の蛍光タンパク質の偏転アフリカツメガエルWntシグナルへの対応に>外胚葉

アフリカツメガエル胚の外胚葉は、細胞極性の研究のための魅力的なモデルとなっている。アッセイは、蛍光タンパク質の細胞内分布は、外胚葉の細胞で評価されている、説明しています。このプロトコルは、シグナリングの空間的な制御に関連したアドレスの質問に役立ちます。

細胞極性は、動的に胚発生^1、2の間の内部外部の両方の要因によって調節されている真核細胞の基本的なプロパティです。この調節に関与するシグナル伝達経路の一つは、胚発生やヒト疾患^3、4、5の重要な中に何度も使用されているWnt経路、である。この経路の複数の分子成分が協調的空間的に制限された方法で、シグナル伝達調節し、しかし根本的なメカニズムは完全には解明されていません。 ツメガエル胚上皮細胞は、様々なシグナル伝達タンパク質の細胞内局在を研究する優れたシステムです。蛍光融合タンパク質がRNAのマイクロインジェクションによるアフリカツメガエルの胚で発現され、外胚葉外植片を調製し、タンパク質の局在は、落射蛍光で評価されます。この実験的なプロトコルでは、Diversin、シグナリングと細胞極性の決定^6、7に関与している細胞質タンパク質の細胞内局在がWntシグナル伝達^8を研究するためにアフリカツメガエルの外胚葉細胞の視覚化方法について説明します。 Wntリガンドまたはフリッツルド受容体の共発現は、赤色蛍光タンパク質、RFPとの融合Diversinの分布を変化させる、と偏ファッション^8,9の細胞膜に募集しています。この生体外でのプロトコルは、シグナリングの空間的な制御が無傷組織のものと異なっているとはるかに難しい分析することになっている哺乳動物培養細胞、のin vitro試験に役立つだけでなくでなければなりません。

（1） アフリカツメガエルの卵の体外受精

1. 実験の前にヒト絨毛性ゴナドトロピン（400単位/カエル）12時間で注射した女性のカエルの卵を入手。
2. 場所の卵卵〜1 ×マークの変更リンゲル液を少量（0.5-1 ml）を^（MMR）10へと解剖精巣の小片で、in vitroで 、それらを受精さ。 2〜3分後、卵の表面全体をカバーするために、0.1 × MMRを追加。 HCL（水酸化ナトリウムでpHを8に調整） - 20分で、卵ゼリーコートは3％システインによって除去される。卵は0.1 × MMRで3回洗浄し、注射用コールドインキュベーター（13℃）に残されます。
3. 受精卵2〜4細胞期に開発するために許可されています。注射のために、胚は3％フィコール、0.5 × MMRを含む溶液に転送されます。

2。 RNAのマイクロインジェクション

1. RNAはmMessage mMachineキット（Ambion社）を用いて線状化DNAテンプレートから合成し、0.1〜1μg/μLののストック濃度でRNaseフリー水で希釈されています。注射のためのRNAの最適な用量は、予備実験で決定されます。 Diversin - RFP、膜マーカーGFP - CAAXとフリッツルド8のRNAを注入あたり0.1〜1 ngのに使用されています。
2. 注射針は、針のグラインダーとキャピラリーしてから針の引き手で用意されています。注射の前に、各針は注射当たりの液体の10 NLを取り出すには水で較正されています。
3. 注射のために、胚は3％フィコール、0.5 × MMRの大きな液滴にプラスチック製の皿に置かれます。 RNA溶液のいずれかのマイクロリットルはナリシゲマイクロインジェクターと注射針に吸い込まれる。 RNAの10 ​​NLは、8細胞期胚2〜3倍の動物割球に注入される。注入された胚は、12ウェルプレートのウェルに転送されます。

3。外胚葉外植片の準備

1. 注入された胚は、初期原腸胚の段階に到達すると、それらを1％アガロースでコーティングした3センチメートルプラスチックシャーレに0.6 × MMR溶液中に転送されます。卵黄膜は、ピンセットを使って手動で削除されます。外胚葉外植片は、タングステン針とhairloopを使用して胚から摘出されています。
2. 外胚葉外植片は、ガラスバイアルに移し、リン酸塩の3.7％ホルムアルデヒドで固定している30分間（PBS）緩衝生理食塩水。固定片はPBSで3回（10分ごと）で洗浄されています。 DAPIは核を染色するために、サードウォッシュに含まれています。
3. 外植片をスライドガラス上にマウントされています。スコッチテープの2つのストリップはスライドに添付されており、外植片は、2つのストリップの間に配置されています。外植片の外面は、着色なので、外植片の内側には、顕微鏡対物レンズを向くようにします。マウントソリューション（70％25 mg / mlのDABCO、抗退色試薬を含むPBSでグリセロール^）11の二から三20μlの滴を加えます。上にカバースリップを置く。

4。蛍光顕微鏡下で植のイメージング

1. サンプルは、適切なフィルターを使用したツァイスAxioplan蛍光顕微鏡で観察されています。
2. 画像は、いくつかの独立した外植片からの特定の面を視覚化するために線分の添付ファイルで撮影されています。

5。 Cryosectioning

Cryosectioningは、細胞と免疫染色のためのより多くの適用の蛍光タンパク質の分布を可視化するための代替方法です。段階10で、胚は、デントの固定液（20％DMSO、80％メタノール）で1〜2時間は固定されているPBSで洗浄し、そして15％の魚gelatin/15％ショ糖溶液¹¹に埋め込 ​​まれた。埋め込まれた胚は、すぐにドライアイスで凍結されており、凍結切片は、ライカクリオスタット上で生成されます。クロスセクションでは、注入されたRNAおよびその翻訳された蛋白質の製品を継承する外胚葉の細胞が含まれます。のセクションでは、蛍光を保持し、特異的な抗体で免疫染色し、蛍光で標識二次抗体で標識することができます。核はDAPIで染色されています。マウントメディアは、上記と同様である。上記のようなイメージングを行うことができます。

6。代表的な結果：

図1。フリッツルド受容体は細胞膜にDiversinを募集しています。フリッツルド8（Xfz8）と本部- RFPのRNAを発現している外胚葉細胞の代わりに、細胞膜での事業部- RFPを明らかに中心体（のようなG -チューブリンの共染色によって明らかにされた）。実験のスキームは、上に反映するものではありません。典型的な断面が示されています。

我々はDiversinの細胞内局在性を特徴づけるために、上記のプロトコルを使用している。動物極の外植片、Diversin - RFPで、核に隣接し、凍結切片（図1）におけるG -チューブリン、中心体マーカーとの共局在が検出されました。タンパク質の細胞内局在が識別されると、削除の構造は、蛋白質のドメインが必要と細胞内局在のために十分であるか確立するために生成することができます。このアプローチを使用して、Diversinの中心体局在性ドメインは、真ん中にマッピングされており、タンパク質のカルボキシ末端ドメインでは、コイルドコイルモチーフ^8を含む両方。

同プロトコルは、タンパク質の局在がシグナルに応答して変更されている、研究に使用することができます。我々はそのWntシグナルの分泌タンパク質は細胞膜のパッチ（図1）にFZ8新兵部- RFPのに対し、細胞膜に隣接する点状の構造に本部- RFPを再配置するように働く発見。我々は、さらにカルボキシ末端ドメインが細胞膜採用自体に必須でないことがわかりましたが、偏光膜の採用が必要。

要約すると、上記の実験プロトコルは、タンパク質 - タンパク質相互作用や、特定の成長因子やシグナル伝達タンパク質と細胞の刺激後の異なる細胞区画へのタンパク質局在の多様な研究に役立つだろう。

ソコル実験室での研究は米国立衛生Instituesが主催しています。