العزلة وتدفق Cytometric تحليل الإنسان باطن عنق الرحم غاما دلتا الخلايا التائية

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

يقدم الجهاز التناسلي (FRT) الغشاء المخاطي الجهاز المناعي الإناث كنسبة خط الدفاع الأول. معرفة أفضل من الغشاء المخاطي التناسلية هي بالتالي أساسية لفهم المرضية لمسببات الأمراض المختلفة بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية. دلتا غاما الخلايا (GD) T هي نموذج لخلايا T 'غير تقليدية' وتمثل مجموعة فرعية صغيرة نسبيا من الخلايا التائية التي يحددها التعبير عنها من مستقبلات الخلايا التائية heterodimeric (TCRs) تتألف من جاما ودلتا سلاسل. هذا يفرقهم من CD4 ⁺ الخلايا التائية المساعدة الكلاسيكية والكثير المعروف والخلايا CD8 ⁺ التائية السامة التي تم تعريفها من قبل TCRs ألفا بيتا. غالبا ما تظهر خلايا GD تي توطين أنسجة محددة ويتم إثراء في ظهارة. خلايا GD تي تنسق الاستجابات المناعية في التهاب والمراقبة الورم، والأمراض المعدية، وأمراض المناعة الذاتية.

هنا، فإننا نقدم وسيلة لعزل بتكاثر وتحليل باطن عنق الرحم داخل الظهاري الخلايا الليمفاوية T GD الإنسان. نحن هالقد استخدمت عينات cytobrush باطن عنق الرحم من النساء المشاركات في المرأة العدوى دراسة مشتركة بين فيروس نقص المناعة البشرية (WIHS). المعرفة حول GD خلايا تي التفاعل خلال الظروف التي يوجد فيها إهانة للالغشاء المخاطي المهبلي يمكن تطبيقها على أي دراسة سريرية التي يتم فيها معالجة الضعف المخاطية، بما في ذلك تطوير بالإضافة microbicides.In المهبلية والمعرفة حول استجابات الخلايا المخاطية GD تي ديها إمكانية تطبيق GD تي خلية القاعدة العلاج المناعي في علاج الأمراض المعدية.

قمنا بتطوير منهجية باستخدام عينات من باطن عنق الرحم فرشاة لتقييم خلايا GD T داخل الظهاري. واصطف قناة باطن عنق الرحم بواسطة طبقة واحدة من ظهارة عمودية. تمثل الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري الخلايا الليمفاوية خط المواجهة المقيمين داخل الطبقة الظهارية التي يمكن الشروع في الاستجابات المناعية على مواجهة الميكروبات المسببة للأمراض ^{7 و 8.} فهم الأحداث المناعية من حجرة داخل الظهاري باطن عنق الرحم المهم لتصميم استراتيجيات فعالة لمنع العدوى، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية.

ويمكن تطبيق أسلوبنا لعينات من باطن عنق الرحم البشري التي جمعت حديثا وكذلك خلايا باطن عنق الرحم المجمدة لمواصلة استكشاف دور خلايا GD T داخل الظهاري في النساء بفيروس نقص المناعة البشرية أو المعرضين لخطر الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو اكتشاف الأحداث المناعية جديدة في حجرة داخل الظهاري باطن عنق الرحم وevaluatاستجابات الخلايا ه GD تي كعلامة ضعف الغشاء المخاطي في النساء بفيروس نقص المناعة البشرية.

ومن المقرر جزئيا إلى صعوبة في جمع ومعالجة عينات المخاطية بنجاح ثغرات كبيرة في المعرفة حول الحصانة FGT. وعلاوة على ذلك، عدم تجانس معقدة من الخلايا المناعية المخاطية، وترابطها مع بعضها البعض، تحديات كبرى لتحديد القياسات ذات الصلة سريريا التي تعبر عن الدولة وقدرة الجهاز المناعي. قمنا بتطوير طريقة للحصول على خلايا داخل الظهاري العالية النقاء GD T يمكن أن يكون أبعد تحليلها باستخدام المضاعفة العالية والتقنيات وحيدة الخلية التي قد تكون حاسمة لتحديد الآليات الكامنة وراء الحصانة FRT.

كما نفذت دراسة مكان في جامعة وحدة أبحاث فيروس نقص المناعة البشرية ميامي بالتعاون مع الوكالات دراسة المرأة في ميامي فيروس نقص المناعة البشرية (WIHS) ومركز ميامي لأبحاث الإيدز (CFAR) .Institutional مجلس مراجعة (جامعة ميامي ميلر مدرسة الطب) تم الحصول على موافقة مسبقة للتجنيد وأي إجراءات التقييم أو الدراسة ذات الصلة.

1. باطن عنق الرحم فرشاة جمع العينات

وخضع المشاركون لفحص المهبل يؤديها MD تدريب أو أخصائي أمراض النساء وجمع أجريت تخضع للفحص منظار عن طريق إدراج cytobrush الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري: ملاحظة.

1. خصائص مشارك
   1. توظيف النساء المشاركين الذين تتراوح أعمارهم بين 18-45 سنة من العمر، نشط جنسيا، لم تكن حاملا وليس على الأدوية وسائل منع الحمل أو مع جهاز داخل الرحم.
   2. قبل الفحص المهبلي، يكون المشاركون الخضوع لتعادل 10 مل دم باللون الأخضر أعلى vacutainers الهيبارين لالطرفية عزل الخلايا وحيدة النواة في الدم (PBMC). لتكون بمثابة مراقبة لتحليل داخل الظهاري باطن عنق الرحم ^9.
2. جمع عينات من باطن عنق الرحم
   1. إدراج منظار العقيمة ذات حجم مناسب في المهبل دون تزييت. استخدام الماء الدافئ لتسهيل إدخال المنظار وشاش معقم لتنظيف المخاط. موقف منظار يسمح لتصور كامل لنظام التشغيل والجزء المهبلي من العنق.
   2. إدراج فرشاة باطن عنق الرحم في قناة باطن عنق الرحم حتى فقط شعيرات الأقرب إلى جهة واضحة. تدوير في اتجاه عقارب الساعة فرشاة ل 360 درجة. نقل الفرشاة في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من المتوسط ​​IMDM.
   3. مباشرة بعد جمع ووضع أنبوب يحتوي cytobrush على الجليد. للحصول على قابلية عالية للخلايا داخل الظهاري التي تم جمعها، تقديم cytobrush إلى المختبر وعملية داخل 1 ساعة.

"jove_title"> 2. باطن عنق الرحم Cytobrush تجهيز عينة

1. أنبوب دوامة تحتوي على cytobrush باطن عنق الرحم تطبيق 4 قصيرة (10 ثانية) السكتات الدماغية.
2. أنبوب الطرد المركزي، التي تحتوي على cytobrush، لمدة 10 دقيقة في 250 × ز.
3. إزالة بعناية cytobrush من الأنبوب (لا تعكر صفو بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب) وإضافة 1 مل من وسائل الاعلام IMDM ووضع أنبوب على الجليد.
4. وضع cytobrush على الخلية مصفاة 100 ملم على رأس أنبوب 50 مل.
5. غسل cytobrush مع 20 مل IMDM.
6. أنبوب الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 250 × ز.
7. صب طاف والخلايا مكعبات Resuspend في 1 مل IMDM وتتحد مع بيليه بالفعل إعادة علقت هو موضح في 2.3.
8. عد الخلايا باستخدام خلية مكافحة الآلي ¹⁰ أو عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات عن طريق الجمع بين 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من صبغة زرقاء التريبان. الماصة بلطف صعودا وهبوطا عشر مرات لخلط الخلايا وصبغ. تحميل 10 ميكرولترمن الخليط في افتتاح إحدى الغرفتين عدادة الكريات. عدد جميع الخلايا في مناطق الشبكة الخمسة. الحفاظ على عدد منفصلة من خلايا قابلة للحياة وغير قابلة للحياة. تحديد بقاء الخلية باستخدام الصيغة التالية:٪ خلايا قابلة للحياة = الخلايا غير قابلة للحياة × 100 / مجموع الخلايا عدد الخلايا.
   تحديد تركيز اللاحقة خلية لكل مليلتر (والعدد الكلي للخلايا) باستخدام العمليات الحسابية التالية. مجموع خلايا لكل مل = س مجموع الخلايا عدها (عامل تخفيف / عدد مربع عد) × 10000 خلية / مل.
9. تجميد خلايا باطن عنق الرحم معزولة باستخدام تجميد المتوسطة التي تحتوي على 10٪ DMSO و 90٪ FBS.

3. التدفق الخلوي

1. اعادة تعليق 1-3 × 10 ⁵ خلايا باطن عنق الرحم في 100 العازلة ميكرولتر FACS (PBS تحتوي على 1٪ زلال المصل البقري
2. إضافة 1 ميكرولتر / 10 ⁶ ايف / قابل للتثبيت DEAD صفراء الميت عدة صمة عار الخلية والأجسام المضادة لعلامات سطح في تركيزات هو موضح في الجدول رقم 1.
3. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في +4 درجة مئوية، محمية من الضوء.
4. إضافة 1 مل العازلة FACS والخلايا وأنابيب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج
5. اعادة تعليق الخلية بيليه في 300 ميكرولتر 1٪ امتصاص العرق.
6. إعداد ضوابط التعويض باستخدام الخرز والأجسام المضادة المستخدمة لتلطيخ بإضافة 100 ميكرولتر من العازلة FACS وقطرة واحدة من الخرز ونفس تركيز الأجسام المضادة المستخدمة لعينة تلطيخ.
7. الحصول الخرز الملون والعينات على تدفق عداد الكريات، ومجهزة 405 نانومتر، 488 نانومتر، و 635 ليزر نانومتر.

4. باطن عنق الرحم غاما دلتا تي عزل الخلايا

1. المغناطيسية العزلة حبة
   1. اعادة تعليق باطن عنق الرحم خلية بيليه (≤10 ⁷ مجموع الخلايا)، وصفها في 2.6، في 40 ميكرولتر من العازلة المدرجة في TCR جاما دلتا عدة ميكروبيدات المشار إليها في جدول المواد والكواشف.
   2. اتبع الإرشادات عدة لبروتوكول تلطيخ من خطوتين: أولا، خفة دمح مكافحة TCR جاما دلتا ناشبة الأضداد والثانية، مع anti-ناشبة ميكروبيدات-FITC
   3. بعد مرور فترة الحضانة من 15 دقيقة في 4-8 درجة مئوية، وغسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. صب طاف بواسطة أنبوب للقلب، والاستفادة الجافة مع مساعدة من قطعة من الورق.
   4. إعادة تعليق بيليه خلية في 500 ميكرولتر من العازلة المقدمة وإعداد العمود المغناطيسي عن طريق وضعها في فاصل المغناطيسي المناسب وفقا لبروتوكول البائع.
   5. تطبيق تعليق خلية على العمود وجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر ويغسل عمود 3X مع كمية مناسبة من العازلة (500 ميكرولتر). أداء الغسيل الخطوات بإضافة عازلة ثلاث مرات، في كل مرة مرة واحدة الخزان عمود فارغ. جمع النفايات السائلة الكلي. هذا هو الخالي من الملصقات، سلبي جزء الخلية
   6. إزالة العمود تشكل الفاصل المغناطيسي وماصة 1 مل من العازلة على العمود وعلى الفور طرد جزء مع التسمية مغناطيسياإد الخلايا عن طريق تطبيق بحزم المكبس المتوفرة مع العمود.
      ملاحظة: المعزولة جاما دلتا تي خلية بالفعل ملطخة fluorescently لتحليل تدفق cytometric منذ ومترافق المسمى مغناطيسيا ميكروبيدات مكافحة ناشبة مع FITC صبغة الفلورسنت.
2. فرز الخلايا
   1. لفرز الخلايا، وخلايا باطن عنق الرحم التسمية مع يموت الجدوى ولوحة الضد كما هو موضح في القسم 3.
   2. إنشاء بوابات إلكترونية على الهواء مباشرة، CD45 ⁺ CD3 ⁺ ودلتا غاما خلايا إيجابية وأداء فرز الخلايا.

مؤخرا، قمنا بتحليل خلايا GD T داخل الظهاري باطن عنق الرحم، وكنا أول من يقدم تقريرا عن فقدان باطن عنق الرحم جاما دلتا خلايا T في فيروس نقص المناعة البشرية النساء المصابات ^{9 و 11.} هنا، نحن تصف البروتوكول لعزل وتحليل فرعية من باطن عنق الرحم جاما دلتا خلايا تي. كما هو مبين في الشكل رقم 1، وخلايا T GD يمكن الكشف عنها بسهولة في عينات من الخلايا باطن عنق الرحم الإنسان.

وقد وصف أحد سكان فريد من باطن عنق الرحم جاما دلتا خلايا V1 (GD1) T باستخدام multiparametar تدفق المناعي القائم الخلوي (الشكل 1). ويرد استراتيجية النابضة تمثيلية لفيروس نقص المناعة البشرية عينة من باطن عنق الرحم غير المصابة في الشكل 1. تم إجراء تحليل على مجموع الخلايا باطن عنق الرحم عن طريق وضع بوابة إلكترونية على مبعثر الأمام / جانبية (الشكل 1A)، يليه رانه استبعاد الحلل خلية (الشكل 1B). وقد تم تحديد خلايا قابلة للحياة من خلال استبعاد الخلايا الميتة باستخدام لايف / الميت قابل للتثبيت الأصفر أمين صمة عار خلية الميت (الشكل 1C). أجري تحليل التعبير CD45 على الخلايا الحية بوابات (الشكل 1D)، يليه تحليل التعبير CD3 (الشكل 1E). جاما دلتا 1 (GD1) أو جاما دلتا 2 تم تعريف (GD2) خلايا إيجابية جزء من السكان من CD3 ⁺ الخلايا التي تعبر عن GD TCR (TCR جاما دلتا V1 أو TCR جاما دلتا V2). وعلاوة على ذلك، تم التأكيد على أنه ليس هناك سوى خلايا CD3 ⁺ T تعبر عن TCR جاما دلتا منذ CD3 بوابات ^- خلايا T لا تعبر عن TCR جاما دلتا V1 أو V2 الدلتا. تحليل المظهري من بوابات CD3 ⁺ GD1 ⁺ خلايا كشفت (الشكل 1G)، أن غالبية خلايا GD1 (~ 74٪) هي CD4 ^- CD8 ^-.

في هذه الدراسة، والجدوى من استخدام endoceوقد تجلى عينات فرشاة rvical إلى خلايا GD T داخل الظهاري النقاء عن طريق الانتقاء المغناطيسي إيجابية (الشكل 2).

الشكل 1: دلتا غاما (GD) T حيوانية الخلايا في الغشاء المخاطي باطن عنق الرحم تحليلها من قبل التدفق الخلوي. وقد استخدم التالية استراتيجية النابضة لتحديد السكان الخلية باطن عنق الرحم T: تم بوابات (أ) الخلايا cytobrush باطن عنق الرحم وفقا لحجم وتحبب (FSC، إلى الأمام مبعثر الجانب مقابل SSC، مبعثر الجانب). تم استبعاد (ب) الحلل خلية عن طريق تحديد البوابات الإلكترونية في FSC-A (منطقة) مقابل SSC-W (العرض). هي بوابات (C) الخلايا الحية على السكان صبغ سلبي جدوى. تم تعيين (D) البوابة الإلكترونية على الخلايا الحية إيجابية CD45. تم تعيين (E) بوابة الإلكترونية للخلايا إيجابية CD45 على الخلايا إيجابية CD3تم تحليل (F) TCRVD1 (GD1) وTCRVD2 التعبير (GD2) على CD3 خلايا ^+. تم تحليل (G) CD4 و CD8 التعبير على GD1 خلايا +. تم تحليل (H) TCRVD1 والتعبير TCRVD2 على الخلايا السلبية CD3 بوابات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: عزل خلايا جاما دلتا تي باطن عنق الرحم (GD) بواسطة مغناطيس إيجابي. تم تأكيد تردد من خلايا GD تي باطن عنق الرحم قبل وبعد الفصل المغناطيسي إيجابي. وقد وصفت خلايا باطن عنق الرحم لأول مرة مع مكافحة TCR جاما دلتا الأجسام المضادة وبعد ذلك مع ملطخة fluorescently مع مكافحة ناشبة ميكروبيدات-FITC. وقد ذكرت في المئة من خلايا TCR GD + T قبل وبعد مالفصل agnetic. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تقييم أقل التناسلية ضعف الجهاز المخاطي الإناث هو عنصر أساسي من الدراسات السريرية معالجة مخاطر اكتساب فيروس نقص المناعة البشرية وانتقال العدوى. وعادة ما يتم تقييم FGT التعرض للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق قياس جهري المناعي للذوبان في الإفرازات التناسلية (السيتوكينات، كيموكينات والببتيدات المضادة للميكروبات) ^{12، 13.} ومع ذلك، فإن هذه المؤشرات الحيوية تدل فقط من التهاب المهبل، تتأثر الأحداث الفسيولوجية والمرضية، ولا تمثل دائما تلف الغشاء المخاطي المباشر. من أجل تحسين فهمنا لكيفية زيادة عوامل المخاطية من مخاطر اكتساب ونقل فيروس نقص المناعة البشرية، لا بد من وضع علامات الخلوية الضرر المخاطية. خلايا GD داخل الظهارة تي موجودة في FGT، يقحم بين الخلايا الظهارية، ويعتقد أنها تساهم في التوازن وكذلك خط الدفاع الأول ضد التحديات البيئية. خلايا GD تي لديها الهياج للمحاكمة لتشكل العلامات البيولوجية إضافية لتقييم الضعف المخاطية في FGT.

في هذا البروتوكول، فإنه يظهر كيفية تحضير الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري من عينة cytobrush باطن عنق الرحم الإنسان ويتقن بسهولة. النقطة الأكثر أهمية في هذه العملية للحفاظ على بقاء الخلية عن طريق معالجة سريعة من العينة، وكذلك عن طريق الحفاظ على الخلايا على الجليد خلال الإجراء بأكمله. فإن العائد خلية تعتمد على تقنية جمع cytobrush، والتعامل مع المهارات فضلا عن وضع المعدية (العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية أو العدوى الفيروسية الأخرى، البكتيرية أو العدوى الفطرية). وقد نشرت مجموعتنا وغيرها من الدراسات المختلفة التي تصف السكان اللمفاويات مختلفة في الجهاز البشري التناسلي ^{9 و 14 و 15.} في أيدينا، يمكن للمرء أن عينة cytobrush باطن عنق الرحم توفر 0،5-5 × 10 ⁶ خلايا مع 80-90٪ جدوى. بالمقارنة مع أسلوب العزلة التي يشيع استخدامهاالطبقة = "XREF"> ^{14، 15،} من خلال أسلوبنا هو زيادة العائد الجدوى والخلية.

يوفر هذا الأسلوب قوية وأداة فعالة لدراسة باطن عنق الرحم داخل الظهاري جاما دلتا اللمفاويات التائية ويمكن أن توفر نظرة ثاقبة الخلايا المناعية الأخرى التي تهاجر إلى هذه المقصورة خلال العدوى و / أو التهاب. في الجسم الحي تكوين الخلايا من الأنسجة المخاطية غالبا ما يكون صعبا للتحقيق بطريقة شاملة والكمية. تقنيات مثل المناعية والتدفق الخلوي محدودة بسبب توافر مستضد الاجسام المضادة المحددة وعدد قليل من القياسات الموازية التي يمكن القيام بها في كل خلية على حدة. التقليدية فحوصات عالية الإنتاجية، مثل المصفوفات الجينات التعبير، عندما أجريت على أنسجة كاملة، معلومات عن متوسط ​​مستوى التعبير الجيني، ويمكن أن يرتبط بشكل غير مباشر إلى التعديلات الكمية فى فئة الخلوية.تصبح هذه القيود صعبة للغاية للتغلب عند دراسة الأقليات، أو السكان الخلية التي تفتقر علامات حصرية. من خلال الجمع بين "مضان تنشيط الخلايا الفرز" (FACS) و "وحيد الخلية تحليل PCR الجينات التعبير" يمكن للمرء أن إجراء تحليل الإنتاجية العالية النسخي من الخلايا GD T داخل الظهاري في باطن عنق الرحم. هذه الطريقة يستغل قدرات أجهزة قياس التدفق الخلوي الحديثة لفرز الخلايا وحيدة منفردة مع الدقة والإحكام، جنبا إلى جنب مع استخدام تقنيات الموائع الدقيقة إلى التشكيل حساسية عالية المضاعفة PCR من كميات دقيقة من مرنا، مما يتيح تحليل مواز للتعبير عن ما يصل الى 96 الجينات لكل خلية فردية ^16.

الكتاب ليس لديها جمعية تجارية أو غيرها التي قد تشكل تضاربا في المصالح (على سبيل المثال، ملكية الأسهم الصيدلانية، والاستشارات، استشاري عضوية مجلس الإدارة، وبراءات الاختراع ذات الصلة، أو تمويل البحوث).

نشكر المشاركين في الدراسة ميامي WIHS عن استعدادهم للمشاركة في هذا العمل. وقد تم جمع البيانات في هذه المخطوطة من قبل النساء في ميامي دراسة فيروس نقص المناعة البشرية بين الوكالات (WIHS). محتويات هذا المنشور هي الجهة الوحيدة المسؤولة عن المؤلفين ولا تمثل وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية ودراسة العدوى بين الوكالات فيروس نقص المناعة البشرية نسائية (WIHS) [منح عدد U01 AI103397]، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والمعاهد الوطنية للصحة [عدد المنح P30AI073961]، المركز الوطني للنهوض العلوم بالحركة والمعهد الوطني لصحة الأقليات والصحة الفوارق، المعهد الوطني للصحة [عدد المنح UL1TR000460 و1KL2TR000461]، والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية، المعهد الوطني للصحة [عدد المنح K23HD074489].