilisez un eau chaude pour faciliter l'insertion du spéculum et de la gaze stérile pour nettoyer le mucus. La position du spéculum permet la visualisation complète de l'os et exocol.
   2. Insérez la brosse endocervicale dans le canal endocervical jusqu'à ce que seuls les poils les plus proches de la main sont visibles. Tourner dans le sens horaire de la brosse pour 360 °. Transférer le pinceau dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de milieu IMDM.
   3. Immédiatement après la collecte, placez le tube contenant cytobrosse sur la glace. Pour obtenir une viabilité élevée des cellules intraépithéliales recueillies, livrer le cytobrosse au laboratoire et processus dans 1 h.

2. Endocervical cytobrosse Traitement des échantillons

1. tube Vortex contenant cytobrosse endocervical application 4 courts (10 secondes) coups.
2. Centrifuger le tube contenant cytobrosse, pendant 10 min à 250 x g.
3. Retirez délicatement le cytobrosse du tube (ne pas perturber le culot sur le fond du tube) et ajouter 1 ml de milieu de IMDM et placer le tube sur la glace.
4. Placer le cytobrosse sur le tamis cellulaire de 100 mm au-dessus du tube de 50 ml.
5. Laver le cytobrosse avec 20 ml IMDM.
6. Tube à centrifuger pendant 10 min à 250 x g.
7. Décanter le surnageant et les cellules granulées remettre en suspension dans 1 ml de IMDM et se combinent avec le culot déjà remis en suspension décrite au point 2.3.
8. Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé ¹⁰ ou dénombrer les cellules en utilisant un hémocytomètre en combinant 10 pl de la suspension cellulaire avec 10 pi de colorant bleu trypan. pipeter doucement monter et descendre dix fois pour mélanger les cellules et le colorant. Charge 10 pidu mélange dans l'ouverture de l'une ou l'autre des deux chambres hémocytomètre. Comptez toutes les cellules dans les cinq domaines de la grille. Gardez un décompte séparé des cellules viables et non viables. Déterminer la viabilité des cellules en utilisant la formule suivante:% de cellules viables = cellules non viables totales x 100 cellules / numéro de la cellule.
   Déterminer la concentration subséquente de cellules par ml (et le nombre total de cellules) en utilisant les calculs suivants. Nombre de cellules par ml = x nombre total de cellules comptées (facteur de dilution / nombre de carrés comptés) x 10.000 cellules / ml.
9. Congeler cellules endocervicales isolées à l'aide de milieu de congélation contenant 10% de DMSO et 90% de FBS.

3. cytométrie de flux

1. Resuspendre 1-3 x 10 ⁵ cellules endocervicales dans un tampon de 100 ul FACS (PBS contenant 1% de sérum albumine bovine
2. Ajouter 1 pl / 10 ⁶ , LIVE / DEAD Fixable kit Cell Stain Morte jaune et des anticorps pour des marqueurs de surface aux concentrations décrites dans le tableau 1.
3. Incuber les cellules pendant 30 min à 4 ° C, à l'abri de la lumière.
4. Ajouter 1 tampon FACS mL et les cellules et les tubes de centrifugation pendant 5 min à 350 xg
5. Resuspendre culot cellulaire dans 300 pi 1% de paraformaldehyde.
6. Préparer des commandes de compensation en utilisant des billes et des anticorps utilisés pour la coloration par addition de 100 ul de tampon FACS et une chute des bourrelets et la même concentration d'anticorps utilisés pour la coloration de l'échantillon.
7. Acquérir des perles et des échantillons colorés sur un cytomètre de flux, équipé de 405 nm, 488 nm et 635 nm lasers.

4. Endocervical Gamma delta T cellule d'isolement

1. Isolement des perles magnétiques
   1. Re-suspendre endocervical culot cellulaire (≤10 ⁷ cellules total), décrit dans 2.6, dans 40 pi de tampon inclus dans le kit de microbilles gamma delta TCR référencé dans la table des matières et réactifs.
   2. Suivez les instructions du kit pour deux étapes protocole de coloration: d'abord, l'esprith anti-TCR gamma delta haptène-anticorps et, deuxièmement, avec anti-haptène microbilles-FITC
   3. Après une incubation de 15 min à 4-8 ° C, laver les cellules en ajoutant 1 ml de tampon et centrifuger à 300 g pendant 10 min. Décanter le surnageant en retournant le tube, et appuyez sur sec à l'aide d'un morceau de papier.
   4. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon fourni et préparer la colonne magnétique en le plaçant dans le séparateur magnétique approprié selon le protocole du fournisseur.
   5. Appliquer la suspension de cellules sur la colonne et recueillir des cellules non marquées qui passent à travers et colonne de lavage 3x avec une quantité appropriée de tampon (500 pi). Effectuer les étapes de lavage par addition d'un tampon à trois reprises, à chaque fois une fois que le réservoir de la colonne est vide. Collecter effluent total. Ceci est la fraction de cellules non marquées, negative
   6. Supprimer la colonne forment le séparateur magnétique et la pipette 1 ml de tampon sur la colonne et immédiatement débusquer fraction avec l'étiquette magnétiquementcellules ed en appliquant fermement le piston fourni avec la colonne.
      REMARQUE: isolé des cellules T gamma delta sont déjà colorées par fluorescence pour l'analyse de cytométrie en flux depuis microbilles anti-haptène magnétiquement marqués sont conjugués avec FITC fluorescent de colorant.
2. cellule tri
   1. Pour le tri cellulaire, étiquette cellules endocervicales avec la viabilité filière et panel d'anticorps tel que décrit dans la section 3.
   2. Mettre en place des portes électroniques sur le live, CD45 ⁺ CD3 ⁺ et gamma delta cellules positives et effectuer un tri cellulaire.

Récemment, nous avons analysé les cellules intraépithéliales endocervicales GD T et nous avons été le premier à signaler à propos de la perte de cellules endocervical delta gamma T dans le VIH des femmes infectées ^{9, 11.} Ici, nous décrivons le protocole d'isoler et d'analyser le sous-ensemble de cellules endocervical delta T gamma. Comme on le voit sur la figure 1, les cellules GD T peuvent être facilement détectés dans les échantillons de cellules endocervicales humaines.

Une population unique de cellules endocervical delta gamma V1 (GD1) T a été décrit en utilisant multiparametar écoulement immunophénotypage à base de cytométrie (Figure 1). Une stratégie de gating représentant pour l' échantillon endocervical non infecté du VIH est représenté sur la figure 1. L' analyse a été effectuée sur les cellules endocervicales totales en réglant la porte électronique sur la dispersion avant / latérale (figure 1A) , suivie par til a l' exclusion de doublets de cellules (figure 1B). Les cellules viables ont été définies par l' exclusion des cellules mortes en utilisant DIRECT / DEAD Fixable jaune Amine morte Stain cellulaire (figure 1C). Analyse de l' expression de CD45 a été réalisée sur des cellules vivantes gated (figure 1D), suivi par l'analyse de l' expression de CD3 (figure 1E). Delta Gamma 1 (GD1) ou gamma delta 2 (GD2) cellules positives ont été définis comme une sous - population de cellules CD3 ⁺ qui expriment GD TCR (TCR gamma delta V1 ou TCR gamma delta V2). En outre, il a été confirmé que seuls les lymphocytes T CD3 ⁺ expriment le TCR gamma delta depuis gated CD3 ^- lymphocytes T n'expriment le TCR gamma delta ou delta V1 V2. L' analyse phénotypique de CD3 ⁺ GD1 ⁺ cellules gated révélées (Figure 1G), que la majorité des cellules GD1 (~ 74%) sont CD4 ^- CD8 ^-.

Dans la présente étude, la faisabilité de l'utilisation de endoceéchantillons de brosses rvical aux cellules intraépithéliales purifiées GD T par sélection magnétique positive a été démontrée (Figure 2).

Figure 1: delta gamma (GD) T sous- population de cellules dans la muqueuse endocervicale analysée par cytométrie de flux. Après la stratégie de déclenchement a été utilisé pour les populations de cellules T endocervical identifiés: (A) cellules cytobrosse endocervicaux ont été bloqués selon la taille et la granularité (FSC, avant diffusion latérale vs SSC, la dispersion latérale). (B) doublets cellulaires ont été exclus en définissant les portes électroniques dans le FSC-A (région) vs SSC-W (largeur). (C) Les cellules vivantes sont déclenchés sur la population de colorant négatif viabilité. (D) porte électronique a été mis sur les cellules positives en direct, CD45. (E) porte électronique pour les cellules positives CD45 a été mis sur les cellules CD3 positives(F) TCRVD1 (GD1) et TCRVD2 (GD2) expression a été analysée sur cellules CD3 ^+. (G) CD4 et CD8 expression a été analysée sur GD1 cellules +. (H) TCRVD1 et d' expression TCRVD2 a été analysé sur des cellules négatives CD3 gated. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2: Isolement des cellules gamma delta T endocervicales (GD) par séparation magnétique positive. Fréquence des cellules GD T endocervicales a été confirmée avant et après la séparation magnétique positive. Cellules endocervicaux ont d' abord été marquées avec anti-TCR anticorps gamma delta, puis avec fluorescence colorées avec anti-haptène microbilles-FITC. Pour cent des cellules TCR GD + T a été signalé avant et après mséparation agnétiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Évaluation de la femme inférieure génitale vulnérabilité de la muqueuse des voies est une composante essentielle des études cliniques portant sur le risque d'acquisition et de la transmission du VIH. Typiquement FGT vulnérabilité à l' infection à VIH est évaluée en mesurant les modulateurs immunitaires solubles dans les sécrétions génitales (cytokines, des chimiokines et des peptides antimicrobiens) ^{12, 13.} Cependant, ces biomarqueurs sont seulement indicatifs de l'inflammation vaginale, sont affectés par des événements physiologiques et pathologiques, et ne représentent pas toujours des dommages directs de la muqueuse. Afin d'améliorer notre compréhension de la façon dont les facteurs muqueux augmentent le risque de contracter et de transmettre le VIH, les marqueurs cellulaires des lésions de la muqueuse doivent être développées. GD cellules intraépithéliale T sont présents dans la FGT, intercalent entre les cellules épithéliales, et sont considérés comme contribuant à l'homéostasie, ainsi que d'une première ligne de défense contre les défis environnementaux. GD cellules T ont le poten tiel pour constituer un biomarqueur supplémentaire pour évaluer la vulnérabilité de la muqueuse dans le FGT.

Dans ce protocole, il est montré comment préparer les lymphocytes intraépithéliale de l'échantillon de cytobrosse endocervical humaine et est facilement maîtrisé. Le point le plus critique de ce procédé consiste à maintenir la viabilité des cellules par un traitement rapide de l'échantillon et en le mettant les cellules sur de la glace pendant toute la procédure. Le rendement cellulaire dépendra de la technique de collecte de cytobrosse, les compétences ainsi que le statut infectieux (infection par le VIH ou d'autres infections virales, bactériennes ou fongiques) la manipulation. Notre groupe et d' autres ont publié diverses études décrivant les populations de lymphocytes différents dans le tractus génital humain ^{9, 14, 15.} Dans nos mains, un échantillon de cytobrosse endocervical peut fournir 0,5-5 x 10 ⁶ cellules avec 80-90% de viabilité. En comparaison avec la méthode d'isolement utiliséeclass = "xref"> ^{14, 15,} par notre méthode , le rendement de la viabilité et de la cellule est augmentée.

Cette méthode fournit un puissant et un outil efficace pour étudier intraépithéliale delta gamma lymphocytes T endocervicales et pourrait donner un aperçu des autres cellules immunitaires qui migrent vers ce compartiment lors de l'infection et / ou une inflammation. La composition cellulaire in vivo des tissus muqueux est souvent difficile d'enquêter de manière exhaustive et quantitative. Des techniques telles que l'immunohistochimie et cytométrie de flux sont limitées par la disponibilité d'anticorps monoclonaux spécifiques de l'antigène et par le faible nombre de mesures parallèles qui peuvent être exécutées sur chaque cellule individuelle. Traditionnels tests à haut débit, tels que les tableaux d'expression génique, lorsqu'elle est effectuée sur les tissus entiers, fournissent des informations sur le niveau d'expression génique moyenne, et peuvent être indirectement corrélés à des modifications quantitatives dans les sous-populations cellulaires.Ces limitations deviennent particulièrement difficiles à surmonter lors de l'étude des populations minoritaires, ou la population de cellules qui manquent de marqueurs exclusifs. En combinant "fluorescence tri cellulaire activé" (FACS) et "une seule cellule d'analyse PCR d'expression génique», on peut effectuer une analyse de la transcription à haut débit des cellules T GD intraépithéliales dans endocervix. Cette méthode exploite la capacité des cytomètres de flux modernes pour trier des cellules individuelles individuelles avec exactitude et de précision, ainsi que l'utilisation des technologies microfluidiques pour préformer une sensibilité élevée par PCR multiplexe à partir d'infimes quantités d'ARNm, ce qui permet une analyse parallèle de l'expression de jusqu'à 96 gènes pour chaque cellule individuelle ^16.

Les auteurs ne sont pas une association commerciale ou autre qui pourrait constituer un conflit d'intérêts (par exemple, stocks pharmaceutiques propriété, de conseil, de membres du conseil consultatif, les brevets pertinents, ou le financement de la recherche).

Nous remercions les participants à l'étude Miami WIHS pour leur volonté de participer à ce travail. Les données contenues dans ce manuscrit ont été recueillies par Interagency HIV Study des femmes Miami (WIHS). Le contenu de cette publication relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas la position officielle de la National Institutes of Health (NIH). Ce travail a été soutenu par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et de l'étude des infections interagences VIH des femmes (WIHS) [subvention numéro U01 AI103397], Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health [numéro de subvention P30AI073961], le Centre national pour l'avancement Sciences translationnelle et l'Institut national sur la santé des minorités et les disparités en santé, Institut national de la santé [numéro de subvention UL1TR000460 et 1KL2TR000461], et l'Institut national de la santé infantile et du développement humain, l'Institut national de la santé [numéro de subvention K23HD074489].