特定の遺伝子の過剰発現やノックダウン後にラモスB細胞に体細胞高頻度変異の評価

我々は、過剰発現またはshRNAを含む人間ラモスB細胞株とどのようにこれらの細胞で体細胞高頻度変異を測定するためのコンストラクトのレトロウイルスやレンチウイルス感染症を実行する方法について説明します。

B細胞は、V（D）J組換えにより生成された低親和性の抗体とその生活を始める。しかし、病原体を検出すると、免疫グロブリン（Ig）遺伝子の可変（V）領域は、高親和性抗体の^1,2の結果、約10万倍以上の体細胞超変異（SHM）を通じて、ゲノムの他の部分よりも変異している。さらに、クラススイッチ組み換え（CSR）は、特定の病原体に必要とされる免疫応答の種類に応じて、異なるエフェクター機能を有する抗体を産生する。 CSRとSHMの両方は、ウラシルを生成するためにDNAのシトシン残基をdeaminates活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（AID）によって開始されています。これらのウラシルは、最終的には突然変異と^1-3組換えにつながる、修復経路のエラーが発生しやすいフォームによって処理されます。

マウスでの研究の組み合わせから来るSHMとCSRの分子の詳細、主要な細胞、細胞株、およびセルの- fの私たちの現在の理解REE実験。マウスモデルは、多くの修復因子（例えば雄、MSH2、MSH6、EXO1、およびポリメラーゼ^η）4-10のために重要な役割を示す遺伝子ノックアウトとゴールドスタンダードのまま。ただし、すべての遺伝子がノックアウトの研究のために適している。例えば、いくつかの二重鎖切断修復タンパク質のノックアウトはembryonically致死的またはB細胞の開発^11-14損なう。また、時々SHMやCSRにおけるタンパク質の特定の機能をノックアウトによって引き起こされる多くの世界的な欠陥によってマスクされることがあります。さらに、マウスでの実験以来、細胞株における個々の遺伝子の発現が候補遺伝子^15-18識別し、特徴付けるために、ますます人気の第一歩となっている変更、時間がかかる場合があります。

ラモス-構成的にSHMを受けるバーキットリンパ腫細胞株は- SHM ^18-24勉強に人気の細胞ラインのモデルとなっています。ラモス細胞の一つの利点は、内蔵の便利なセミを持っていることです。SHMの定量的尺度。野生型の細胞は、突然変異、IgM抗体の発現をノックアウト変異のいくつかをピックアップとして、IgMを発現しており。したがって、蛍光活性化細胞のスキャン（FACS）によってIgMの損失をアッセイすることSHMのレベルのための読み出し迅速に提供します。 SHMのより定量的な測定は、直接抗体遺伝子をシーケンシングすることによって得ることができる。

ラモス細胞はトランスフェクションが困難なので、我々はそれぞれ過剰発現カセットまたは短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、のいずれかを含むレトロウイルスやレンチウイルスのコンストラクトで細胞を感染させることによって増加または個々の遺伝子の発現を低下している安定した誘導体を生成する。ここで、我々はラモスの細胞に感染してから、SHM（図1）上の特定の遺伝子の役割を調べるために、これらの細胞を使用する方法について説明します。

1。準備サンプルと細胞

1. 過剰発現のDNAの中規模の準備（ミディプレップ）またはshRNAを含むコンストラクトとレトロウイルスパッケージングベクトルpKat2またはレンチウイルスのパッケージングベクターをpVSV - G、pMDLg / pRRE、およびpRSV -リビジョン^25を実行します。各構築物とpKat24μgの（レトロウイルス感染症の場合）またはpVSV - G、pMDLg / pRRE、およびpRSV - REVのパッケージングベクター（レンチウイルス感染症のため）の各1.5μgのDNAのいずれかに6μgのDNAを使用してください。
2. BOSC 23メディアを準備します。トランスフェクションのために、両方unamendedダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）だけでなく、完全DMEMを使用してください。完全DMEMを作成するには、DMEMのボトルに、1％HEPES緩衝液、1％ペニシリン - ストレプトマイシン - グルタミン（PGS）、および10％新生児ウシ血清（NCS）を追加します。
3. ラモスメディアを準備します。感染のステップでは、RPMIのボトルに1％HEPES、1％PGS、および10％ウシ胎児血清（FBS）を追加することによって、RPMI - 1640培地（RPMI）を完成させる。単一の細胞播種ステップ、mについて、2日間完全RPMIでラモスの細胞を成長させる4分間400 × gで細胞をスピンダウンし、無菌瓶に0.2μmのフィルターで上清をフィルタリングすることにより、AKE"エアコン"のメディア。必要になるまで他の完全なメディアと同様に、馴化培地は4℃​​で保存されます。
4. 細胞がコンフルエントに50から60パーセントでトランスフェクションの日になるように10 mLの完全DMEMで100 mmのプレートに分割3 × 10 ⁶ BOSC 23細胞トランスフェクションの前日。あなたがトランスフェクトする予定の各ベクトルのいずれかのセル板を作る。それは細胞が余りに長くのための文化の中で保管されていないことが重要です。良好な感染を保証するためにトランスフェクションし、感染のステップの両方に低継代数の細胞または最近解凍した細胞を使用してください。
5. あなたの実験のためのコントロールが含まれています。トランスフェクションと感染症の場合は、陰性対照（トランスフェクトされていないまたは非感染細胞）と陽性対照（GFPおよびピューロマイシン耐性遺伝子を発現するウイルス）を作成します。 shRNAのノックダウンexper用imentsは、スクランブルまたは無関係のshRNAコントロールとよくに感染する。

2。トランスフェBOSC 23細胞

1. 37 unamended DMEMと完全DMEMの瓶を温める℃に
2. BOSC 23細胞から培地を取り除き、完全DMEM 5 mLで置き換えます。ステップ2.6の使用時まで37℃のインキュベーターにセルを返します。
3. （<1秒）して簡単にボルテックス5分間室温でFuGENE 6トランスフェの瓶を温める。
4. 1.5 mlマイクロ遠心チューブに分注して600μLunamended DMEMを。
5. 600μLunamended DMEM、渦の短時間（<1秒）に30μLのFuGENE 6トランスを希釈し、5分間室温でインキュベートする。メディアに直接ピペッティングするように注意してください。 FuGENE 6トランスは真空管の側面に接触させてはいけません。
6. 6μgのコンストラクトとどちら4μgのpKat2（レトロウイルス感染症）または1.5μgのpVSV - G、pMDLg / pRRE、およびpRSV - REV（レンチウイルス感染症）の各DMEM / FuGENE 6トランスミックスに、渦BRIを追加します。その後efly（<1秒）、および25分間室温でインキュベートする。
7. BOSC 23細胞へのDNA / DMEM / FuGENE 6トランスミックスを追加し、24時間37℃のインキュベーターに戻す。
8. 24時間後、トランスフェクトされた細胞に5mLの完全DMEMを追加し、さらに24時間、37℃インキュベーターに戻す。

3。ウイルス粒子を収穫

1. 10 mLの注射器とトランスフェBOSC 23細胞からの培地10mLを回収する。
2. 注射器の端に0.45μmのフィルターを取り付け、新しい15 mlポリプロピレンチューブにメディアをフィルタします。
3. -80直ちにウイルスのメディアを使用するかを2mLクライオバイアルに1mLのアリコートに凍結℃に
4. バイラルメディアを収穫した後、効率的なトランスフェクションは、FACSによるポジティブコントロール細胞で発生したことを確認してください。構造が蛍光（例えばGFP）または細胞表面マーカー（例えばTHY1）のどちらかが含まれている場合これはまた、すべてのサンプルに対して行うことができます。

1. 24時間感染の前に6ウェルプレートに完全RPMIで2 × 10 ⁵細胞/ mLのラモス細胞のシード2 mLの。再び、良い感染症を保証するために、低継代数の細胞または最近解凍した細胞を使用してください。
2. ウイルスの凍結アリコートを使用している場合、37℃で速やかにウイルスのメディアを解凍℃に
3. 10 mg / mlのポリブレンの3μLを1 mLのウイルスのメディアを混在させること。ポリブレンの最終濃度は、3 mLの合計量で10μg/ mLのはずです。
4. 細胞へのウイルス/ポリブレンミックスを追加し、ピペッティングによりよく混ぜる。前述のとおり、いずれかがよく感染していないコントロールとして使用する必要があります。代わりに1 mLのウイルスからもこのために1 mLの完全RPMIと3μLポリブレンを追加。マッチしたネガティブコントロールとよくものを感染してください。我々はまた、FACSによる感染効率を決定するために、GFPを含有するベクターでよくものを感染させる。
5. 室温で90分間3000 X gで6ウェルプレートを遠心する。
6. にプレートを返す48時間37℃のインキュベータ。
7. 48時間後、室温で4分間400 × gで15 mLポリプロピレンチューブに感染した細胞をスピンダウン。細胞ペレットを乱さないようにするために確認してから、吸引してメディアを取り出します。新鮮RPMIに懸濁し。
8. FACSによる陽性対照試料中の感染効率を確認してください。構造が蛍光（例えばGFP）または細胞表面マーカー（例えばTHY1）のどちらかが含まれている場合以前と同様に、すべてのサンプルに対してこの操作を行うことができます。
9. （適切な場合）細胞の選択を開始します。私たちのshRNAを含むコンストラクトでは、すべてのピューロマイシン耐性カセットを含んでいます。我々は0.25μg/ mLのピューロでshRNAを感染ラモスのセルを選択します。我々は、ラモス細胞の誘導体は時々ピューロマイシンに感受性を改変示すと、それゆえ、我々は各デリバティブのためにピューロマイシンの濃度を最適化するためにカーブを殺す実行することを見つける。また、その選択を確認するためにピューロマイシンと非感染コントロール細胞を治療すると効果的です。

単一の播種は、次のいずれかの方法で行うことができます：手動でソートまたはFACSによる。

1. FACS：シード1セル〜プレートアダプタを使用してFACSソーターを使用して、/ウェル、96ウェルプレートに40％RPMI/40％条件付けmedia/20％FBSを100μLが事前に満たされた。このメソッドは、多くのプレートあたりの単一細胞クローンを与える。
2. 手動：セルを数える。 40パーセントRPMI/40％エアコンmedia/20％FBSで10細胞/ mLの細胞のアリコートを希釈する。各シードプレート用希釈細胞の10 mLを使用してください。異なるクローンは、異なる濃度（3〜20細胞/ mLの範囲）でいくつかのプレートを設定するために有用であるため、この段階で変数の回復が表示されます。複数の細胞から発生するクローンを避けるために、より少ないoutgrowths）を作り出すものを使用してください。希薄化後の細胞を100μLで種子を96ウェルプレートにマルチチャンネルピペットを使用してください。
3. 2週間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
4. 個々のウェル未定義をチェックするR播種後一日細胞の存在を確認するために顕微鏡。単一の細胞は正しい深さに焦点を当てる必要があるため、見つけるのは簡単ではありません。 96ウェルプレートの底部に刻印も数字に焦点を合わせることに役立つはず。 FACSソーターを使ってシードしたときにほとんどの井戸は、セルを持っているので、細胞が見つけやすくなります。
5. 2週間後、生育したコロニーは、かろうじて下から板を見て、肉眼で見ることができます。彼らは、顕微鏡下で確認する方がはるかに簡単です。コロニーはプレートに異なるウェル内の同じエッジに沿って成長するだけでなく、通常は最もコロニーのエッジに沿って成長する傾向がある。マーク強固な細胞増殖のウェルと1 mLのRPMIで24ウェルプレートに細胞を移し、37℃のインキュベーターに戻す。
6. 1 × 10 ^5〜1 × 10 ⁶細胞/ mLで細胞を維持する。室温で4分間400 × gで細胞を回転させ、必要に応じてメディアを削除することでメディアを変更します。 1mLの新鮮RPMIと交換してください。
7. いくつかのDの後に成長のaysは、6ウェルプレートに細胞を移し、37℃のインキュベータ内で成長し続けます。
8. 3週間後に、IgM抗体の損失（後述）のためのクローンを分析する。
9. さらに2週間細胞を培養し続けるし、5週の時点で再びクローンを分析する。

6。分析：IgM抗体の消失（3週間と5週間）

1. 各ウェルから× 10 ⁵細胞を1.5 mlのマイクロチューブに分注して5と、室温で4分間400 × gで細胞をスピンダウン。未染色のコントロールのコントロールやshRNA -ノックダウン各ウェルから細胞だけでなく、一つのサンプルを使用してください。
2. 1mlのPBSで細胞を洗浄し、室温で4分間400 × gで再びスピン。
3. PBS（未染色の対照）またはPBSを50μLに再懸濁し+ PE標識α-ヒトIgM抗体の1時20希釈。 1時間氷上でインキュベートする。
4. 室温で4分間400 × gで細胞をスピンダウン。
5. cを洗う各時間は、室温でPBSと4分間400 X gのスピンを1 mLで二回ells。
6. 上清を除去し、PBS 100μLに懸濁します。 FACSチューブに再懸濁した染色された細胞を移す。
7. FACSのマシンを用いて細胞を分析する。
8. shRNAのノックダウン細胞とコントロールからセル^- IgMの割合を比較する。前に述べたように、FACSによって測定されるIgM抗体の損失は、ラモス細胞のSHMの信頼性の高い半定量的な尺度です。

7。分析：定量的RT - PCR（5週間）でノックダウンを確認

1. 注し3 × 10 ⁶各ウェルから細胞を、室温で4分間400 × gでスピンダウン。
2. 細胞のアリコートからRNAを準備します。我々は、メーカーの推奨に従ってトリゾールを使用。
3. RNAプレップからcDNAを準備します。我々は、メーカーの推奨にしたがって2μgのRNAとスーパースクリプトIIを使用してください。
4. 、確認のためにcDNAを用いて定量PCRを実行するmはノックダウン。我々は、10μL総反応容量で正規化の制御、およびSYBR FAST定量PCRキットとしてGAPDHを使用してください。

8。分析：ゲノムシークエンシング（5週間）

1. アリコート5 × 10 ⁶各ウェルから細胞を、室温で4分間400 × gでスピンダウン。
2. これらの細胞からゲノムDNAを分離する。我々は、製造業者の推奨に従ってウィザードSVゲノムDNA精製キットを使用。
3. PCRは、Ig V遺伝子^19（表1）とKAPAハイファイのDNAポリメラーゼを使用して興味のある他の遺伝子のゲノムDNAを増幅する。我々は、その低いエラーレートがこのポリメラーゼを使用していますが、任意の高忠実度PCRポリメラーゼは許容範囲でなければなりません。
4. ゲルQIAクイックゲル抽出キットを用いて1％アガロースゲル上でPCR産物を精製する。
5. ほかにはない間、いくつかのポリメラーゼは、PCR産物の3'末端に単一のデオキシアデノシン（A）残基を追加。これらの3'尾はTOPO TAのために必要です。クローニングステップ。 KAPAハイファイポリメラーゼは3'尾を残していません。尾30分間72℃で3μL10倍のTaq反応バッファー、1μLの10 mMのdNTP、および1ユニットのTaqポリメラーゼを25μLゲル精製PCR産物をインキュベートすることによりPCR産物。
6. TOPO TAクローニングキットを用いてゲル精製PCR産物をクローニングします。提供E.にTOPO反応から製品を変換する100μg/ mlのアンピシリン、メーカーの推奨する方法に従ってX - galを1.6 mgの補足を含むLB /寒天プレート上で大腸菌 DH5α- T1 ^Rコンピテント細胞とプレート。
7. 配列決定のための個々のコロニーを送る。
8. 変異の種類と場所を決定するために配列解析を実行します。

9。代表的な結果：

前に述べたように、我々は両方のGFPと同様に、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現する陽性コントロールウイルスベクターを使用してください。我々は通常、50〜75％GFP ⁺細胞を二日間を参照してください。トランスフェクションの後に。私たちの感染症では、我々は一般的に参照してください50〜70％の細胞がGFP ⁺二日、感染後が、選択の前にです。選択が完了すると、細胞の> 95％がGFP ⁺である。

代表的な実験として、我々は、過剰発現AIDまたはラモス細胞で修復因子をノックダウンの効果を示す。具体的には、BOSC 23細胞へのレトロウイルスパッケージングベクターをpKat2とともにThy1.1にIRESのサイトを経由してリンクされているAIDのためのレトロウイルス過剰発現ベクターをトランスフェクト。ウイルスを含む培地を濾過し、ラモス細胞に感染させた。野生型（WT）とAID過剰発現（AID ^HI）細胞の両方は、それらがFACS（図3で定量RT - PCR（図2）によっておよびIgMの損失のための遺伝子発現について分析した、その時点で3週間のために播種し、成長した単セルであった）。 FACS染色の場合は、セルが1時20希釈したPE標識α-ヒトIgM抗体と同様に1:400希釈したFITC標識α-ラットCD90/mouse両方でインキュベートし、CD90.1（Thy1.1）抗体。別の実験では、どちらかの無関係なshRNAを（コントロール）またはSHMから保護するために期待される高忠実度DNA修復因子に対するshRNAを含むレンチウイルスは、BOSC 23細胞で作られ、その後ラモス細胞のAIDの^ハイテククローン^に感染。再び、遺伝子発現（図4）およびIgMの損失（図5）は3週間後に単一細胞クローンで分析した。修復因子がSHM中に変異に対する保護を提供するために考えられているので、我々は要因がない場合のIgM抗体の損失とSHMの増加を参照してください。我々がSHM -関連変異の生成に関与する因子-ノックダウンしていたならば、代わりにIgMの損失の減少を見ているだろう。

予想通り、私達の定量RT - PCRの結果は、AIDの過剰発現ベクター（図2）による細胞の感染後のAI​​Dの発現の顕著な増加を示す一方、その因子に対する標的shRNAの存在下でDNA修復因子の低下のレベル（図4 ）。個々のCLONためESは異なる場合があります、あなたは、遺伝子発現レベルでいくつかのバリエーションが表示される場合があります。遺伝子発現が異なる場合があるため、それはあなたがさらに分析することを計画し、各クローンの発現を確認する必要があります。同じ遺伝子に対して異なるshRNAのは、同様に遺伝子発現に異なった効果を持っているかもしれないので、大きな影響を持っているかを判断するには、いくつかのshRNAをスクリーニングする必要があります。ノックダウンは、イムノブロッティングによりタンパク質レベルで確認することができる。同様に、個々のクローンはIgMの損失のレベルで大幅に異なる可能性があります。いくつかのクローンはIgMの変異が最も早い細胞分裂のいずれかで発生して"大当たり"の効果を、示すかもしれない-たとえば、セルの一つはIgMになったという理由だけで> 50％のIgM抗体の損失が表示されます^- 2細胞期で。これらのクローンの影響がいくつかの単一細胞クローンのための中央値を計算することによって最小化されます。

図1。トランスの回路図IgM抗体損失の重複感染、感染と分析。詳細は本文を参照してください。

ラモス細胞に図2。AIDの過剰発現。 WTとAID ^ハイラモス細胞は個々のクローンのポイントのAIDの発現が定量RT - PCRで測定したときの単セルをクローン化し、3週間栽培であった。 GAPDHの発現は、正常化のために使用されていました。 WTは1に設定されました。中央値が示されます。 *片側スチューデントt -検定として計算<0.01のp値を、示す。

WT細胞と比較して図3。AIDの^ハイテク細胞^で IgM抗体の損失の増加。表面のIgMは3週間の時点でFACSで測定した、およびIgM損失の割合は、WTとAIDの^ハイセルについて計算した。 WTクローンとAID ^{ハイテクの}クローンの（A）代表FACSプロット。 AID過剰発現Vectorは、IRESのサイトを経由してThy1.1にリンクされているAIDは、そのThy1.1発現は、AIDの発現の代用として使用されている。いくつかのWTとAID ^{ハイテククローン}のIgM損失の（B）定量。中央値が示されます。 *片側スチューデントt -検定として計算<0.01のp値を、示す。

図4。AIDの^{ハイテク細胞}の修復因子のノックダウン。細胞は無関係shRNAを制御（コントロール）または私達の関心のshRNAを（shRNA）を、単一の細胞播種のいずれかに感染させた。 3週間後に、個々のクローンの遺伝子発現を定量RT - PCRによって測定した。 GAPDHの発現は、正常化のために使用されていました。 WTは1に設定されました。中央値が示されます。 *片側スチューデントt -検定として計算<0.01のp値を、示す。

図5。増加したIgM損失修復因子のノックダウンレベルのAIDの^{ハイテク細胞}インチいくつかのクローンで表面IgMは3週間の時点でFACSで測定した、およびIgM損失の割合は、依然として過剰発現AID細胞で算出した。中央値が示されます。 *片側スチューデントt -検定として計算<0.01のp値を、示す。

。Ig遺伝子¹⁹の表1プライマーの配列：定常領域のCμ、重鎖V領域（V _H）、および軽鎖V領域（V _L）。

前述したように、抗体の多様化のための細胞株のモデルは、抗体の多様化中に別のステップに影響を与える新規タンパク質を同定するために人気の出発点となっている。我々はここにラモスB細胞株におけるノックダウンまたは過剰発現するタンパク質のいずれかにウイルス感染を使用するための方法を提示し、SHMの影響を調べる。

これらの研究では、WTラモスとAID ^ハイラモス細胞の両方を利用する。 AIDの^ハイテク細胞^は AIDの発現に影響を与える要因を除外しながらWT細胞は、標的またはAIDの発現だけでなく、AIDによって生成された病変の修復に関与する因子を研究するために使用することができます。

それはSHMが最初にIgM抗体⁺である細胞の集団からのIgMの損失を測定することによりこちらで計測され、ていることにも留意すべきである。また、それはIgMで起動することが可能です^{- 。}細胞をして復帰アッセイ²³中のIgM ⁺細胞のゲインを探す

異なる選択マーカー（例えばピューロマイシン、ハイグロマイシン、GFP、またはThy1.1）使用することによって、我々はまた、同じプロトコルを使用して同時に複数の感染を行うことができます。しかし、我々は、2つの異なる抗生物質選択マーカー、細胞の変化の感度を使用するときにそれを発見した。それは、一度に2種類の抗生物質を選択するための条件を最適化するためにカーブを殺す追加の実行に必要となります。我々は簡単に2つの異なった要因または1つの要因に加えて別の過剰発現、等のノックダウンのダブルノックダウンを生成することができます

我々はまた、同様に他のB細胞ラインのモデルは、このプロトコルを適応している。例えば、CH12F3 - 2細胞（CSRを研究するために使用されるマウスB細胞株^）26,27と、同じ感染症の手順は、感染の一日（の変化に播種した1 × 10 ⁶ CH12F3 - 2細胞に感染するために使用することができますステップ4.1）。これらの細胞は、ピューロマイシンの1μg/ mLのが選択されています。同様に、同じプロトコルでもできますAID主導遺伝子変換のための細胞株モデル - ニワトリDT40細胞に使用すること。

利害の衝突は宣言されません。

pMSCV - AID - I - Thy1.1とpKat2ベクトルはDGシャッツから親切な贈り物だったとpVSV - G、pRSV - REV、およびpMDLg / pRREベクトルはBRカレンから親切な贈り物でした。