マウスの腹部癒着の作成

Abdominal adhesions that form after surgery are a major cause of pain, infertility, and hospitalization and reoperation for small bowel obstruction. Our surgical procedure for creating abdominal adhesions in mice is a reliable tool to study the mechanisms underlying the formation of adhesions.

Abdominal adhesions consist of fibrotic tissue that forms in the peritoneal space in response to an inflammatory insult, typically surgery or intraabdominal infection. The precise mechanisms underlying adhesion formation are poorly understood. Many compounds and physical barriers have been tested for their ability to prevent adhesions after surgery with varying levels of success. The mouse and rat are important models for the study of abdominal adhesions. Several different techniques for the creation of adhesions in the mouse and rat exist in the literature. Here we describe a protocol utilizing abrasion of the cecum with sandpaper and sutures placed in the right abdominal sidewall. The mouse is anesthetized and the abdomen is prepped. A midline laparotomy is created and the cecum is identified. Sandpaper is used to gently abrade the surface of the cecum. Next, several figure-of-eight sutures are placed into the peritoneum of the right abdominal sidewall. The abdominal cavity is irrigated, a small amount of starch is applied, and the incision is closed. We have found that this technique produces the most consistent adhesions with the lowest mortality rate.

腹部癒着は、通常、手術や腹腔内感染後、炎症に反応して腹部に形成瘢痕組織の形態です。癒着は、慢性腹痛や不妊症の主な原因であり、小腸閉塞¹の最も一般的な原因です。癒着の存在は、第二の開腹手術を行うより困難になり、合併症²の可能性を増大させます。

長年の研究にもかかわらず、癒着の形成の基礎となるメカニズムはよくわかっていないままです。腹膜表面への初期の損傷は、その後腸腹壁一緒³の表面に結合する血餅を形成するフィブリンに富む流体の浸出を引き起こすことが知られています。その後、線維芽細胞および他の細胞は、接着剤空間に移行し、結合組織^4を分泌^します 。年に数ヶ月にわたり接着は血管や神経を開発することによって、成熟します ^5。

いくつかの市販の製品は、腹部手術（ 例えば 、Seprafilm）後の癒着の形成を減少させるように設計されているものが存在します。これらの製品のすべては、機械的障壁として作用し、腸のループと腹壁^6,7間の物理的接触を防止することによって、癒着形成を停止させます。外科的癒着バリアは、癒着⁸の形成を減少させる対照試験からの証拠にもかかわらず、多くの外科医は、逸話的、機械的障壁製品の有効性に失望されています。

現在、癒着形成に関与する正確なプロセスが十分に理解されていないという事実を反映しない薬剤ベースの抗接着療法は、存在しません。具体的に接着の形成に関与しているイベントの理解向上を必要とする癒着​​の形成に関与する細胞または分子薬剤を標的に治療を開発します。いくつかのグループSは、癒着形成^9-11にとって重要である分子経路を同定しました。動物モデルは、癒着の形成を研究するための優れた環境を提供します。多くの研究は、いくつかの動物、特にラットおよびマウス^6,12-14に接着の外科的な作成を記述する公開されています。マウスやトランスジェニックマウスとマウスベースの抗体の広い可用性における線維症を研究して私たちの経験を考えると、我々は癒着の研究のための我々のモデルとしてマウスを選択しました。ここで、我々は再現性と確実マウスにおける腹部癒着を作成するために開発した技術を報告しています。

以下のプロトコルは、スタンフォード大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、研究用動物の使用に関するすべての機関の倫理ガイドラインに適合しています。

腹部癒着の1創出

1. 1週間前の手順への抗生物質の固形飼料の上でマウスを開始します。
2. 手術器具とプリ暖かい生理食塩水の洗浄溶液をオートクレーブ。
3. 2％吸入イソフルランを用いてマウスを麻酔。
4. 迅速なアプリケーションが続くバリカン使用 - 脱毛剤の（5〜10秒）、腹部の表面の大部分から毛を取り除きます。徹底的に優しく慎重に温水中にマウスの下半分を液体につけることにより、任意に湿ったガーゼと、で拭いて除毛剤を除去。徹底的に動物を乾燥させます。
5. 麻酔ノーズコーンに動物の鼻を置きます。全体の手術中、慎重にRを監視espiratory動物の速度、必要に応じて麻酔流速を滴定します。
6. 低体温症を防止するために、加熱パッドまたは加温ランプ等の加温装置を使用します。
7. 腹部を準備中に先立ち、手術中にシフトするからマウスを防ぐために、腹部の上方および下方に配置されたテープのストリップでマウスを固定します。ベタジンで腹部を消毒し、その後、70％エタノールで従ってください。剃った領域の端の毛など、準備中のできるだけ多くの地域が含まれます。マウスオーバー滅菌ドレープを配置します。 （ 図1）
8. 皮下に0.1ミリグラム/キログラムブプレノルフィン、または30グラムのマウスのための3μgのを注入します。
9. 皮膚切開を行います。
   1. 下腹部の正中線に出発し、鉗子で皮膚をつかみ、鋭いハサミを用いて皮膚内の浅い縦カットをします。
   2. ハサミで剣状突起に上方カットを運びます。皮膚のみを入力するように注意してください。
10. 腹部の筋肉組織は、nであるようにOW内臓を覆って見え、鉗子で筋肉組織の正中線を把握し、非常に慎重に鋭いハサミを使用して、その中に小さなカットをします。誤って腹部臓器にカットしないように注意してください。
11. 小さなカットで腹膜腔に進入し、筋層は腹部臓器から引き離す見た後、開口部にはさみを挿入し、慎重に両方の方向に切断することにより、上方と下方カットを拡張します。剣状突起から上方に下方膀胱の上に切開を拡張します。 （ 図2）
12. 今腸が露出していることを、盲腸を見つけて静かに体外に出します。歯付きまたは鋭いピンセットで盲腸を把握することは避けてください。代わりに、このようなAdson鋸歯状の鉗子として、非外傷性鉗子を使用しています。
13. 紙やすりで盲腸をすり減らします。
    1. 表面はあまり光沢があり、点状出血appeaになるまで60秒 - ゆっくり30 100グリットのサンドペーパーで盲腸の両側の表面全体を研磨表面上のR。外科医が右利きの場合は、先端が右に向けて盲腸を向けると、外科医の左人差し指の上に盲腸をドレープするのに役立ちます。 （ 図3）
    2. 誤って薄い盲腸壁の穿孔を引き起こすことは容易であるように、軽くサンディングを行います。サンドペーパーは、盲腸の表面に沿って移動されるようにざらつき感の少量が感じされるべきです。サンドペーパーを繰り返し盲腸に引っ掛かる感じられる場合、これはおそらく、盲腸壁に涙の原因となります。サンドペーパーの粒子が外れると、これは過剰な異物反応を引き起こす可能性があるとして、腹部に残っていないことを確実にするために注意して観察してください。
    3. 盲腸壁に涙が発生した場合は、手順を終了し、動物を安楽死させます。
    4. 盲腸血管がサンドペーパーにより剪断や出血が発生した場合は、ガーゼで最大2分間圧力を保持します。出血がこの時間後に解消されない場合は、周囲に8の字7-0モノフィラメント縫合糸を配置出血のポイント。これは確実に、ほぼすべてのケースで出血を停止します。これは、壁の関与部分の壊死を引き起こすリスクとして、縫合糸に盲腸壁を大量に取り込まないように注意してください。
14. 右腹部の側壁を傷つけます。
    1. 右腹部の側壁の筋肉の腹膜表面を研磨するためにサンドペーパーのストリップを使用してください。サンディングとここより盲腸にもっと積極的に、右腹部側壁の表面全体がアップ荒れ表示されるまで継続します。皮膚は筋層内の開口部を介して表示されるようにハードサンディング避けてください。 （ 図4）
    2. カストロ・ビエホ針ドライバを使用して、右腹部側壁の筋層に4-0 8の字2〜4シルクのステッチを配置します。約5mm長い尾を残します。誤って縫合糸に腸壁をキャッチしないように注意してください。 （ 図5）
15. wが充填された10mlのシリンジを使用してi番目は、腸を数回灌漑、生理食塩水を温めました。同様に、内部を洗浄するために腹腔内に生理食塩水の流れを向けます。マウスの下の表面がずぶぬれになった場合、低体温を避けるために、表面を上にマウスを移動したり、交換してください。
16. 過剰な灌漑を吸収するために切開の上に置か滅菌ガーゼを使用してください。
17. 澱粉のピンチを取ると右腹部側壁の表面に盲腸の両側にそれを振りかけます。 （ 図6）
18. アクティブな出血がないことを確認します。ある場合は、それが停止するまで出血のポイントに直接圧力を適用するために、ガーゼスポンジを使用します。出血が容易に停止しない場合は上記のように、止血縫合糸を配置します。
19. 鉗子や指の平滑末端を使用して、静かに腹腔内に戻って腸を押してください。癒着形成を最大化するために、次の右腹部の側壁における縫合糸に盲腸を置きます。
20. C言語腹部切開を失います。
    1. 6-0吸収性編組縫合糸を使用して、切開部の上部にある筋層にランニングステッチを配置します。
    2. 筋層を結集し、ダウン切開の底に向かって縫合糸を実行します。約3mmで旅行すると、それぞれの新しいステッチで3ミリメートル刺さを取ります。縫合糸を配置しながら、誤って腸の一口を取るしないように注意してください。
    3. 切開部の底部には、前のbiteから縫合糸のループを残し、縫合糸を結ぶ機器にこれを使用しています。 5ミリメートル尾を残して縫合糸をカットします。
    4. 皮膚を閉じるには、6-0ナイロンモノフィラメント縫合糸で上記の3つの手順を繰り返します。
21. 20ミリリットル/ kgの皮下生理食塩水ボーラス（30グラムのマウスのためのおよそ0.5ミリリットル）を管理します。
22. 背の毛皮は、灌漑の間に濡れする傾向があるとして、ドライガーゼを使用して、徹底的に、動物全体を乾燥させます。
23. ゆるく切開部をカバーするために、腹部の周りに包帯接着剤を包みます。 Aを拘束しないように注意してくださいドレッシングニマルの足や呼吸力学。
24. それは麻酔から回復するように慎重に動物を監視します。疼痛管理のための手順の後にブプレノルフィンを2〜3日ごとに12時間を管理します。

2.収穫接着組織

1. 最初の手術後7日以上の間隔をあけてください。ここでも、手術器具をオートクレーブし、イソフルランでマウスを麻酔。
2. 70％エタノール、続いベタジンで腹部を滅菌します。皮膚を含む接着片を組織学をより困難にする、髪でカバーされないように、腹部の右側から追加の毛を剃ると毛を抜きます。
3. 腸は、多くの場合、元の切開部に貼り付けられているので、左paramedian切開を使用してください。腹部の下端に出発し、元の切開部の下部の左側に約5ミリメートルは、小さな歯付き鉗子で皮膚をつかみ、鋭いハサミで皮膚にカット。優れたこのカットを拡張胸郭へLY。 （ 図7）
4. はさみを使用して、筋層に切断し、腹膜腔に入った後、切開部の上部と下部に切り込みを拡張します。盲腸と小腸が元の切開部にも可能性が腹部の右側の側壁に付着し、させる接着剤の組織があります。 （ 図8）
5. 盲腸のレベルを超えて、はさみを使用して、切開部の端に開始、腸が付着している領域の周囲に円形に腹壁に切断開始。
6. 徐々に密着周りのすべての方法をカットし、円を完了し、腸、皮膚、腹壁の付着の「島」をもたらす、盲腸のレベルの上方と下方に交互に。 （ 図9）
7. 再び皮膚および腹壁から構成された組織のサンドイッチを得、腸に切断し、腸の残りの部分から付着部分を分離し、はさみを使用して一方の側、反対側の腸、および接着剤の組織上の間に2つを接続します。 （ 図10）
8. 必要に応じて、急激に腹壁筋から皮膚を分離するために先の尖ったハサミを使用しています。組織学のために取り付けられた皮膚を残して検討したが、消化し、細胞単離のために皮膚を除去することができます。組織は、組織学のために使用される場合、過度に接着界面を乱すことなく、できるだけ多くの縫合糸材料を除去するようにしてください。消化および細胞単離のためには、限り、ダイジェストがフィルタリングされる組織として所定の位置に縫合糸を残すことが許容可能です。
9. 接着組織を切除した後、あなたの制度的動物使用委員会によって承認された人道的な方法を用いてマウスを安楽死させます。

手術、盲腸、おそらく上行結腸、肝臓、および小腸のループ後の7日目に右側腹壁に付着すべきです。 （ 図8）切除した組織が ​​埋め込 ​​まれており、切断し、優れた組織スライドをもたらすことができます。 （ 図11、12）

手順が正しく行われた場合、100％のマウスは、7日目にかなりの癒着を持っている必要があります。死亡率は5％未満であるべきです。

図1： 手術の準備 （a）は、動物がテープとベタジンプレップ腹部で固定されている（b）のベータダインはアルコール綿棒でクリアされていると滅菌ドレープが置かれています。。。オム/ファイル/ ftp_upload / 54450 / 54450fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2： 切開切開が剣状突起に膀胱のレベルから拡張する必要があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図 3： 盲腸の摩耗は、（a） は右を指している先で左人差し指の上に盲腸を立体裁断することは盲腸のベースは左の親指によって安定化させることを可能にする（b）のサンディングの適切なレベルを残します。粗い表面と盲腸こと以前より少なく光沢があり、出血のいくつかの点状出血点を有します。腸間膜側の近くに研磨しながら、ここで血管が最も活発に出血れるように余分な注意が必要です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4： 腹壁の摩耗内臓が押し流され、それがラフ表示されるまで、筋肉壁の腹膜表面をサンディングされています。ちょうど腹壁内のサンドペーパーの上に見られる血管が頻繁に遭遇したが、実質的に出血しません。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6：デンプンの応用デンプンの光層は、腹部の側壁と腸の上に振りかけされています。二つの8の字縫合糸は、筋肉の壁に見られている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7：第二外科切開（a）の切開だけのオリジナルの切開部の左側に開始された（b）の新しい切開は胸郭に膀胱のレベルから拡張する必要があります。。。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。

図8：小腸（SB）の接着ループが右側壁に、互いに付着しています。見られているオリジナルの正中切開、今癒され、（社）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

trong>図9： 接着組織を切除します。 （a）と（b）は 、基礎となる腸に皮膚や腹壁の付着の「島」が付着した領域の周りに完全な円で切断することによって解放される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図10：腸全体の標本カッティング（b）は、他の側に一方の側（a）は上腸と皮膚と組織のサンドイッチを得られます。可視縫合糸の部分が試料を組織学のために使用される場合、削除する必要があります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図12： 免疫蛍光イメージング免疫蛍光α平滑筋交流のために染色し、手術後7日目の接着のセクション。スズは、（左）皮膚の毛包の真の染色および盲腸筋肉壁（中央）、および盲腸腔表面（右）の非特異的な染色を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

この手順の重要なステップは次のとおりです。徹底的に、穿孔を引き起こすことなく、盲腸を研磨腹部側壁に縫合糸を配置し、及びデンプンの適切な量を適用します。盲腸まで、または腸の小さな特定の部分に紙やすりをのみ適用されます。小腸大量のサンドペーパーの普及が著しいイレウスを引き起こす傾向があります。表面が粗くなり、十分な力で盲腸を研磨するように注意してください、しかし、壁の涙そのあまりありません。このバランスを見つけることは、いくつかの時間がかかることがあります。常に慎重に腸を処理し、腸を操作するためにシャープや歯鉗子を使用しないでください。誤って鉗子で小腸の腸間膜をつかむことによって、またはあまりにも強制的に腸を引っ張ることにより出血を引き起こすことは容易です。

涙が盲腸壁に発生した場合、手続きは終了し、動物を安楽死させなければなりません。我々の経験では、数日後に動物の死で盲腸涙結果、涙がREPAがある場合でも、よくIRED。また、盲腸壁の涙は、予測不可能な方法で炎症反応に影響を与えますスツールの流出の原因となります。

止血は手順の最後に完了する必要があります。いくつかの出血血管が再オープンし、停止しているように見える後に出血を開始します。疑いで、出血の点の周りの吸収性モノフィラメント8の字縫合糸を配置します。それは、最小の抵抗で組織も引き出す​​ことができるので、縫合糸のこのタイプは、絹または編組吸収性縫合糸に好ましいです。しかし、我々は、モノフィラメントが少ない炎症のよう絹または編組吸収性縫合糸は、癒着を誘導する腹部側壁に最も効果的であることを見出しました。

手順の最後にデンプンの適用は、癒着の形成を増加させるのに役立つが、我々は、デンプンの過剰な死を引き起こす炎症反応を引き起こすことを発見しました。澱粉はlightlに振りかけされるべきですY。それは固体層を形成することをあまりがあってはなりません。

最初にこの手順を学習する時、いくつかのマウスを失うことが一般的です。我々の経験では、死亡の最も一般的な原因は、原因で腸の過度に積極的な摩耗、および腸穿孔による敗血症によって引き起こされる腸閉塞に脱水されています。完全な止血手術の終了時に達成されない場合の出血によって引き起こされる死が発生する可能性があります。

癒着形成が不十分である場合には、より多くの澱粉を残し、または腹部の側壁に複数の縫合糸を配置し、盲腸および右側壁のより積極的な摩耗を使用することを検討してください。我々の経験では、十分な癒着形成足らずで腹部結果を再オープンする前に週未満を待っています。手術後のマウスの死亡率が高い一方、止血のためのより密接に検査し、少ない澱粉を適用し、盲腸の少ない積極的な摩耗を使用することを検討してください。慎重に監視することも重要です手術中のマウスの呼吸数。この手順で外科医ゲイン経験すると、死亡率は10％未満でなければなりません。

この技術は、主に盲腸および右腹部の側壁との間に癒着を形成するように設計されています。癒着はまた、多くの場合、小腸、肝臓、および正中切開の間に形成することになります。この技術を使用すると、通常は腹部の左側の癒着を引き起こすことはありません。この技術の限界は、腸と腹壁の間に癒着が腸のループ間の癒着よりも形成する可能性が高いということです。また、多くの場合、複数の手術を受けたヒトに見られる接着剤組織の完全凍結腹部完全に生じにくいです。

導入部で議論したように、マウスおよび他の種における腹部癒着、特にラットを製造するための多くの技術は、文献^6,12-14に記載されています。はるかに少ない公表protocoがあります。マウスでの癒着を作成するためのls。我々は、マウスにおける癒着の作成がラットよりも困難であるため、ほとんどの研究者は、ラットで彼らの技術を開発することを選択したと推測しています。しかし、トランスジェニックマウスおよび抗マウス抗体のより高い可用性のため、我々は大きな技術的な困難にもかかわらず、マウスにおける接着作成のための堅牢なモデルを持っている価値があると信じています。私たちは、公開されたラットのプロトコルの多くを試した後、このプロトコルを開発しました。当社は、盲腸に電気メスの使用などのラットにおける癒着を作成するための方法は、多くの場合、マウスが死亡する原因となることがわかりました。私たちは、このような単独の側壁虚血性ボタンを配置すること、または唯一の盲腸を研磨などの単一の介入を使用する技術によって生産さ癒着の密度で満足していませんでした。ここで本技術では死亡率を最小化しながら、我々は一貫して癒着を生成するために、試行錯誤を通じて、見つかった介入の組み合わせを表します。

一部の研究者は、癒着が時間の100％未満を構成するモデルを望むことができます。デンプンの適用を省略すると、約80％の付着率を低下させます。右腹部の側壁に配置された絹縫合糸の数を減らすと、さらに付着率が低下します。

我々の経験では、手術後7日目には、腸が腹壁に一貫して付着している最初の時点です。しかしながら、他の時点はによってより適切であり得ますプロジェクトの焦点に。例えば、接着空間への好中球およびマクロファージの遊走に興味を持って研究者は手術後最初の5日間で組織を採取することができます。一方、線維芽細胞によるコラーゲンの沈着は、最初の損傷後数週間のために行われ、このことは、手術後数週間の間隔をあけ時点で組織を検査することがより適切であろう。

この手順を実行しながら、外科ルーペは、手術野の拡大のために非常に有用です。手術顕微鏡も使用するが、異なる角度から手術フィールドを検査する外科医の能力を制限することができます。手順は、まったくの倍率で行うことができます。

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

CDMは、外科医のアメリカの大学（ACS）常駐研究奨学金によってサポートされていました。 MSHは、再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）臨床フェロー研修助成金TG2-01159によってサポートされていました。 MSH、HPL、およびMTLは、顎顔面外科学会（ASMS）/顎顔面外科財団（MSF）研究助成賞によってサポートされていました。 HPLは、NIHの助成金R01 GM087609とアンソニーシュウの名誉でイングリッド・ライとビル・シュウからの贈り物によってサポートされていました。 HPLとMTLは小児再生医療のためのHagey研究所とオーク財団によってサポートされていました。 MTLは、ガン/オリヴィエ・ファンドによってサポートされていました。