蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

我々は、共役高分子ポリジアセチレン（PDA）およびフルオロフォアの生体分子の検出のためのPDAのリポソームの表面に付着した間のFRETを示しています。 PDAのリポソームはまた、プローブとして使用する生体分子のための彼らの表面上の受容体分子が含まれていました。リガンド - 受容体相互作用感知機構の基礎であり、フルオロフォアおよびPDA間でFRET効率の変化につながる。

FRETは、エネルギーは非放射長距離双極子-双極子相互作用を介して¹基底状態の受容体分子に励起されたドナー分子から転写されるプロセスです。検体は、PDA ^2,3,4,7に接続されている受容体と相互作用した後に、PDAのUV-Vis電子吸収スペクトルの青色シフト（ 図1）：本センシングアッセイでは、PDAの興味深い性質を利用しています。 PDAの吸収スペクトルにおけるこのシフトは、FRET効率の変化につながるのPDA（アクセプタ）とローダミン（ドナー）との間のスペクトルの重なりの変化（J）を提供しています。このように、分析対象物（リガンド）と受容体間の相互作用は、ドナーフルオロフォアおよびPDAの間のFRETで検出されます。特に、我々は、モデルタンパク質分子ストレプトアビジンの検出を示す。我々はまた、ウシ血清アルブミン（BSA）へのリポソーム表面の共有結合機構をFRETを示しています。 tとの間にこれらの相互作用彼重層リポソームとタンパク質分子をリアルタイムで感知することができる。提案手法は、小さな化学と大生化学分子を感知するための一般的な方法です。蛍光が測色よりも本質的に敏感であるので、アッセイの検出限界はサブナノモル範囲または下位⁸にすることができます。さらに、PDAは、複数のセンサがドナーとPDAリポソームの表面に付着している別の受容体と官能のPDA（アクセプター）を使用して開発することができることを意味FRETにおける普​​遍アクセプタとして作用することができる。

PDAリポソーム^4,5,6のA.合成とキャラクタリゼーション

注1：すべての実験手順全体すべてのコンテナにラッピングアルミ箔を使用した光から、PDAソリューションを保護します。

注2：リポソーム溶液の2つの異なるセット（BとC）は、次の手順を実行して調製した携帯情報端末（PDAリポソームの合成とキャラクタリゼーション）。

1。 N-ヒドロキシスクDiacteylene（NHS-PCDA）の合成

1. リポソームを調製するために、必須成分PCDA-NHSが必要です。我々は、以下の手順を使用して、PCDA-NHSを合成しました：
2. - （3 - （ジメチルアミノ）プロピル）-3 - エチルカルボジイミド塩酸塩（0.144グラム、0.713ミリモル10,12 - pentacosadiynoic酸（PCDA）（0.267グラム、0.713ミリモル）、N-ヒドロキシスクシンイミド（0.0914グラム、0.786 mmol）と1を追加）の乾燥CH _{2 Cl 2}中（20ミリリットル）。
3. 2時間室温で溶液をかき混ぜる。
4. 慎重にrを用いて溶媒を除去otary蒸発器は、乾いた薄いフィルムを得た。
5. ジエチルエーテル（25ml）と水（25ml）で3回洗浄残渣を抽出する分液ロートを使用します。
6. 半時間し、MgSO _4（1.0g）を有する有機層を乾燥させます。白色固体粉末（0.24グラム、> 90％）を取得するために回転蒸発により溶剤をフィルタリングして削除します。
7. 核磁気共鳴（NMR）の下で最終化合物を分析します。
8. ¹ H NMR（300 MHzで、DMSO）δ（ppm）は：0.893（トン、3H）、1.268（M、26H）、1.512（メートル、4H）、1.754（メートル、2H）、2.252（トン、4H）、 2.365の（m、1H）、2.610（m、1H）【、2.842（S、2H）。

2。リポソーム製剤^5,6,7

1. PCDA-NHS：1,2 -ジミリストイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DMPC）:: 8：1：ジクロロメタン20mlで1 PCDAを溶かす。
2. 凝集物を除去するためのフィルター紙を使用してソリューションをフィルタリングします。
3. モノマーの薄膜を得るために完全に溶媒を蒸発させる。
4. vacの下で一晩薄い膜を乾燥uumで。
5. ハイド所望の濃度（0.65から1 mM）のリポソーム溶液を作るために、脱イオン水（50ml）でフィルム。
6. 76でプローブ音波処理により得られた懸濁液を超音波処理℃〜18分間。
7. 慎重に脂質凝集物を除去するために濾紙を通してソリューションを渡す
8. 4単量体の自己組織化を促進するために℃で一晩で溶液を冷却する。最終的な解決策は、光学的に透明であるべきである。
9. 空気中にペンレイUV源を（4.5 mW / cm ^2）を使用して約2分間紫外線の254nmの照射により自己組織化ジアセチレンモノマー（リポソーム）重合する。
10. リポソーム溶液は、少なくとも2週間室温で安定していた。時冷蔵ソリューションは、より安定していた。

ローダミンタグ付きウシ血清アルブミン（BSA-RH）修正PCDAリポソームのB.準備

1。リポソーム表面へのBSA-Rhの結合

1. PBS BU内のBSA-Rhを溶かすffer（イオン濃度は0.01Mであった、pH7.2）を、BSA-ローダミン水溶液の1.210μMの最終濃度を作る。
2. 室温でステップA.2。（上記参照）で調製したリポソーム溶液10mlに、BSA-ローダミンの2ミリリットル（1.2μM）を追加します。
3. タンパク質のリジン残基からNHS基により活性化されたカルボン酸へのアミン基の結合のための古典的な反応は、（ 図2の反応スキーム）に続いてきた。 NHS-PCDAは、NHS-アミン反応（ 図2、ステップ2）を用いてリポソームを用いた共有結合タンパク質分子のために（ 図2、ステップ1）に設計されました。 NHSは、順方向のアミンカルボン酸反応を駆動する優れ残しエージェントです。適切な条件の下でこの反応の収率は定量的であるべきである。
4. フリーBSA-Rhの除去 ：脱イオンwに：スペクトラ/ポアバイオセルロースエステル（CE）膜（100,000 MW、C O）を浸し15分間ater。この膜は、脱イオン水で未反応のBSA-ローダミン（分子量〜66000 Da）の透析のために使用されます。
5. 透析膜への解決策を慎重に移す。
6. 透析中の2時間で水、8時間、14時間、24時間、および36時間に変更します。
7. アルミ箔で覆われたバイアル中で最終的な解決策を収集します。

CでのSR-ジアミンの合成とビオチンタグ付きリポソーム

1。代わりに、ステップ2.1でDMPCを使用するのではなく、我々は、ビオチンタグ付き（を使用する1,2 - ジオレオイル-sn-グリセロ-3 - ホスホエタノールアミン-N-（ビオチニル）（ビオチン-DOPE）。

1. 2.2から2.9を介してすべての手順に従ってください。
2. 代わりに工程BにおけるBSA-Rhから、タグ付けSulphorhodamineを（SR-ジアミン）を使用します。
3. B中のすべてのステップに従ってください
4. この調製品に含まれるリポソームは、ビオチンを含んでおり、その表面に、SR-ジアミン。その後の工程は一つの例外を除いて、AとB（上記参照）と同様であった：ストレプトsolutiに追加されましたFRET効率の変化を介してビオチン - ストレプトアビジン相互作用を調べるために。

D.描写結果

タイトル図。反応を説明する漫画とは、リポソーム表面に発生する処理（ステップBに従って調製）FRET。

用いてリポソームにタンパク質アタッチメントのA.モニタリング¹ FRET

のモニタリングは、ローダミンおよび工程Bで調製したリポソームのPDA間のFRET

BSA-Rhの励起および発光スペクトルとPDAの吸収スペクトル（ 図3A）取られます。我々ははっきりと見ることができ、PDAの吸収スペクトルとBSA-RHと重なるの発光スペクトル。これは、FRETメカニズムの共振要件を満たします。重合前後のBSA-ローダミンタグ付きのリポソームは、UV-Vを使って分析したで、蛍光分光。隔離されたドナーとアクセプターのために、効率がドナー-アクセプターの距離（r）と^J1（J値）に大きく依存しているフレット。発光の消光が原因光重合後青PDAの電子吸収スペクトルの出現によるローダミンとPDA間のFRETの（ 図3B）が観察される。我々のケースでは、効率が可視領域の未重合リポソームのJ = 0のため、未重合リポソームおよびローダミンはゼロですフレット。

我々は、それらの表面にNHSを含んでいなかっただけのPDAリポソームと同様の実験を行った。これらのケースでは、BSA-RHは、リポソームの表面にタグ付けされていませんでした。その場合には、ローダミンやPDA（rの_平均値 ）との間の平均距離は、フォースターの半径（R ₀ = 2.8 nm）に比べてはるかに大きかった。したがって、私たちは、蛍光強度の大きな減少は見られなかった。この観察LSOは時rが<2.8 nmの蛍光消光が支配的であることを示唆している。

JとR _0の値は、次式を用いて計算した：[1]

J（λ）=∫F _D（λ）は_εA（λ）は^λ4dλ

R ₀ = 0.211 [K ² N ^-4 問_D J（λ）] ^1月6日

青PDAの吸光係数^（ε）-1前ストレプトアビジンの添加に〜2000から10000 M ^-1 cmの範囲である。青PDAの吸光係数は、光重合条件に依存しています。 [2]例えば、εの値は、より長い時間を重合させたソリューションのために大きくなります。さらに、ジアセチレンモノマーの自己集合はまたε値に影響を与える可能性があります。 J calcul管理ポイントは、これらの変化を考慮に入れて、そして、彼らは、ビオチン-ストレプトアビジン分子の相互作用に起因するPDAの吸光係数の変動を反映していますJ値は実験的なPDAの吸収とSR-101の放射データを用いて計算されます。 J値の変化は、溶液（ 図4C）にストレプトアビジンを添加した後、PDAの電子吸収スペクトルのシフトに起因している。 J値の単位はM ^{-1 cm -1で4} nmである。

のB.モニタリングは、ビオチンタグ付きリポソーム溶液にストレプトアビジンを加えてFRET

注1：ローダミン、上記工程Cで調製したリポソームのPDA間のFRETのモニタリング。

Sulphorhodamineタグ付きの励起および発光スペクトルは、ジアミン（SR-ジアミン）とPDAの吸収スペクトル（ 図4A）取られます。未重合および重合ビオチンタグ付けされたリポソームは、紫外 - 可視用いて分析した及び蛍光分光。ローダミン（SR-101）の排出量は、FRETによる発光消光を示唆している（ 図4B）、重合後に約45％減少している。リポソーム溶液2mlにストレプトアビジン溶液40μlのアリコートを（1μM）を追加します。溶液へのストレプトアビジンを加えて、J値の変化は（ 図4C）が観察される。ビオチンは、ストレプトアビジン、PDAリポソーム（ 図1〜645 nmの中心）の青色のピーク強度に特異的に結合するように、（F igure 1S）が観察され、540nmの吸収ピークの増加は減少した。 図4Dは、FRETの変化を示したもので効率。ストレプトアビジンの濃度の増加とともに減少したFRET効率は、我々の予測と一致している。

ストレプトアビジンの各40μlのアリコートを添加した後、SRの排出を記録します。我々は、ストレプトを添加した後、ローダミン排出量の着実な増加を観察したアビジン（ 図5）。ローダミン排出の増加は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用を以下sulphorhodamineの発光スペクトルとPDA吸光度スペクトルのJ値の低下によるものです。分子レベルでは、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用は、より熱力学的に安定な赤PDAの形^2〜青PDAの形で減少し、その結果、PDAの有効共役長の微妙な変化につながる。これは、J値の変化の基礎となっています。興味深いことに、PDAのリポソームへの共有結合または非共有結合したビオチンの分子間相互作用の微妙な違いは、私たちのセンシングアッセイ^4を使用^して調べることができる。

我々はまた、対照実験を行ったとストレプトアビジン - ビオチンシステムのものと同じ実験条件下で対照試料の発光をモニターしています。対照実験は以下から成ります、その上に（1）に含まれるリポソームのソリューションは、ビオチン表面は同じボリュームと濃度の緩衝液を加え、（2）それらの表面上のビオチン受容なしリポソーム溶液を同じボリュームと濃度のストレプトアビジンを添加した。ストレプトアビジンを添加した後、ビオチンタグを付けたリポソーム溶液の強度が強化された強度を示したが、対照実験のリポソーム溶液の強度（例えば、 図2Sを参照してください）、その一方で、発光強度の減少を示した。これは、溶液の希釈に起因すると考えられる。これらの実験は、ソリューションの強化された排出量は、特定の分子間相互作用に起因することが示された。

ローダミンおよびPDAのペアのためのフォスター半径_{（R0）〜2.80} nmであることが（eq.2）が算出される。これは、rは 2.80 nmであるときに孤立したPDA-ローダミンペアについて、励起状態のローダミン分子の50％がPDAに転送し、そのエネルギーを持つことになります。

我OBSビオチンが共有結合のPDAバックボーンに接続されている場合、排出の増加はリポソームに非共有結合したビオチンのそれよりも2〜3倍大きいこと^erved。4これらの結果は、我々の提案するシステムが相互作用の微妙な違いを区別するために敏感であることを示唆しているリポソームに付着共有結合および非共有結合した受容体に起因する振動子（ビオチンとリポソーム二重層の間のリンカー）であった。分光光度計のスキャニングとデータ集録機能に応じて、タンパク質相互作用のリアルタイムモニタリングは（ミリ秒で秒単位まで）（UV-Vis分光法で）この感知システムで可能です。

図1の青と赤のPDA溶液の吸収スペクトル。 （挿入図）光学顕微鏡写真は、デジタルカメラで撮影した。

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PCDA-NHSの合成については、 図2。反応スキーム（ステップ1）。タンパク質のアミン置換基（ステップ2）にPCDA-NHSの反応。ステップ2 PCDAモノマーのカルボン酸へのタンパク質のリジン残基の結合の基礎である。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3A。観測の変化は効率がPDAの吸収スペクトルの変化によるものであるFRET。重合前のBSA-Rhの排出とPDAの間で吸収が、FRETのための要件であるBSA-RH放出を伴う重合PDAの吸収が重なる後の重複はありません。ローダミンは、ドナー（赤）とアクセプター（青）として重合したPDAのリポソームの行為です。

図図3（b）前（青）とPCDA重合（赤）後、BSA-Rhのタグを付けたリポソームの蛍光スペクトルを示す。ローダミン排出量の大幅な減少は、ローダミンおよびPDAの間のFRETにより観察された。

。。図4Aのスペクトルの重なり（J）、PDA（青または赤）の吸収スペクトルとSulphorhodamineの発光スペクトル（オレンジ色）の変化を図4Aは、極端な条件のための代表的なスペクトルであるストレプト過剰の溶液に添加したときには、です。図4Aは、ストレプトアビジンの過剰の添加後ほぼ完全に青から赤PDAの変換を示しています。これは明らかに、J（スペクトルの重なり）はPDAの吸収スペクトルのブルーシフトに伴って増加することが分かる

図4B。蛍光スペクトル前（青）と後の（rED）リポソーム重合。

図4C FRETの条件：。リポソーム溶液にストレプトアビジンを加えてドナー（sulphorhodamine）とアクセプター（PDA）との間にJの変化。

図4Dは。リポソーム溶液にストレプトアビジンを加えてドナー（sulphorhodamine）とアクセプター（PDA）の間の効率の変化をFRET。

図5のPDAリポソーム溶液にストレプトアビジンのアリコートを添加した後のローダミン発光スペクトル。挿入図は、SR-101スペクトルの放射の変化の大きなビューを示しています。

私たちは、NHS-アミン反応を用いてリポソーム表面にタンパク質のリジン残基の選択的な結合を行った。これは、ベースの方法は、リポソーム表面に結合するビオチン - ストレプトアビジン結合とタンパク質（BSA）のリアルタイムモニタリングを行うことが可能ですフレット。同様の手順は、それらの選択的受容体と様々なタンパク質相互作用の結合ダイナミクスを研究するために適用することができる。蛍光色素のスペクトル特性に応じてJ値の変化を提供する蛍光団を選択する際の柔軟性があります。 PDAは、普遍的な受容体である。従って、複数の蛍光体および受容体と一緒に、PDA（アクセプター）の使用は、私たちに複数のセンサーを提供する可能性を提起する。当社のセンサーの感度はサブナノモルになり、最適化と、それをさらに向上させることができる。センサーの特異性は、受容体とリガンドとの間の分子間相互作用を利用して調整されています。これらのセンサーはまた、より大きな粒子のために使用することができるウイルスや細菌などのUCH。

我々は2.8nmであると計算される等、ドナーとアクセプター間の距離効率とJ-valueをFRET、またドナー-アクセプター間の距離のような貴重な情報を集めることができました。これは、我々の予測と一致した。陰湿なウイルス、細菌および他の有害な微生物のモニタリングの大きなニーズがあるように、我々は危険な生体分子の検出をリアルタイムで行うことができるハンドヘルドデバイスを製造するために願っています。

特別な利害関係は宣言されません。

この仕事のための財政支援は、SIUCで全米科学財団、国立衛生研究所（NIH）、材料技術センター（MTC）やオルダを通じて提供されていました。我々は、FE-SEMの購入のための助成金（CHE-0959568）でNSFに感謝します。我々は有用な議論を教授マシュー·マッキャロルに感謝したいと思います。ジュリアレイエスは彼女の奨学金や財政支援のためにCOLCIENCIAS、コロンビア庁と大学Pedagogica Y Tecnologicaデコロンビアに感謝します。