マイクロ流体精密小容量サンプル処理のためのプラットフォームとアコースティックマイクロデバイスで区切り生物学的粒子サイズのためのその使用

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

マイクロ流体デバイスの主な利点は、このように、試薬の無駄を削減し、貴重なサンプルを維持し、少量のサンプルを操作する能力です。しかし、強固なサンプル操作を達成するために、大規模な環境でデバイスの統合に対処する必要があります。マイクロ流体デバイスとの再現性、敏感な粒子の分離を実現するために、このプロトコルは、マイクロ流体デバイスを使用して0.15〜1.5ミリリットルのサンプルの正確な処理を可能にし、完全な自動化と統合マイクロ流体プラットフォームを提供します。このシステムの重要な側面は、チップの接続に信頼性が高く、柔軟な世界をもたらすモジュラーデバイスレイアウトおよび堅牢な固定具を含み、閉ループ試料収集システムのクリーニング及び反復動作を保証するプライミング工程を達成完全自動化液体ハンドリング。別のマイクロ流体デバイスは、このアーキテクチャと互換的に使用することができます。ここでは、acoustofluidicデバイスを組み込んで、細部のcharacterizエーション、パフォーマンスの最適化、および生物学的サンプルのサイズ分離のためのその使用を実証します。分離実験中にリアルタイムのフィードバックを使用して、サンプル収集を節約し、サンプルを濃縮するために最適化されます。複数の機器の統合を必要とするが、このアーキテクチャの利点は、付加的なシステムの最適化、装置の交換を容易に、かつ正確に、強固な試料処理なしで未知のサンプルを処理する能力を含みます。

サンプル分離及び分画は、マイクロ流体技術の応用の最も有望な分野の一つです。このようなサンプル処理の手順は、効果的な臨床診断、治療の開発、biosurveillance努力、および生命科学の研究と技術の進歩のために不可欠です。無数のマイクロ流体分離戦略は、流体浮遊粒子やコロイドのために、並びに化学と生物種のために実証されています。 ^{9 -}いくつかのレビューは、これらのフィールド¹に最近の進歩と発展の概要を提供します。これらのマイクロ流体分離技術（以下、「コアデバイス」と呼ばれる）の多くは、広範に特徴付けられているが、いくつかのレポートは、システムレベルでの試料の分離問題と考えられています。コアデバイスは、一般的に変位または圧力ポンプによって供給される流体では、フルオロポリマーチューブにインタフェース個々のセンチメートルスケールのチップです。増加した自動化、信頼性、およびサンプル量の減少を含む - - マイクロフルイディクスの約束があればしかし、現実になることであり、少なくとも同等の努力はコアデバイスが統合されてその中に完全に分離するシステムの設計に専念する必要があります。

また、バイオ検出するマイクロ流体アプローチのための大きな課題は、マイクロインターフェイスにマクロです。これは〜（マクロスケールの構成要素へのマイクロ流体デバイスの物理的な「世界・ツー・チップ」接続すると、典型的な臨床または分析試料の体積（〜0.1〜10ミリリットル）とマイクロ流体チップの内部容積の間のミスマッチのみならずいい0.01〜10μl）を、だけでなく、これらのサイズスケールをブリッジから生じる統計的サンプリングの制限。これらの問題は、サンプルの前処理と準備がバイオ検出の「弱点」であるという認識に貢献しています^。10この作品TAで説明プラットフォームこれらの課題に対処に向けたKES主要なステップ。

システム・レベルのビューを取って、このプロトコルは、〜10分の時間スケール上の（0.15〜1.5ミリリットルの範囲）正確に計量分析スケールのボリュームの信頼性の高い処理を詳述します。これは、「ワンボタン」の操作である：フラクションコレクションのためのサンプルと宛先のバイアルを含むソースバイアルがシステムに置かれたら、「実行」コマンドは、手続きを開始し、すべての手順は、コンピュータ制御されています。実行の終わりに、回収バイアルは分離された画分の下流の分析のためにシステムから除去することができます。

このシステムのコアデバイスは、試料からの哺乳動物細胞の大きさ（5〜20ミクロン）の粒子を抽出acoustophoresisチップです。それは、このように実行可能なホテルビルを分離する利点を提供し、高スループット（μL/分の100秒まで）、ラベルフリー、非接触であるため、Acoustophoretic分離は主にここで選択されています他のいくつかのマイクロ流体技術を一致させることができ、細胞からのSES。 ¹³とこのプロトコルの焦点ではなく、基礎となる概念の概要は、マイクロ流体分離への応用の理解を助けるために、以下の^-音響粒子の物理学は広く^{、11に記載されている}焦点を当てています。

液体で満たされたマイクロチャネル内で共振する超音波の定在波が低圧のノードに向かって粒子を駆動力を生じさせる圧力フィールドを生成します。力の大きさは、中心に音響は、理想的なサイズの細胞（〜7-15の分離に適している、粒子の体積に依存し、このように相対密度、粒子の圧縮率由来音響コントラスト因子および懸濁流体に^。14ウイルスサイズ（〜50-200 nm）の粒子からミクロン）。より大きな粒子は、圧力ノードに向かって移動します。しかし、力の大きさは非常に小さいため2-3ミクロン未満の粒子は、これらの小さな粒子または溶存種はほとんど全く動きません。音響分離の私たちの具体的な実装では、前述したように^、15は、流体流路を分割するために、薄い壁を内蔵しており、調整可能な、焦点位置の非対称の配置を可能にします。これは、デバイスの設計に柔軟性を追加し、パフォーマンス上の利点-含む増加分離の品質と速度が-され、完全に別の場所に記載^。16,17

しかし、この研究で説明したシステムレベルの設計アプローチの主な利点は、マイクロ流体コアデバイスの多種多様に適用可能であるということです。適切な調整は、入口/出口構成の変更を考慮してなさで例えば、慣性、流れ場分別、決定論的横変位（DLD）、および動電デバイスの様々なタイプを含むほとんどの他の連続フロー分離モードは、容易に組み込むことができます、流速、サンプルボリューム。様々なオンチップ・フィールドの種類（電気、磁気）または勾配（熱的、化学的）を持つデバイスは、このプラットフォームが対応し、チップ、または追加のハードウェアの統合への追加の接続が必要な場合があります。

このプロトコルは、マイクロ流体分離装置を設計するために、深い反応性イオンエッチング（DRIE、深い達成するために、エッチングと不動態化のサイクルを交互に使用し、多くの微細加工施設で利用可能なプラズマエッチングプロセスによってシリコンガラスチップを製造するために必要な手順を提供します垂直な側壁^18）と機能。次に、acoustofluidicデバイスの特性を分離するための最適な動作パラメータを決定するために、そして最終的に詳細に完全に統合された分離システムと生物学的サンプルを処理するための手順を説明します。典型的なデバイス特性評価結果とサンプル処理データは、次に提示し、議論されており、このアプロの主な利点ACHは、モジュール性、堅牢性、精度、自動化を含む、ハイライト表示さ​​れます。

1. Acoustophoreticデバイスの設計とフォトマスクレイアウト

注：一般的な考慮事項と微細加工プロセス設計とマスクレイアウトのためのガイダンスは、フォトマスクの設計の微細化のテキストとチュートリアルで見つけることができます^{19から21に} 。

1. 適切なCADソフトウェアを使用して、マスク1、流体層（表側）をレイアウトします。所望の用途に適切な試料注入及び分離を可能にするジオメトリを選択してください。
   1. 集束音響については_{、N F個の}共振周波数を提供するために、流体チャネル幅 W を設定します cは 、関連する流体中の音の速度であり、nは 900ミクロン幅の広いチャネル用の定在波ノード（ 例えば 、数ある式_F N = NC / 2ワットによれば1 MHzの、2より大きいノード共振がF ₂ = 1.65 MHz）で期待されています。
      注：パーティクル分離チャネルの終わり近くに別個の横方向位置を占めるのは、異なるコンセントから終了する必要があります。このプロトコルでは、粒子は、サイズによって分離されるので、 図1に示すように出口は、それぞれ、小粒子と大粒子のための出口、SPOとLPOが指定されています。
   2. 時間の粒子の長さを制御するための流路長さを設定し、特定の流速で分離電界にさらされます。長い粒子が分離力による移行するためのオンチップ滞留時間が大きく必要なチップ実装面積に対してトレードオフされなければなりません。
      注：私たちの音響中心にデバイスでは、流路が増加し、滞留時間（ 図2a）、チップ下に3つのパスになります。 200μL/分の典型的な総流量で、300×200μmの断面を、117 mmの長い分離チャネルを流れる粒子は、音響分野で平均2.1秒に費やします。
2. マスクlayo内の流体ポートを含めます標準化されたグリッド（5-mmピッチ）上に配置された標準的なチューブへの接続のためにユタ。個々のデバイスの製造及びダイシング時にお互いにマスクの位置合わせのための適切な基準マークを含めます。
3. マスク2、唯一の流体ポートを含むビア層（裏面）に、レイアウトします。 1をマスクするためにアライメント用の基準マークを含めます。

図1. Acoustofluidicデバイス。acoustophoreticデバイス・アーキテクチャの概略スケッチ。 （a）は上面図を、全体的なH-フィルタの構成を示す（正確な縮尺ではありません）。 （b）は黒でマーク位置でのチャネル断面の模式図は、圧力場を示し、（A）に破線（青の線を点線）、およびに向かって粒子を駆動音響次放射力（PRF）の意味節面（赤矢印）。チャネル断面10μm程度の厚さのメイン（300ミクロン幅）とバイパスチャネル分離壁と900×200μmです。 （c）の粒子分離の3D表現。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Acoustophoresisのためのマイクロ流体チップの2クリーンルーム製作

1. パターン両面にマスク2を使用してバック側の流体ポートは、標準的なポジティブレジスト、フォトリソグラフィ法により0.5mmの厚さ100 mmの直径<100>シリコンウエハを研磨します。 350〜400ミクロンの深さに深い反応性イオンエッチング（DRIE）によって、この形状をエッチングします。
2. ウェーハを裏返して、シリコンの他の側に標準ポジティブレジスト、フォトリソグラフィ法によりマスク​​1を用いたパターンのフロント側流体チャネルの形状。次に、フォトレジストを用いて第2の（空白シリコン）キャリアウエハにデバイスウェハをマウントします。
3. スルーエッチング（キャリアウエハは、DRIEツール表面を保護する）ポートの位置にシリコンを、200ミクロンの深さに、またDRIEにより、チャネルエッチ。レジスト剥離液を浸漬することにより、ブランクSiウエハからデバイスウェハをデマウント。
4. デバイスウエハとピラニア溶液（1：1の比で3硫酸と過酸化水素水）を用いて特徴のない厚さ0.5mmのホウケイ酸ガラスウェハをきれい。
5. 3ミリトールでのチャンバ圧力、千Nにおけるピストンの圧力、350℃の温度、および0.2ミリアンペア以下の電流滴まで750 Vを適用します。陽極以下のパラメータを用いて、ガラスやシリコンウエハを接合することによって流体チャネルを密封。
6. ダイシングソーのダイヤモンドブレードで個々のチップを離れてカットします。

3.最終的なデバイス組立

1. ピエゾトランスデューサアタッチメント
   注：超音波は、シリコン側に取り付けられた圧電トランスデューサによってマイクロ流体チップ内で生成されます。
   1. 時からWO-コンポーネント低粘度エポキシキット、両成分の推奨比率を秤量し、それらを徹底的に混ぜます。
   2. ピペットを用いてエポキシ混合物を分注し、薄い、均一な層（37.5×10×0.5mmの寸法のピエゾ用エポキシ混合物の約10μl）を作成するために、チタン酸ジルコン酸鉛（PZT）圧電セラミックに均等に分散。
   3. 適当な治具を用いて、後続のワイヤー取付け（ 図2aを参照）のための1つの側に張り出した領域を提供する、マイクロ流体チップと圧電セラミックのエポキシ側を位置合わせし、接触させる二つの成分をもたらします。コンポーネントのいずれかをクラックし、エポキシメーカーが推奨する温度及び時間で硬化しないように注意しながら、バイスにアセンブリを固定します。
   4. エポキシ樹脂が硬化した後、ワイヤはTを避けるために、ピエゾと最も短い可能な接触が、微細な先端のはんだごてで半田付けすることによって、圧電セラミックの各側に導くファインゲージを取り付けますhermally脱分極を。また、ピエゾにワイヤを接着する導電性接着剤を使用しています。

図2.流体ブレッドボード、チップを取り付け、ワールド・ツー・チップ・インターフェース。（a）は、音響マイクロ流体チップの写真添付ピエゾトランスデューサリード線付き（70×9×1mmの外寸）、分離の3つのパスを示しますチップダウンチャネル、（b）は 、カスタム流体ねじ継手とチップ・ツー・世界インタフェースのための機械加工チューブ部品、（c）のチップができるようにブレッドボードの開口部にまたがる、クランプ治具を用いて、流体ブレッドボードの下側に取り付けられましたtubiのインターフェースファン冷却、（d）に取り付けられたチューブ接続と冷却ファンとのブレッドボードの平面図、及び（e）のねじ継手の断面模式取り付けられたマイクロ流体チップとngの。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2. デバイスのマウントと世界・ツー・チップのインタフェース
   1. 「流体ブレッドボード」クランプ治具を使用して（スルーホールスレッドの定期的な間隔のグリッドとプレート）にチップを取り付けます。音響実験中の温度を調節するためのブレッドボードに冷却ファンを取り付けます（ 図2を参照）。
      注：一般的な駆動電圧で冷却ファンなしで動作させると、70〜80℃にデバイスの温度を上昇させます。これは、大幅に変更された流体中の音速に起因する共振周波数をシフトし、負処理されている任意の生物学的粒子の生存能力に影響を与える可能性があります。
   2. 以前に²²の他の場所に記載し、 図2に示すように、チップ・ツー・世界のコネクタにねじ込みます。これらのIに参加標準を使用して、入口と出口で、追加のチューブにnterface管¼ "-28 1/16のための労働組合"チューブ。

アコースティックフォーカス性能の4キャラクタリゼーション

注：音響焦点特徴付けのために必要なシステムコンポーネントは、物質一覧にまとめられています。 4.1ステップ以降は、ここで説明acoustofluidicデバイスに特定の動作を説明するのに対し、4.2以下、このプラットフォームで使用されるすべてのコアデバイスに適用されます。

1. システム構成
   1. 第3節で説明したように、流体ブレッドボード上の世界・ツー・チップ接続を使用してマイクロ流体チップを組み立て流体ポンプおよび回収バイアルに（例えば1/16「外径フルオロポリマーチューブなど）のチューブを使用して接続してください。 CCDカメラを装備した蛍光イメージングが可能な顕微鏡のステージ上ブレッドボードアセンブリを取り付けます。
   2. 小さなインナーdiameteの長さを接続しますR（ID）のチューブすぐにシステムを安定させ、チップアウトレット間の分流を制御する流量制限として機能するチップ（ 図 4参照）の後（0.006」が推奨されます）。他のすべての接続のために、このような0.01 "0.03"のような大きなIDチューブを使用します。
      1. μは流体の動粘度であり、長さL及び式R _Hを用いて内径D = ^128μL/πD4とチューブの各部分の流体力学的な流れ抵抗R _Hを推定します。与えられた流量Qでチューブの各長さに圧力降下Δ はΔP P = QR _hで与えられます。
      2. 使用されている分離方法のための適切なコンセントの間の流れを分割するために、リストリクタの長さの比を選択してください。このプロトコルにおける音響チップを搭載した最適な分離は、SPOを必要とします：approximaのLPO流量比をtely 65：35％。
      3. 出口流量制限器の長さを選択するように、それらの流体抵抗は、システム（適切に直列または並列に加算）の残りの部分における全抵抗よりも少なくとも3~4倍大きいです。この作品で使用されるacoustophoresisデバイスの場合、LPOとSPOのための35、65センチのチューブの長さが適しています。
         注：慎重に検討は、任意のマイクロ流体コアデバイスの R _hに与えられなければなりません。この作品で私たちの音響中心にチップの場合、R _hは、その比較的大きなチャネル寸法に低いため、接続されたチューブの抵抗は簡単にそれを超えています。小さ ​​いチャンネル寸法を有するデバイスの場合、チップの抵抗はシステムのチューブの残りの部分を支配することがあり、ケースと内蔵チャンネル R _hの設計と制御は、このプロトコルのステップ1の間の追加の考慮事項です。詳細設計の原則と指針は、文献に利用可能です^。23,24
2. システム検査
   1. マイクロ流体デバイスは何の欠陥がなく、すべての配管接続が密封されていることを確認するために、漏れがないか確認してください。シリンジを用いて、必要に応じて入口管を通して水を分配し、メインチャネル内の任意の流体漏れを監視します。
   2. チップを通して既知量を分注して、流量比が予想されることを確実にするためにコンセントから収集したボリュームを測定します。予想される容積比からの偏差は、コンセントまたは漏れ接続のいずれかで閉塞を示すことができます。
      1. システムの清浄度を維持し、前と任意の実験を実行した後、適切な洗浄液（例えば、漂白剤、エタノール、水）で、システム全体（流体チューブとチップ）フラッシュ目詰まり防止するために。
      2. 閉塞をクリアするには、clearコンセントを差し込むながら店のいずれかで目詰まりや閉塞が発生した場合、システムをフラッシュします。これが失敗した場合、フラッシング時に流れの方向を逆必要に応じて（手動で作動注射器を用いて）逆方向の流れの急速なパルスを印加します。まだ詰まりを除去できない場合は最後に、必要に応じてチューブまたはチップを、交換してください。
3. アコースティックフォーカシングのための周波数スキャンの設定
   1. シリンジで手動注入によって、このような脱イオン水、エタノール、またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）のような流体と（ 図1参照）は 、バイパス流路を満たします。この流体が処理されているサンプルと接触しないことに注意してください。別のバイパス流体を使用してノードの位置を調整するの詳細は他の場所に記載されている^16,17。簡単に述べると、ノードは、隔壁に近いエタノールなど、低密度のバイパス流体を使用する必要がある場合。近い入力サンプルストリームにノードを配置するための、グリセロール溶液として、密度の高い流体を選択します。
   2. （w / v）の5-8μmの蛍光ポリマービーズは、を含むPBSなどの緩衝液に懸濁し、約0.01％のビーズ溶液を作ります0.05％のTween-20およびビーズ溶液とサンプル注入口シリンジを充填します。 （これはバイパスチャネルと同じ流体である必要はありません）同じバッファを持つバッファ入口シリンジを埋めます。一般的に、バッファは（ステップ5.1参照）、アプリケーションに適合するように選択されることに注意してください。
   3. 顕微鏡ステージ上の流体ブレッドボードを使用すると、ちょうど視野内の両チャネル（分離およびバイパス）とコンセントの前にまっすぐなチャネル領域におけるチャネルの深さにほぼ中間焦点を当てます。追加の斜角外部光源は、画像データの成功した後の処理のために、チャネルの壁が見えるようにするために必要とされてもよいです。
4. 自動化された周波数をスキャンし、イメージキャプチャ
   1. ピエゾトランスデューサに励起信号を提供するために無線周波数（RF）アンプのファンクションジェネレータに（ 例えば 、RG-58は、BNCコネクタを装備した）シールドケーブルを使用して電気的接続を行います。必要に応じて、オシロスコープを接続実際の電圧を監視するための関数発生器の出力は、変換器に適用されます。
   2. 冷却ファンをオンにし、圧電変換器にRF増幅器の出力は、ピーク・ツー・ピーク12-25ボルト（V _ppの）の範囲内であるような関数発生器を設定します。
   3. 50〜200μL/分の間で同じ流量に両方の注射器を設定します。同一のモータの両方の注射器を駆動するために、単一のシリンジポンプを使用すると、流れに乱れを最小限にすることをお勧めします。
   4. このようなナショナルインスツルメンツのLabVIEWなどの実験の自動化ツールキットを使用して、周波数値との間の段差の大きさ、ピエゾ駆動電圧を開始および終了周波数を指定することで、周波数スキャンの手順を実行します。
   5. 各周波数ステップにおいて、システムが平衡化し、（推奨される10から100ミリ秒の間の露光時間）10次の分析のためのチップを流れるビーズの画像をキャプチャできるように15秒間電圧を印加します。
   6. EとACHは、ビーズがチャネルにわたって均一に再分配させ、以前に適用される周波数ステップの焦点でバイアスを除去するために、約20秒間の電圧をオフにし、周波数ステップを適用しました。
5. 画像解析は、共振周波数と焦点位置を決定するために、
   1. （例えば、このプロトコルで提供AF_freqScanPlotter.m MATLABスクリプトとして）画像解析のスクリプトを実行し、プロンプトで必要な情報を入力します。ステップ4.4で生成された画像ファイルのリストを選択し、スキャン開始を入力し、周波数とステップサイズを停止し、フルチャネル幅、壁の位置、および最終的には分離し、バイパスチャネルの両方を含む、分析するための画像領域を選択します。
   2. 解析スクリプトを観察し、各周波数ステップで撮像された画像の集合を平均化し、流れ方向に沿った強度値を平均化します。これは、蛍光強度の断面ラインスキャンにつながります。
      注：higheに対応する周波数目の強度は、共振周波数（ 図3、中段）、および最大強度が合焦位置（ 図3、下列）が発生したチャネル内の位置として定義されます。

よく結合した（A）のための周波数スキャンデータや不十分結合された（B）ピエゾとチップの図3。代表周波数スキャン。例。一番上の行：ビーズの蛍光強度（赤高い表し、青色は低強度です）。中段：各周波数における最大強度。下段：赤い破線最大強度の位置は、予測される焦点位置を示し、最大強度によって決定されるように赤い菱形は共振周波数を示します。G "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

5.自動分離

注：自動化された分離実験は、マイクロ流体チップに加わる力を集中サイズ依存音響による小さな粒子から大きな粒子を分離するために実行されます。必要なシステム構成要素は、材料リストに一緒にグループ化されます。

1. システム構成とサンプル調製
   1. 図4に示すように、この構成では、マイクロ流体分離チップを介してサンプルの自動処理を可能にし、コンピュータ制御のマルチポート選択バルブ、PC-インターフェース流量計、およびチューブ、シリンジポンプにマイクロ流体チップを接続するだけでなく、自動化されましたクロスコンタミネーションやサンプルのキャリーオーバーを除去するために、実験間のステップを清掃。
   2. 分離すべき細胞または粒子に適したサンプル緩衝液を使用し、または分析するアッセイで必要に応じて分離後に使用します。ステップ4.3.2のように、回復バッファー（必ずしも必要ではないが、バイパス流体）が試料流体と一致する必要があります。
      注：典型的には、生物学的サンプル（例えば、PBS）で使用される任意の水性緩衝液は、水に似た音響特性を有し、かなり音響装置の性能を変更しません。水と著しく異なる密度と粘度の試料流体の使用が可能ですが、唯一の重要なacoustophoresisの経験を持つ事業者にお勧め。

自動分離実験のために、図4の音響システム構成。青い線は、システムを介してメイン流路をたどります。すべての緑と黒の線は0.03 "の内径（ID）のチューブ、すべての青と灰色の線は0.01であり、「ある電子と、IDチューブxception 0.03であり、保持コイル、「ID、および0.006であり流量制限、「IDの。注射器は、緩衝液で満たされ、保持コイルが注射器に任意のサンプルや洗浄試薬の取り込みを防止するのに十分な量（550μl）を持っている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2. 分離法
   1. 前の実行状態。分離を実行する前に、洗浄試薬貯蔵（漂白剤、エタノール、バッファは）十分な流体があることを確認し、廃棄物の貯水池が完全ではなく、流体ラインをプライミングされている（ すなわち 、溶液で満たされました）。後者の条件は不明である、またはシステムがアイドリング後に初めて実行されている場合（例えば、特定の日の最初の時間）は、自動クリーニング手順を実行する場合（以下のステップ5.3を参照）。 RESEを無駄に流れるようにチップ店舗でバルブ3と4を設定します最初はrvoirs。
   2. 冷却ファンをオンにし、ステップ4.5で決定されるように、使用されている音響チップ用の共振周波数でファンクション・ジェネレータを設定します。関数発生器の電圧設定点を調整するように所望の分離に応じて12と25 V _ppの間のRF増幅器出力します。
   3. システムへのサンプル入力バイアル、バッファ入力バイアル、および適切な収集バイアルを接続します。ただ、そのピックアップチューブにサンプル入力のバイアルを取り付ける前に、渦バイアル簡単に定住している可能性のある粒子を再懸濁します。その後、バイアルを添付して、遅滞なく分離ルーチンを開始します。
      注意：処理されるべきサンプルは、潜在的に感染性物質が含まれている場合は、バイアルを密閉系を維持し、サンプルのエアロゾル化を防ぐために、ネジトップ型でなければなりません。バイオハザード物質を扱うときに、必要な保護具を着用し、REQを使用しながら、また、すべてのバイアルとチューブを扱います生物学的リスクグループとバイオセーフティレベルのためuir​​ed危険統制および手続材料に適しています。不確実性の場合には、制度の方針およびプロトコルを参照してください。
   4. 、バルブを制御するセンサーを流れ、全自動分離ルーチンを実行するためにポンプするために実験室の自動化ツールキットでプログラムを使用してください。
      注：ルーチンは、バルブを切り替え、シリンジポンプ離脱および注入を作動させると、モニタが正しく出力サンプル画分の収集のタイミングのためのセンサデータを流します。手動で行っているかのように主な手順は、5.2.4.3を通じて5.2.4.1で以下に要約されています。
      1. プライムピックアップチューブ。同様の方法でバルブ2にバッファ入力バイアルを接続するチューブがいること、それを確実にするために、バルブ1の空気入口プライム、プライム、完全に同時にバルブ1に接続するチューブを埋めるためのサンプル入力バイアルから約15μLを撤回します全く流体を含んでいません。最後に、いずれかを無駄に排出するバルブ1と2を切り替えますロードコイルに入った余分な流体または空気。
      2. 図5aに示すように、サンプルコイルを読み込みます。 250μlのサンプルを処理するための典型的なロードシーケンスは、最終的に200μL/分でリーディングバッファー35μlのに続いて200μL/分でサンプルを250μl、その後、50μL/ minで空気の25μlのを撤回することであり、 50μL/ minで空気の別の25μlの。
         注：すべてのボリュームと流量はユーザが選択可能です。このロードシーケンスは、流体プラグが分離装置を通って流れることになるかと逆の順序であることに注意してください。
      3. サンプルの注入を開始します。所望のレート（通常は100μL/分）でロードされた流体プラグを注入するようにシリンジポンプを設定します。その流れを確保するための流量センサとSPOとLPOで流量を監視することは着実にステップ4.1で決定された比率であり、その目詰まりが発生していません。
      4. 分離された画分を収集します。流量センサは、流量のスパイクを検出した場合、PAを示します第1のエアギャップのssageは、サンプル収集バイアルに（これはステップ5.2.1で開始）廃棄物からの対応する出力弁を切り替えます。
      5. チップからの試料が通過した後、流量センサは、第2のエアギャップを検出する観察。この時点で、無駄に戻って、出力バルブを切り替えます。ステップ5.2.4.2からロードされたフルボリュームが分配された後に、シリンジポンプの注入を停止し、流量がゼロになると、自動化ルーチンを終了します。
   5. 分離実験が完了した後、SPOとLPOサンプル収集バイアルを切断し、その後の分析のために適切に保管してください。
3. 自動クリーニングと汚染除去
   注：各サンプル、フラッシュを処理する前に、次の自動化ルーチンを使用して全体の流体システムを除染。
   1. throuフラッシュされ、過剰なクリーニングソリューションを収集するために、空のバイアルにSPOとLPO回収バイアル管と同様に、サンプルの撮像管を固定しますチューブをGH。
   2. 自動化システムのクリーニングルーチンを開始します。ステップ5.2で自動化された分離手順と同様に、プログラムは順次洗浄試薬と保持コイルをロードするためのバルブとシリンジポンプを制御する必要があり、システムを介してそれらをフラッシュします。
   3. 70％エタノールで、その後、10％の漂白剤でフラッシュし、水または適切な生理食塩水緩衝液で終わる（例えば、1×PBSまたはサンプル処理のために使用するバッファ）：以下のクリーニング・ルーチンを実行します。漂白剤やエタノール450μlを、水/緩衝1,000μL以下のフラッシュボリュームを使用してください。
   4. LPOの出口弁がブロックされたポートに設定されている状態で、フラッシングステップの間に、出口流量制限内の任意の潜在的な詰まりを除去するために、またその逆その後、SPOに各試薬を洗い流します。 SPOまたはLPOのいずれかがブロックされたときに、チューブと背圧の蓄積に気泡の発生を最小限にするために300〜500μL/ minの撤退および注入流量を維持します。
   5. Disca過剰フラッシングソリューション、それらが生物学的または化学的廃棄物を処理するための適切な手順を実行することで、収集されたバイアルをRD。

音響マイクロ流体デバイスの設計の主な機能は 、図1で強調表示され、完全に他の場所に記載されている^。15を簡単に、二つの流体の流れの流れサイドバイサイド分離チャネル内では、薄いシリコン壁によって並列バイパス流路から分離されます。一次放射力の大きさは、粒子の体積に比例するので、小さい粒子は、元のストリーム（ 図1B、C）に残っている間、大きな粒子は、隣接する回収流体流に位置する音圧のノードに向けて混合サンプル入力ストリームから移動します。細分化2チャンネルのアーキテクチャは、粒子分離^{17を向上させ、}別のバイパスチャネルの流体を使用してノード位置の調整を可能にする^。16流体ブレッドボードや備品は、チップ接続に世界のための堅牢なプラットフォームを提供し、モジュラーデザインは、流体チップ間の迅速な変更を可能にします（ 図2）。このConfigurationは、同様に、迅速かつ確実に（ 図2B、E）作られているシール、最大1,000 psiの、可逆流体接続を許可します。

チップの共振周波数f _{RESは、単純な} 1次元解析計算を用いて推定することができる（ステップ1.1.1参照）。私たちのデバイス断面のより完全な2D有限要素モデルから、2ノード共鳴用¹⁶予測される焦点位置が壁から225ミクロンであり、予想される周波数は1.68 MHzです。しかし、実際のデバイスのF _{解像度は、動作}温度、縦と横共振の結合に依存して、±100kHzで変化し得ます。プロトコルのステップ4で説明したようにそのため、デバイスの組立後、F _resが経験的に、関連する流量とピエゾ駆動電圧で検証されなければならない。 図3は 、200μL/分で取られた代表的な周波数スキャンを示していますメイン、バイパスチャネル内の水、および20 V _ppのでピエゾに供給されます。ピエゾマイクロ流体デバイスとの間の結合が良好である場合には、粒子が予測される焦点位置（ 図3A）に蛍光強度および移行における明確なピークが得られ、共振周波数でしっかりと焦点を当てます。貧しいカップリングがある場合にはこれとは対照的に、粒子が十分に焦点を当てず、周波数スキャンの結果を図3（b）のようになります。このようなデバイスでは、圧電変換器は、可逆接着剤が使用されている場合、再マウントする必要があるかもしれません。それ以外の場合、このデバイスは不向き高品質フォーカシングや速い流れで必要なアプリケーションのために重要です。 図3のデータは、その後の実験のために動作周波数の選択、及び電圧を知らせると、効率的な粒子の分離のために利用可能な速度範囲を流します。

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図5自動試料処理サンプルコイルにロードされた試料の（A）の回路図。 （B）の成功分離実験の代表的なフロープロファイル。 （C）SPO出口は約220秒で詰まった時に実行分離からプロファイルを流れ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

効果的な分離器であるチップを識別した後、それらは 、図4に示されたシステムに組み込まれている。全システム掃引容積は、主流路に沿って0.01 "の内径を有するチューブを使用することによって最小化される（青線）。 図5Aは、メイクアップを示していますシステムを介して注入された典型的なサンプルプラグの。 「リーディングバッファー」（〜35μl）を少量のpreceする必要がありますデ・サンプルは、分離チップを通って移動している間フローの変動を排除するためのフローのサンプルでは。 図5（b）は、成功した自動化された音響分離実験に起因するフローデータを示しています。成功した実行の主な機能は次のとおりですLPOとSPOの両方における流量（1）一過性の上昇を圧力が構築し、流体がシステムを通って流れ始めると、（2）気泡の通過を示す鋭いスパイク（インセットが原因二つの出口から不均等な流れにLPO前SPOに到達する必要があり、単一の気泡）の拡大プロファイルを示し、システムを介してサンプルを移動するような2つの気泡間の両方のアウトレットから（3）安定した流れ、 （4）全試料体積後の両方の出口での流量が徐々に減少がシステムに供給されます。問題の実行は、SPOは、約220秒後に詰まるとなったことが表示され、図5（c）に類似の流れプロファイルからすぐに明らかにされています。 THIで Sの場合、ステップ5.3で説明したのと同様のクリーニング手順は、チャンネルを邪魔を除くために実行する必要があります。

図6.デバイスの調整可能性：粒子サイズと電圧の影響 。 LPOで抽出されたポリスチレン微小球の割合は、圧電セラミックに供給される粒子サイズと電圧に依存します。各行には、装置を通る4総流量は1.62と1.64 MHzの間に印加された駆動周波数で、200μL/ minであるステップで説明したように決定し、共振周波数で異なる動作電圧に対応しています。エラーバーは、少なくとも3つの別々の実験の標準偏差を表します。 / 2014 / AN / c4an00034j http://pubs.rsc.org / EN /コンテンツ/ ArticleLandingから化学の王立協会の許可を得て再現し、修正されました。ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6に示すように、種々のポリスチレン粒子のサイズと効率的な分離のために必要な動作パラメータを実証するピエゾ駆動電圧を用いて分離した結果をまとめました。予想されるように、一般に、より高い電圧（ すなわち 、より大きな音響力）は、より小さな粒子を抽出するために必要とされます。駆動電圧は、無期限に起因する大きな熱放散と音響流の増加効果には、しかし、増加させることはできない^。13プロットは特定の駆動電圧（例えば、で有意に異なる回復を示す粒子の分離・粒子サイズのための一般的なガイドとして役立ちます10-および8.8 V _PPで2μmの粒子）が十分に分離します。一般に、このようなウイルス（〜100 nm）を細胞（〜10ミクロン）のような大きなサイズの差を有する粒子の集団は、差分の細胞はできる限り、迅速かつ効率的に分離することができ、erentのサイズ（例えば、6-8μmの円盤状赤血球および8-15μmの白血球）。他の細胞型で動作するために必要な具体的な条件は、細胞の形状、密度、圧縮率としてセルサイズに加えて、その音響コントラストに影響を与え、経験的に決定されなければなりません。このため、ステップ4の手順は、新しい細胞又は粒子タイプに使用可能な分離条件を決定するために有用であり、特定のacoustophoresis装置の品質を評価するだけでなく。

デング熱ウイルスでスパイク（A）Raji細胞（DENV）と（B）Raji細胞とゴールデンゲートウイルス（GGV）でスパイクボア腎臓細胞からの細胞にウイルススパイクサンプル。分離結果の図7.分離効率 。収集したパーセンテージは、特定のから出てくるウイルスや細胞の割合として定義されていますチップを出た合計金額に比べアウトレット。 （B）内のサンプルのみを、利用可能な少量に一度処理された一方のためのエラーバー（A）は 、3試験の標準偏差です。 1×PBSを全ての実験のためのバイパス流路に水を、サンプル緩衝液と回収流体として使用しました。チップの動作周波数は、16と20 V _ppの間の駆動電圧で、1.60と1.64 MHzの範囲であった。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ヒトRaji細胞（10 ⁵細胞/ mlで、平均粒径8~10ミクロン^25）、デングウイルス（DENV、10でスパイクした：生物学的粒子を分離するため、このプラットフォームの有用性を実証するために、我々は最初に、十分に特徴付けられた生物学的サンプルを処理するために使用されます⁵ PFU / mlで、直径約50nmの^26）。 図7ショーSPOとLPO（チップから収集した各粒子の総量と比較して、各コンセントから収集された各粒子タイプの割合と定義される）の両方に集めRaji細胞とDENVの割合。実験を三連で繰り返し、DENVを逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCRの）を用いて定量しながらRaji細胞を、コールターカウンターを用いて定量しました。

次に、システムの性能は、粒子の正確な物理的特性が不明であってもよく、利用可能な試料量が低いいる臨床試料を処理するためのより現実的なシナリオで試験しました。ここでは、最近同定されたゴールデンゲートウイルス（GGV）、ボア・コンストリクター腎細胞に感染ヘビの病原体の分離を評価した。GGVウイルス粒子の²⁷サイズがまだ測定されていないが、GGVはアレナウイルス科ファミリーに属しているので、それをの可能性があります100と150 nmの間で同様のサイズ^、28我々はGGVでサンプルを処理したがラジヒト細胞（ウイルスのためではない感染対象）、およびボア腎臓細胞（GGVのための感染症の対象、おおよそのサイズ10に（10 ⁴ PFU / mlに）スパイク10 ⁴細胞/ mlの両方の細胞型と²⁷ミクロン）。これらのサンプルは少量で利用可能であったように、一つだけの実験からの分離結果を図7（b）は、Raji細胞、ボア細胞の割合を示している。この研究で報告され、GGVはSPOとLPOから収集されます。細胞を血球計でカウントすることによってこれらの実験で定量化されたウイルスは、RT-qPCRにより定量しました。

このプロトコルは、自動化された生物学的サンプルの処理を実行するためのマクロスケール装置のマイクロ流体デバイスのシステムレベルでの統合を提供します。このプラットフォームのモジュールは、一例として提示したプロトコルを特徴付けるとacoustofluidic粒子分離装置の性能を最適化することに焦点を当て、それは任意の連続流装置に適応することを可能にする、と。このプロトコルの三つの主要な利点が強調表示されます：（I）モジュール性とチップ・ツー・世界インタフェース、デバイス性能の（ii）の強固な特性評価、および粒子分離のために正確に計量サンプル容量の（iii）の自動処理を。

私。モジュール化とチップ・ツー・世界インタフェース

図2に示すように 、マイクロ流体チップは、簡単に直接観察するための顕微鏡ステージ上にフィットするようにカスタムブレッドボードに搭載されています。ブレッドボードは、5ミリメートルピッチグリッド、ENAの＃6-40 UNFネジ穴が含まれていますチップを見せびらかすことは固定されるように、流体接続がなされます。流体接続は、ゴムフェイスシールガスケットとステンレス鋼の襟付き流体チップに対してどのシール、機械加工端部と管をPEEKています。このインタフェース方式は簡単にチップの交換と迅速なデバイスの再設計になり、他のシステムコンポーネントにいくつかまたは全く変更を必要とする、設けられたチップのフットプリントは、グリッド形式に準拠しています。例えば、我々は、連続フロー電気泳動のためのマイクロ流体チップ、熱細胞溶解^、29迅速な化学合成のための試薬 ​​の混 ​​合、および単一細胞捕捉と尋問でこのプラットフォームを使用していました。

II。デバイス性能のロバスト特性評価

任意のマイクロ流体分離装置の性能を最適化するために、その動作は、第1の完全に特徴付けされなければなりません。ここで説明するシステムは、これを行うための迅速かつ自動化されたプロトコルの開発をサポートしています。特定exampについてル音響集束装置、焦点品質、動作周波数、及びマイクロ流体チャネル内の集束粒子の位置は、各個々のデバイスのために測定されなければなりませんの。これらの測定は、高品質の分離のための最適なパラメータの組み合わせを同定するために、圧電駆動周波数、電圧、流量の範囲を掃引する必要があります。提示されたプロトコルは、自動的にこれらの調整可能なパラメータを変化させると、品質、周波数、および位置（ 図3）粒子集束の必要な測定値を生成するために後処理されているチャンネル内を流れる粒子の関連データーすなわち 、蛍光画像をキャプチャします。

音響装置の性能の完全な特性は異なる実験条件の下で、必要に応じて、手順4.4と4.5を繰り返す必要があります。例えば、チップの絶対的な焦点位置は、比較的低流量と高電圧で周波数スキャンを実行することによって発見されましたSは、ノード位置への完全な移行を確実にします。さらに、このような周波数スキャンは、（既知のサイズのポリスチレンビーズを使用して実行）デバイスアセンブリの品質を評価することができ、または（チップビーズで特徴づけされた後に）以前に未知の粒子タイプがシステムにどのように振る舞うかを決定するために。悪いエネルギー移動のものにも焦点を当てるものではありませんが、マイクロ流体チャネルへの圧電セラミックからの良好なエネルギー移動とチップは、タイトな高流量（> 1 ml /分）と低電圧（12〜15 V _ppの）に焦点を当てになります低流速（<100μL/分）、高電圧（> 20 V _PP）で。我々は、マイクロ流体チップと圧電セラミックの間の密接な接触は、流体への効率的なエネルギー伝達のために重要であることを見出しました。マイクロ流体チップと圧電セラミックを接着する最適な方法のさらなる調査は、高性能デバイスの信頼性の高い生産を可能にします。

最後に、完全なacoustophoretic装置の動作の画像は、マイクロスフェアを用いて行わ分離実験から、関連した動作パラメータの関数としてSPOとLPOから収集粒子数とステップ4（ 図 3）の画像ベースの周波数スキャンの測定を組み合わせることによって得ることができます図6に示すように、ステップ5で説明したように、自動化された実験のような一連の急速に粒子を分離するためのデバイスを動作させるために最適なパラメータ空間をユーザに知らせる、個々のデバイスの性能と可変性を特徴付けることができます。

III。粒子分離用の自動小サンプル処理

成功し、正確なマイクロ流体チップベースのサンプル処理のためには、確実かつ正確にメーター、負荷は、提供し、彼らが通過などの流体の体積を収集することが重要です。試料容量が小さい場合、この精度は特に重要です（〜0.1〜1ミリリットル）を、臨床または研究実験室の設定では一般的です^。30正確なサンプル処理が時サンプルのフィードバックのないデバイスに注射器や点滴へのサンプルのマニュアル撤退を採用し、従来のマイクロ流体実験に挑戦しています分離されていて、それが収集されるタイミング。提示されたプロトコルは、自動化されたサンプルコイルの負荷を採用し、少量の試料の再現可能な分離を可能にするために流量センサからのリアルタイムのフィードバックと結合された分注。

図5は、典型的な分離実験からSPOとLPOで測定されたフロープロファイルを示します。まず、少なくとも35マイクロリットルのリーディングバッファーは、サンプルは、音響チップに到達する前に、安定した流れを確保するためにロードされます。リーディングバッファーにサンプル希釈が過剰になるため、100μlのより少ないサンプルボリュームは、このようなシステム構成に推奨されていません。空気のプラグは目の初めに使用されていますサンプルの混合および希釈を防止し、流量センサの指標となる、以下の流体からサンプルプラグを分離するリーディングバッファーの前に電子注入。流体がシステムを通って移動し始めると、初期の過渡後、両方の店の鋭いスパイク信号は、最初の気泡の通過を示しています。これらの過渡現象は、シリンジポンプが停止した後にゼロに第2の空気の泡が通過し、別のスパイク、サンプルがシステムを通って流れるように安定した流れの長い期間が続き、最終的には流量の最終的な減少しています。

流量センサを通る空気プラグの通路は、このように、非サンプル流体体積​​によって失われた試料および希釈を最小化し、サンプルの収集を開始および停止するためのバルブを切り替えるトリガーポイントとして使用されます。処理されたサンプルボリュームの閉ループ調量は実験開始前に、これらの値の入力サンプルが変更されるたびに再プログラムする必要がなくなります。この機能は、特に重要なサンプル容量は、多くの臨床サンプルの場合には、例えば、制限されている場合。リアルタイムフローモニタリングはまた、トラブルシューティングに役立ちます。貧しいラン（ 例えば 、コンセントのいずれかで形成詰まり）が図5bのように、結果として得られる流れプロファイルから直ちに明らかです。

柔軟性とacoustofluidic分離の有効性提示システムアーキテクチャを使用して、精製DENVとGGVウイルスストックを実証するために、マイクロ流体チップを介して細胞株にスパイクして処理することにより分離した。 図7aは、Raji細胞を97として、ウイルスから十分に分離されたことを示していますチップを出るRaji細胞の％は、それによってSPOにDENVの高度に濃縮されたサンプルを残して、LPOであることが見出されました。比較では、DENV分離の効率がDENVの70％がSPOで見つかったチップを出て、低かったです。これはseparatiのターンによって誘発されるわずかな対流混合に起因することができますチャネルではなく、LPOにRaji細胞と一緒に移行するいくつかのDENV粒子に可能性が高いです。流線を横切って横方向に移動する細胞は、低レイノルズ数で、彼らといくつかの流体をドラッグします。このメカニズムだけでなく、非特異的な表面吸着することにより、ウイルス粒子は、LPOに移します。それにもかかわらず、SPOにおけるDENVの高度に濃縮されたサンプルは、 デノボシーケンシングは、ウイルスを検出し、識別するために使用される場合、例えば、重要な利点です。

図7bは、一つの実験では、チップを出るボア細胞の約70％は、Raji細胞のためにほぼ100％の分離効率と比較して、LPOで発見されたことを示しています。したがって、より小さな音響力をもたらす、Raji細胞と比較して、2つの細胞型間の分離性能の差は小さい平均サイズまたはボア細胞のより低い密度に起因し得ます。これらの仮定、ボアの大きさ、密度及び形態を確認または反論するために、ボア細胞の（通常は付着成長）懸濁液中の細胞を正確に、さらなる調査のための努力を測定する必要があります。同じ実験では、同様にDENVでの実験に、回復GGVの大部分は、ウイルス画分の濃縮を示す、SPOから出ました。

提示されたデータは、生物学的サンプルのさまざまなを処理するためのエンジニアリング広く、該当するプラットフォームの固有の課題を強調表示します。重要なことは、生物学的相互作用は、物理的および機械的効果として大きな役割を果たして始めることができます。しかしながら、これらの予備実験は、臨床および研究の用途において、サンプル処理のために、このシステムアーキテクチャを使用しての力と約束を実証します。堅牢、よく特徴付けられた設計システムとして、このプラットフォームは、新しい科学的な質問の回答を求める機能を提供します。

The authors have nothing to disclose.

This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL’s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235