Monitoraggio in tempo reale delle interazioni ligando-recettore mediante Bonifico Fluorescence Resonance Energy

Dimostriamo FRET tra polydiacetylene polimero coniugato (PDA) e fluoroforo attaccato alla superficie dei liposomi mobile per il rilevamento di biomolecole. Liposomi PDA conteneva anche molecole recettoriali sulle loro superfici di biomolecole da utilizzare come sonde. Interazioni ligando-recettore portare a cambiamenti nella FRET efficienza tra il fluoroforo e PDA che è alla base del meccanismo di rilevamento.

FRET è un processo in cui l'energia non è radiativamente trasferita da una molecola donatrice eccitato ad un stato fondamentale molecola accettore a lungo raggio attraverso interazioni dipolo-dipolo ^1. Nel saggio di rilevamento presente, utilizziamo una proprietà interessante di PDA: blu-shift in UV-Vis spettro di assorbimento elettronica PDA (figura 1) dopo un analita interagisce con i recettori collegati al PDA ^2,3,4,7. Questo spostamento nello spettro di assorbimento PDA fornisce cambiamenti nelle sovrapposizione spettrale (J) tra PDA (accettore) e rodamina (donatore) che porta a variazioni del FRET efficienza. Pertanto, le interazioni tra analita (ligando) e recettori vengono rilevati tramite FRET tra fluorofori donatori e PDA. In particolare, ci mostra il rilevamento di un modello di streptavidina molecola proteica. Abbiamo inoltre dimostrato il legame covalente-di albumina di siero bovino (BSA) alla superficie del liposoma con FRET meccanismo. Queste interazioni tra tegli liposomi bistrato e molecole proteiche possono essere rilevati in tempo reale. Il metodo proposto è un metodo generale per il rilevamento chimico piccole e grandi molecole biochimiche. Poiché fluorescenza è intrinsecamente più sensibile colorimetria, il limite di rilevazione del test può essere in sub-nanomolare gamma o inferiore ^8. Inoltre, PDA può agire come accettore universale FRET, il che significa che più sensori possono essere sviluppati con PDA (accettore) funzionalizzato con donatori e recettori diversi attribuiti sulla superficie dei liposomi PDA.

A. Sintesi e caratterizzazione di liposomi PDA ^4,5,6

Nota 1: Proteggere la soluzione dalla luce PDA utilizzando foglio di imballaggio di alluminio su ogni contenitore in tutte le fasi sperimentali.

Nota 2: Due insiemi diversi di soluzione liposomi (B e C) sono stati preparati seguente procedura A (Sintesi e caratterizzazione di liposomi PDA).

1. Sintesi di N-idrossisuccinimmide Diacteylene (NHS-PCDA)

1. Per preparare liposomi, un ingrediente essenziale PCDA-NHS è necessaria. Abbiamo sintetizzato PCDA-NHS utilizzando la seguente procedura:
2. Aggiungere acido 10,12-pentacosadiynoic (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-idrossisuccinimmide (0,0914 g, 0,786 mmol) e 1 - (3 - (dimetilammino) propil)-3-etilcarbodiimmide cloridrato (0,144 g, 0,713 mmol ) in secco CH ₂ Cl ₂ (20 ml).
3. Agitare la soluzione a temperatura ambiente per 2 h.
4. Rimuovere con cautela il solvente utilizzando revaporatore Rotary per produrre un film secco sottile.
5. Utilizzare imbuto separatore per estrarre il residuo con etere etilico (25 ml) e acqua (25 ml) tre volte.
6. Asciugare lo strato organico con MgSO ₄ (1,0 g) per mezz'ora. Filtrare e rimuovere il solvente mediante evaporazione a rotazione per ottenere una polvere bianca solido (0,24 g,> 90%).
7. Analizzare composto finale in Risonanza Magnetica Nucleare (NMR).
8. ¹ H NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H).

2. Preparazione liposomiale ^5,6,7

1. Sciogliere PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) :: 8: 1: 1 in 20 ml di diclorometano.
2. Filtrare la soluzione con un filtro di carta per rimuovere aggregati.
3. Evaporare completamente il solvente per produrre un film sottile di monomeri.
4. Asciugare il film sottile durante la notte in vacUum.
5. Idratare la pellicola con acqua deionizzata (50 ml) per ottenere una soluzione di liposomi concentrazione desiderata (0,65-1 mM).
6. Sonicare la sospensione risultante con un sonicatore sonda a 76 ° C per ~ 18 min.
7. Attentamente filtrare la soluzione attraverso un filtro di carta per rimuovere gli aggregati lipidici
8. Raffreddare la soluzione a 4 ° C per una notte a promuovere l'auto-assemblaggio dei monomeri. La soluzione finale dovrebbe essere otticamente trasparente.
9. Polimerizzare i monomeri autoassemblati diacetylene (liposomi) mediante irradiazione con 254 nm di radiazione UV per ~ 2 min utilizzando una sorgente di raggi UV Pen (4,5 mW / cm ²⁾ in aria.
10. La soluzione di liposomi è stabile a temperatura ambiente per almeno due settimane. La soluzione era più stabile quando refrigerato.

B. Preparazione di rodamina-etichetta albumina sierica bovina (BSA-Rh) liposomi modificati PCDA

1. Legame di BSA-Rh alla superficie del liposoma

1. Sciogliere BSA-Rh in PBS buffer (concentrazione ionica era 0.01M, pH 7,2) per rendere la concentrazione finale di 1,2 pM di BSA-rodamina soluzione.
2. Aggiungere 2 ml (1,2 pM) di BSA-rodamina a 10 ml di soluzione di liposomi preparati nel passo A.2. (Vedi sopra) a temperatura ambiente.
3. Classica reazione per il legame di gruppi amminici della lisina residui di proteine ​​acido carbossilico attivato da NHS gruppo è stato seguito (schema di reazione in Figura 2). NHS-PCDA è stato progettato (Figura 2, punto 1) per covalentemente molecole di legame con le proteine ​​liposomi con NHS-ammine reazioni (Figura 2, punto 2). NHS è un ottimo agente lasciando che guida l'ammina-acido carbossilico reazione in avanti. La resa di questa reazione in condizioni appropriate devono essere quantitative.
4. Rimozione di libero BSA-Rh: Immergere un Spectra / Por Biotech Cellulosa Ester (CE) membrana (MW C O: 100.000) in acqua deionizzata water per 15 min. Questa membrana viene utilizzata per dialisi di non reagito BSA-rodammina (Molecular peso ~ 66.000 Da) in acqua deionizzata.
5. Trasferire accuratamente la soluzione per la membrana di dialisi.
6. Cambiare l'acqua a 2 ore, 8 ore, 14 ore, 24 ore, e 36 ore durante la dialisi.
7. Raccogliere la soluzione finale in un flaconcino coperto con un foglio di alluminio.

C. Preparazione di SR-diammina e biotina-tag Liposomi

1. Invece di utilizzare DMPC nel passo 2.1, useremo biotina-etichettato-(1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-phosphoethanolamine-N-(Biotinyl) (biotina-DOPE).

1. Seguire tutti i passi da 2.2 a 2,9.
2. Invece di BSA-Rh nel passaggio B, utilizzare Diamine Sulphorhodamine tag (SR-diammina).
3. Seguire tutte le ulteriori iniziative in B.
4. I liposomi di questa preparazione conteneva biotina e SR-diammina sulle loro superfici. I passi successivi sono simili a A e B (vedi sopra) con una sola eccezione: streptavidina è stato aggiunto alla soluzione moltosulla indagare biotina-streptavidina interazioni attraverso cambiamenti nel FRET efficienza.

D. Rappresentante Risultati

Figura titolo. Un cartone spiegare la reazione e FRET processo si verificano in superficie del liposoma (preparata seguendo passo B).

A. Controllo dei attaccamento proteina di liposomi mediante FRET ¹

Controllo di FRET tra rodamina e liposomi PDA preparati al punto B.

Spettri di eccitazione e di emissione di BSA-Rh e spettro di assorbimento del PDA sono prese (Figura 3A). Si può vedere chiaramente che lo spettro di emissione di BSA-Rh sovrappone con lo spettro di assorbimento del PDA. Questo soddisfa il requisito di risonanza per il meccanismo di FRET. BSA-Rodamina liposomi tag prima e dopo la polimerizzazione sono stati analizzati con UV-Vè e spettroscopia di fluorescenza. Per il donatore e accettore isolato, l'efficienza di FRET dipende fortemente donatore-accettore distanza (r) e J ¹ (j-value). La tempra in dell'emissione si osserva (Figura 3B) a causa di FRET tra rodamina e PDA a causa della comparsa di spettro di assorbimento elettronica di PDA blu dopo fotopolimerizzazione. Nel nostro caso, l'efficienza FRET è zero per liposomi non polimerizzato e rodamina perché J = 0 per liposomi non polimerizzato nella regione del visibile.

Abbiamo eseguito esperimenti simili con solo liposomi PDA che non contenevano NHS sulla loro superficie. In questi casi, BSA-Rh non è stato etichettato alla superficie dei liposomi. In tal caso, la distanza media tra rodamina e PDA (r _media) era molto maggiore del raggio Forster (R ₀ = 2,8 nm). Quindi, non abbiamo osservato una forte diminuzione l'intensità di fluorescenza. Questa osservazione unaLSO suggerisce che l'estinzione della fluorescenza è dominante quando r <2.8 nm.

J e R ₀ valori sono stati calcolati usando le formule seguenti: [1]

J (λ) = ∫ _D F (λ) _A ε (λ) dλ λ ⁴

R ₀ = 0,211 [k ² n ^-4 Q _D J (λ)] ^1/6

Il coefficiente di estinzione (ε) di blu-PDA è nell'intervallo 2000-10000 ~ M ^-1 cm ^-1 prima dell'aggiunta di streptavidina. Il coefficiente di estinzione del blu-PDA dipende dal foto-polimerizzazione condizione. [2] Ad esempio, i valori ε sarà maggiore di una soluzione che è stata polimerizzata un tempo più lungo. Inoltre, l'auto-assemblaggio dei monomeri diacetylene possono influenzare i valori ε. La J calculzioni tener conto di questi cambiamenti, e riflettono i cambiamenti nei coefficienti di estinzione a causa di PDA biotina-streptavidina interazioni molecolari. valori di J sono calcolati utilizzando l'assorbimento sperimentale PDA e SR-101 dati sulle emissioni. I cambiamenti nei valori J sono dovute a spostare nello spettro di assorbimento elettronica del PDA dopo l'aggiunta della soluzione di streptavidina (Figura 4C). L'unità di valori di J è M ^-1 cm ^-1 nm ^4.

B. Monitoraggio di FRET con aggiunta di streptavidina-biotina al etichettato soluzione liposomi

Nota 1: Controllo di FRET tra rodamina e liposomi PDA preparati al punto C sopra.

Spettri di eccitazione e di emissione di Sulphorhodamine-etichettato diammina (SR-diammina) e spettro di assorbimento del PDA sono prese (Figura 4A). Liposomi non polimerizzato e polimerizzato biotina contrassegnati sono stati analizzati utilizzando UV-Vise spettroscopia di fluorescenza. L'emissione di rodamina (SR-101) è diminuita di circa il 45% dopo la polimerizzazione (Figura 4B) suggerendo quenching emissione causa FRET. Aggiungere 40 aliquote da 1 ml (pM) di soluzione di streptavidina a 2 ml di soluzione di liposomi. Con l'aggiunta di streptavidina alla soluzione, cambiamenti di valore J è osservato (Figura 4C). Come biotina si lega alla streptavidina, l'intensità del picco di blu PDA liposoma (~ centrato a 645 nm in figura 1) è diminuita, mentre un aumento del picco di assorbimento a 540 nm è osservato (F IGURA 1S). Figura 4D mostra cambiamenti del FRET efficienza. Il FRET efficienza è diminuita con l'aumento della concentrazione di streptavidina è inoltre coerente con la nostra previsione.

Registrare l'emissione SR dopo ogni aggiunta un'aliquota 40 microlitri di streptavidina. Abbiamo osservato un costante aumento delle emissioni rodamina dopo l'aggiunta di streptavidina (Figura 5). Questo aumento di emissioni rodamina è dovuto ad una diminuzione del valore di J per lo spettro di emissione Sulphorhodamine e spettro di assorbimento PDA seguendo biotina-streptavidina interazioni. A livello molecolare, biotina-streptavidina interazioni portare a sottili cambiamenti nella lunghezza effettiva coniugazione del PDA che si traduce in una diminuzione del blu-PDA forma ad una più termodinamicamente stabile red-PDA modulo ^2. Questa è la base delle variazioni dei valori J. È interessante notare che le sottili differenze nelle interazioni molecolari per covalentemente o non covalentemente biotina legato al liposoma PDA possono essere esaminati utilizzando il nostro test di rilevazione ^4.

Abbiamo anche eseguito esperimenti di controllo sono monitorati e l'emissione dei campioni di controllo nelle stesse condizioni sperimentali, come quelli per streptavidina-biotina sistema. Gli esperimenti di controllo sono costituiti da: (1) Liposomi soluzioni che contenevano biotina sulla lorosuperficie sono stati aggiunti soluzione tampone stesso volume e concentrazione, e (2) soluzione di liposomi senza biotina recettori sulla loro superficie sono stati aggiunti di streptavidina stesso volume e concentrazione. L'intensità della biotina-etichettato soluzione liposomi dopo l'aggiunta di streptavidina mostrato intensità maggiore, ma l'intensità della soluzione liposoma degli esperimenti di controllo (per esempio, vedere Figura 2S), invece, mostra una diminuita in intensità di emissione. Ciò è attribuito alla diluizione della soluzione. Questi esperimenti indicano chiaramente che l'emissione maggiore della soluzione era dovuto a specifiche interazioni molecolari.

Raggio di Forster (R ₀₎ per la coppia rodamina e PDA si calcola (Eq.2) di essere ~ 2.80 nm. Ciò significa che per isolati PDA-rodammina coppie, il 50% delle molecole eccitate rodammina statali avranno la loro energia trasferita al PDA quando r è 2,80 nm.

Abbiamo obs erved che quando biotina è covalentemente attaccata alla spina dorsale PDA, l'aumento di emissione era 2-3 volte maggiore di quella dei non-covalentemente legato alla biotina liposomi. ⁴ Questi risultati suggeriscono che il nostro sistema proposto è sensibile a distinguere le sottili differenze nelle interazioni al trasduttore (linker tra biotina e bilayer liposomiale) dovuta ai recettori legati covalentemente e non covalente a liposomi. Seconda funzionalità di acquisizione dei dati di scansione e del, spettrofotometro monitoraggio in tempo reale (in millisecondi in scala seconda volta) di interazioni proteina (nella spettroscopia UV-Vis) sono possibili con questo sistema di rilevamento.

Figura 1. Spettri di assorbimento di soluzioni PDA blu e rosso. (Interno) al microscopio ottico scattate con una fotocamera digitale.

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Figura 2. Schema di reazione per la sintesi PCDA-NHS (passo 1). Reazione di PCDA-NHS al sostituente amminico delle proteine ​​(step 2). Fase 2 è la base del legame di residuo di lisina delle proteine ​​ad acido carbossilico di PCDA monomero. Clicca qui per ingrandire figura .

Figura 3A. VARIAZIONE osservata FRET efficienza è dovuta ai cambiamenti nello spettro di assorbimento del PDA. Prima di polimerizzazione non vi è alcuna sovrapposizione tra BSA-Rh di emissione e di assorbimento PDA ma dopo sovrapposizioni di assorbimento di polimerizzazione PDA con BSA-Rh di emissione, che è il requisito di FRET. Rodamina è un donatore (rosso) e liposomi polimerizzati PDA agire come accettore (blu).

Figura3B. Spettri di fluorescenza di BSA-Rh liposomi etichetta prima (blu) e dopo PCDA polimerizzazione (rosso). Una forte diminuzione delle emissioni rodamina è stato osservato a causa di FRET tra rodamina e PDA.

.. Figura 4A sovrapposizione spettrale (J) per cambiare PDA (blu o rosso) spettro di assorbimento e spettro di emissione Sulphorhodamine (arancione) Figura 4A è lo spettro rappresentativo per condizioni estreme, cioè quando un eccesso di streptavidina è stato aggiunto alla soluzione. La figura 4A mostra una quasi completa blu-rosso trasformazione PDA dopo l'aggiunta di un eccesso di streptavidina. Si vede chiaramente che J (sovrapposizione spettrale) aumenta con blu-shift dello spettro di assorbimento PDA

Figura 4B. Spettri di fluorescenza prima (blu) e dopo (red) polimerizzazione liposoma.

Figura 4C Condizione per FRET:. Cambiamento J tra donatore (Sulphorhodamine) e accettore (PDA) con l'aggiunta streptavidina alla soluzione di liposomi.

Figura 4D. FRET cambiamento efficienza tra il donatore (Sulphorhodamine) e accettore (PDA) con l'aggiunta streptavidina alla soluzione liposoma.

Figura 5. Spettro di emissione Rhodamine dopo l'aggiunta di aliquote streptavidina alla soluzione PDA liposoma. Inset mostra una vista più ampia di variazioni delle emissioni nel SR-101 spettri.

Abbiamo effettuato legame selettivo di residuo di lisina della proteina sulla superficie del liposoma con NHS-ammina reazione. Questo metodo basato FRET è capace di fare monitoraggio in tempo reale di biotina-streptavidina vincolanti e proteine ​​(BSA) di legame alla superficie del liposoma. Analoga procedura può essere applicata per studiare la dinamica di legame di proteina diversi con i loro recettori selettivi. C'è flessibilità nella scelta fluorofori che forniranno cambiamenti nei valori J seconda delle caratteristiche spettrali dei fluorofori. PDA è un accettore universale. Pertanto, l'uso di PDA (accettore) con fluorofori multipli e recettori aumenta la possibilità di fornire noi più sensori. La sensibilità dei sensori è sub-nanomolare e con ottimizzazione, può essere ulteriormente migliorata. La specificità dei sensori viene regolato attraverso l'uso di interazioni molecolari tra recettori e ligandi. Questi sensori possono essere utilizzati anche per le particelle più sUch come virus e batteri.

Siamo stati anche in grado di raccogliere preziose informazioni come la distanza tra donatore-accettore, FRET efficienza e J-valore, ecc La distanza tra il donatore e accettore viene calcolata pari a 2,8 nm. Questo era in linea con la nostra previsione. Poiché vi è una grande necessità di monitoraggio di virus, batteri insidiosi e altri microrganismi nocivi, vogliamo fabbricare un dispositivo portatile a mano che può eseguire in tempo reale di rilevamento di biomolecole pericolose.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito attraverso la National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materials Technology Center (MTC) e ORDA a SIUC. Ringraziamo NSF per una borsa di studio (CHE-0959568) per l'acquisto di un FE-SEM. Vorremmo ringraziare il Prof. Matteo McCarroll per le discussioni utili. Julia Reyes si ringraziare Colciencias, Agenzia colombiano e Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia per la sua borsa di studio e sostegno finanziario.