评估拉莫斯B细胞的特定基因的过表达或击倒后的体细胞超突变

我们描述了如何执行逆转录病毒或慢病毒感染的过度表达或shRNA包含人类拉莫斯的B -细胞系构造和如何衡量在这些细胞中的体细胞超突变。

由V（D）J重组产生的低亲和力抗体的B细胞开始他们的生活。然而，检测的病原体后，变量（五）地区的免疫球蛋白（Ig）基因突变约100,000倍以上的基因组的其余通过体细胞超突变（SHM），高亲和力的^抗体 1,2 。此外，类开关重组（CSR）产生一种免疫反应，是需要一个特定的病原体不同的效应功能的抗体。 CSR和SHM发起激活诱导的胞苷脱氨酶（AID），deaminates在DNA胞嘧啶残基产生uracils。这些uracils都容易出错的修复途径形式处理，最终导致突变和重组^1-3。

我们目前所了解的SHM和CSR的分子细节来自相结合的研究在小鼠原代细胞，细胞系，细胞- F稀土元素的实验。小鼠模型仍显示许多修复因子（如雄，MSH2，MSH6，Exo1，和聚合酶^η）4-10的关键作用的基因敲除的黄金标准。然而，并非所有的基因都为淘汰赛研究适合。例如，几双链断裂修复蛋白敲除embryonically致命或损害B细胞发展^11-14。此外，有时在SHM或企业社会责任的一种蛋白的具体功能可能掩盖淘汰赛造成全球的缺陷。此外，由于在小鼠实验中，可以长篇大论，改变细胞系中的单个基因的表达已经成为一种越来越受欢迎的第一步，鉴定^和表征候选基因15-18。

拉莫斯- Burkitt淋巴瘤细胞系组成进行SHM -曾流行一种细胞系模型来研究SHM ^18-24。拉莫斯细胞的一个优势是，他们有一个内置的方便半定量测量的SHM。野生型细胞表达IgM和，因为他们拿起突变，一些淘汰IgM的表达的突变。因此，化验IgM的荧光激活细胞扫描仪（FACS）损失提供了SHM水平的快速读出。 SHM的定量测量，可通过直接的抗体基因测序。

由于拉莫斯细胞难以转染，我们生产的稳定增加或降低一个人的基因的表达与逆转录酶病毒或慢病毒的结构，包含一个过度表达纸盒或一个短发夹RNA（shRNA），分别感染细胞的衍生产品。在这里，我们描述了我们如何感染拉莫斯细胞，然后利用这些细胞来调查SHM特定基因的作用（图1）。

1。准备样品和细胞

1. 执行一个中等规模制备的DNA（midiprep）的过度表达或shRNA包含结构和逆转录病毒包装载体pKat2或慢病毒包装载体pVSV - G，pMDLg / pRRE和PRSV - ^冯 25 。使用每个构造中的DNA和6微克4微克pKat2（逆转录病毒感染）或每个pVSV - G，pMDLg / pRRE 1.5微克DNA，PRSV - REV包装载体（慢病毒感染）。
2. 准备BOSC 23家媒体。转染，使用两个未经修正的贝科的改良Eagle培养基（DMEM），以及完全DMEM。为了使完全DMEM，添加1％HEPES缓冲液，1％青霉素，链霉素，谷氨酰胺（PGS），和10％新生牛血清（NCS）一瓶的DMEM。
3. 准备拉莫斯媒体。对于感染的步骤，完成一瓶的RPMI加入的1％HEPES，1％的PGS，10％胎牛血清（FBS），RPMI - 1640培养基（RPMI）。对于单细胞播种步骤，MAKE"空调"的媒体拉莫斯细胞生长在完全RPMI 2天，纺纱400 X克细胞4分钟，过滤取上清液用0.2微米的过滤器进入无菌瓶。其他完整的媒体一样，条件培养基保存于4 ° C直到需要。
4. 拆分3 × 10 ⁶ BOSC 23到100毫米的钢板在10毫升完全DMEM细胞，细胞转染前一天，将在50-60％汇合，转天。使每个向量计划转染细胞板。重要的是时间过长，这些细胞没有被保存在文化;使用低通过数量最近解冻的细胞或细胞转染和感染的措施，以确保良好的感染。
5. 包括控制你的实验。对于转染和感染，创建一个阴性对照（未转染或未受感染的细胞）和阳性对照（病毒表达GFP和嘌呤霉素抗性基因）。 shRNA的敲下来experiments，感染与杂乱或无关的shRNA控制良好。

2。 BOSC转染细胞23

1. 未经修正的DMEM和完全DMEM瓶温在37 ° C。
2. BOSC 23细胞中删除的媒体，并与5毫升完全DMEM取代。 37 ° C培养箱，直到返回的细胞在步骤2.6中使用。
3. 暖FuGENE 6瓶在室温下5分钟，然后简要涡（<1秒）。
4. 1.5 ml离心管分装成600μL，未经修订的DMEM。
5. 未经修订的DMEM 600μL，涡旋简要（<1秒）稀释成30μL，FuGENE 6，然后在室温下孵育五分钟。小心吸管直接进入媒体。不要让FuGENE 6触摸管双方。
6. 6微克构造，无论是4微克pKat2（逆转录病毒感染）或1.5微克每pVSV - G pMDLg / pRRE，PRSV - REV（慢病毒感染）的DMEM / FuGENE 6混合，涡旋BRI EFLY（<1秒），然后在室温下孵育25分钟。
7. 添加BOSC 23细胞的DNA / DMEM / FuGENE 6混合和回报为24小时37 ° C培养箱。
8. 24小时后，加入5毫升完全DMEM转染细胞和回报为24小时，37 ° C培养箱。

3。收获的病毒颗粒

1. 收获转BOSC 23细胞用10 mL注射器媒体10毫升。
2. 附加0.45μm的过滤器，注射器和过滤到一个干净的15 mL聚丙烯管的媒体。
3. 立即使用病毒的媒体为1毫升分装在2 mL低温瓶或冻结在-80 ° C。
4. 收获后的病毒媒体，确认，高效的转染阳性对照细胞发生流式细胞仪。这也可以为所有样品，如果结构包含一个荧光（如GFP）或细胞表面标志物（如Thy1）。

1. 种子2毫升2 × 10 ⁵细胞/毫升完全RPMI拉莫斯细胞到感染前24小时，6孔板。再次，一定要使用低传代次数最近解冻的细胞或细胞，以确保良好的感染。
2. 如果使用冷冻的病毒等份，病毒的媒体迅速解冻在37 ° C。
3. 混合3μL聚凝胺10毫克/毫升1毫升病毒媒体。对聚凝胺终浓度应总量的3毫升10微克/毫升。
4. 细胞和病毒/聚凝胺混合拌匀吹打。如前所述较早，以及应被用来作为一个未受感染的控制;加入1 mL完全RPMI和3μL，聚凝胺这口井，而不是1毫升病毒。请务必感染匹配的阴性对照。我们也传染以及含有GFP的载体，流式细胞仪，以确定感染效率。
5. 在室温为90分钟，离心3000 X克在6孔板。
6. 返回板块37℃培养箱中培养48小时。
7. 48小时后，400 X克降速感染的细胞在室温下4分钟在15毫升的聚丙烯管。吸取出媒体，确保不扰乱细胞沉淀。在新鲜的RPMI重悬细胞。
8. 确认感染流式细胞仪阳性对照样品的效率。像以前一样，可以为您的样品，如果结构包含一个荧光（如GFP）或细胞表面标志物（如Thy1）。
9. 开始选择的单元格区域（如适用）。我们的shRNA包含结构中都含有嘌呤霉素抗性卡带。我们选择shRNA的感染拉莫斯细胞，用0.25μg/ mL的嘌呤。我们发现，拉莫斯细胞的衍生工具，有时显示改变到嘌呤霉素的敏感性，因此，我们执行杀以优化每个衍生嘌呤浓度的曲线。也可治疗嘌呤霉素未受感染的控制细胞，以确认选择是有效的的。

单播可以在以下两种方式之一进行:排序或手动流式细胞仪。

1. 流式细胞仪:一个流式细胞仪分选机板适配器使用种子1细胞/孔在96孔板100μL40％RPMI/40％，空调media/20％FBS预填充。此方法提供了很多更多的单细胞克隆，每盘。
2. 手动的细胞计数。 RPMI/40％空调media/20％FBS的40％稀释到10个细胞/毫升的细胞等分。使用10毫升稀释的细胞为每个种子板块。不同的克隆将显示在这个阶段变量恢复，因此它是有用的设立在不同浓度（从3到20个细胞/毫升）的几个板块。使用产生较少的副产物，以避免从多个细胞产生的克隆）。使用多道移液器种子96孔板100μL稀释细胞。
3. 放置在37℃培养箱中培养2周的板块。
4. 检查个别井undeR的显微镜确认细胞的存在一天后播种。单细胞可以比较难找到，由于需要集中在正确的深度。聚焦在96孔板的底部印以及数字应该有所帮助。细胞很容易发现，因为多数井有细胞流式细胞仪分选机种子。
5. 2周后，越来越多的殖民地，可以勉强看到肉眼看从下面板块。他们要容易得多，在显微镜下看到。殖民地往往一起成长的好，通常在平板的菌落生长在不同的井边缘的边缘。马克井具有强大的细胞生长和转移的细胞在1 mL的RPMI的24孔板，并返回到37 ° C培养箱。
6. 保持在1 × 10 ⁵至1 × 10 ⁶细胞/ mL的细胞。更改为4分钟，在室温下旋转400 X克的细胞和消除媒体的媒体。更换用1 mL新鲜的RPMI。
7. 经过几个ðays的增长，细胞转移到6孔板，在37℃培养箱继续增长。
8. 3周后，分析IgM的损失（如下所述）的克隆。
9. 继续增长2个星期的细胞，然后分析，在5周时间点的克隆。

6。分析:IgM的损失（3周和5周）

1. 分装5 × 10 ⁵细胞，从每口井到1.5 ml离心管和旋转400 X克细胞在室温为4分钟。使用未染色控制细胞的控制和击倒的shRNA井，以及一个样本。
2. 1毫升的PBS洗涤细胞，然后再旋转400 X克在室温为4分钟。
3. 在50μL的PBS（未染色控制）或PBS悬浮+ 1:20稀释的α-人IgM抗体PE标记。在冰上孵育1小时。
4. 在室温下4分钟旋转400 X克细胞。
5. 洗的C英语学习者的两倍，1毫升的PBS和自旋为4分钟，每一次都在室温下为400 X克。
6. 删除上清100μL的PBS和悬浮。悬浮染细胞转移一个流式细胞仪管。
7. 分析细胞，使用流式细胞仪机。
8. IgM的百分比^-从与shRNA的拆装下来的细胞的控制细胞进行比较。如前所述，流式细胞仪测定IgM的损失是一个可靠的半定量拉莫斯细胞SHM措施。

7。分析:确认击倒定量RT - PCR（5周）

1. 分装3 × 10 ⁶细胞，从每口井和旋转400 X克在室温为4分钟。
2. 准备等分细胞的RNA。我们使用TRIZOL根据制造商的建议。
3. 准备从基因的RNA的准备。我们使用的是2微克的RNA和上标II根据制造商的建议。
4. 执行定量PCR使用基因confir米敲下来。我们作为一个正常化的控制，并在10μL的反应总体积为SYBR FAST的qPCR试剂盒GAPDH的。

8。分析:基因组测序（5周）

1. 分装5 × 10 ⁶细胞，从每口井和旋转400 X克在室温为4分钟。
2. 隔离这些细胞的基因组DNA。我们使用向导SV基因组DNA纯化试剂盒，根据制造商的建议。
3. PCR扩增的Ig V基因^19（见表1），使用KAPA高保真DNA聚合酶的利益的任何其他基因的基因组DNA。我们利用聚合酶，因为其低误码率，但任何高保真PCR聚合酶应该是可以接受的的。
4. 凝胶纯化PCR产物在1％琼脂糖凝胶使用QIAquick凝胶回收试剂盒。
5. 有些聚合酶添加一个单一的脱氧（一）残留物的PCR产物的3'末端，而有的则没有。这3个"A尾巴是必要的TOPO TA克隆的一步。 KAPA高保真聚合酶不留3'一个尾巴。一尾孵化与25μL凝胶纯化PCR产物3μL，10倍的Taq反应缓冲液，1μL10 mM的dNTPs，并在72℃30分钟1单位Taq聚合酶的PCR产物。
6. 克隆凝胶纯化的PCR产物使用TOPO TA克隆试剂盒。 TOPO的反应转化到大肠杆菌的产品大肠杆菌 DH5α- T1 ^ř能干细胞和含有100μg/ mL氨苄青霉素，并根据制造商的建议，补充1.6毫克X - gal的LB /琼脂板的板。
7. 发送单个菌落进行测序。
8. 执行序列分析，以确定突变的类型和位置。

9。代表性的成果:

如前所述，我们使用阳性对照病毒载体表达GFP，以及嘌呤霉素抗性基因。我们通常看到的50-75％GFP ⁺细胞，两天转染后。在我们的感染，我们通常看到的50-70％的^细胞 +两天后感染，但前选择绿色荧光蛋白。选择完成后，> 95％的细胞GFP ^+。

为代表的实验中，我们展示过表达的援助或撞倒拉莫斯细胞修复因子的影响。具体来说，我们转了援助逆转录病毒的过度表达载体，通过IRES的网站一起，与逆转录病毒包装载体pKat2 Thy1.1 BOSC 23细胞相连。含有病毒的媒体过滤，然后用来感染拉莫斯细胞。野生型（WT）和援助过表达细胞（援助^您好 ）单细胞播种和生长3个星期，在这一点，他们的基因表达分析QRT - PCR（图2）和流式细胞仪IgM的损失（图3 ）。流式细胞仪染色，细胞培养与两个1:20稀释PE标记的α-人IgM抗体以及1:400稀释FITC标记的α-大鼠CD90/mouseCD90.1（Thy1.1）抗体。在另一项实验中中，包含无关的shRNA（对照组）或对高保真的DNA修复，预计防止SHM因素的shRNA慢病毒BOSC 23细胞，然后感染到拉莫斯细胞^克隆援助您好。同样，基因表达（图4）和IgM的损失（图5）进行了分析，单细胞克隆后3个星期。由于修复因子被认为是提供对保护在SHM的突变，我们看到在IgM的损失和SHM因素的情况下增加。如果我们下来撞倒在参与生成SHM - 相关突变的一个因素，我们将看到在IgM的损失减少。

正如预期的那样，我们的QRT - PCR结果显示，援助表达援助的过度表达载体（图2）感染细胞后显着增加，而针对性的shRNA对这一因素的存在DNA修复因子下降的水平（图4 ）。因为个人酷龙ES可能会有所不同，你可能会看到一些在基因表达水平的变化。因为基因的表达可以变化，有必要确认您计划进一步分析每个克隆表达。对同一基因的不同的shRNA可能有不同的基因表达的影响一样，所以你应该屏幕几个的shRNA，以确定其中影响最大的。也可能被击倒在蛋白质水平证实，免疫印迹。同样，单个克隆IgM的损失程度可能差别很大。一些克隆可能会表现出"中奖"的效果，IgM的突变发生的最早的细胞分裂之一-例如，你会看到> 50％的IgM损失，仅仅是因为细胞成为^IgM抗体-在两细胞阶段。这些克隆的影响最小化的几个单细胞克隆的中位数计算。

跨示意图如图1。染，感染和分析IgM的损失。有关详细信息，请参阅文本。

图2。拉莫斯细胞的援助表达。 WT和援助^您好拉莫斯细胞单细胞克隆和生长3个星期，在这点在单个克隆援助表达QRT - PCR测定。 GAPDH的表达被用于正常化。 WT设置为1。中值表示。 *表示p值<0.01，计算为一尾学生t检验。

图3。增加援助^您好细胞IgM的损失相比，野生型细胞。在3个星期的时间点的流式细胞仪，表面IgM测定WT ^和援助您好细胞IgM的损失的百分比计算。 （一）代表流式细胞仪积了WT克隆和援助^您好克隆。的援助过表达Vector已通过IRES的站点链接到Thy1.1的援助，所以Thy1.1表达是用来作为援助表达的替代品。 （二）定量几个WT和援助^您好克隆IgM的损失。中值表示。 *表示p值<0.01，计算为一尾学生t检验。

图4。击倒在援助^您好细胞修复因子。一个不相干的shRNA控制（控制）或我们的利益的shRNA（shRNA）的，和单细胞种子细胞感染。 3周后，在个别克隆基因表达的QRT - PCR测定。 GAPDH的表达被用于正常化。 WT设置为1。中值表示。 *表示p值<0.01，计算为一尾学生t检验。

图5增加IgM的损失。拆装修复因子水平的^援助您好细胞。流式细胞仪在3个星期的时间点，在几个克隆的表面IgM的测定和IgM的损失的百分比计算细胞仍然过度表达的援助。中值表示。 *表示p值<0.01，计算为一尾学生t检验。

表^1:19的Ig基因引物序列:恒定区Cμ，重链可变区_（V H），和轻链可变区_（V L） 。

如前所述，多元化的抗体细胞株模型已经成为一种流行的出发点，以确定新的蛋白质，抗体多样化的影响在不同的步骤。我们在座的使用在拉莫斯B细胞病毒感染是击倒或过度表达的蛋白质的方法，然后检查SHM影响。

对于这些研究中，我们利用WT拉莫斯和援助^您好拉莫斯细胞。野生型细胞可用于研究目标或表达的援助以及援助产生病变的修复，涉及的因素^，而援助您好细胞排除因素影响援助表达。

还应当指出，SHM是从最初免疫球蛋白M ⁺的细胞，人口损失的IgM测定化验。另外，也可能开始与IgM抗体^-细胞和增益的IgM ⁺细胞在回归实验²³

通过使用不同的选择标记（绿色荧光蛋白，如嘌呤霉素，潮霉素，或Thy1.1），我们也可以同时执行多重感染与相同的协议。然而，我们发现，当使用两种不同的抗生素选择标记，细胞变化的敏感性。这将需要执行额外的杀曲线优化的条件，选择两种抗生素一次。我们可以很容易产生两种不同的因素或击倒的一个因素，加上另外一个的过度表达，等双敲

我们也适应这个协议，以及其他B细胞系车型。例如，与CH12F3 - 2细胞（B细胞鼠标线用来研究企业社会责任^）26,27，同样的感染步骤可以用来感染1 × 10 ⁶ CH12F3 - 2细胞接种感染的一天（变化步骤4.1）。这些细胞被选中1微克/毫升的嘌呤。同样，相同的协议，也可以用于鸡DT40细胞 - 为援助启动基因转换的细胞株模型。

没有利益冲突的声明。

pMSCV - AID - I - Thy1.1和pKat2载体，从DG Schatz和pVSV -摹，PRSV修订版的礼物，并pMDLg / pRRE载体是一种从BR脐周礼物。