Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus in risposta alla segnalazione Wnt

Xenopus ectoderma embrionale è diventato un modello attraente per gli studi di polarità cellulare. Un saggio è descritta, in cui la distribuzione subcellulare delle proteine ​​fluorescenti è valutata in cellule ectoderma. Questo protocollo aiuterà a trattare questioni relative al controllo spaziale della segnalazione.

Polarità delle cellule è una proprietà fondamentale delle cellule eucariotiche che viene dinamicamente regolato da fattori intrinseci ed estrinseci, sia durante lo sviluppo embrionale ^{1, 2.} Una delle vie di segnalazione coinvolte nel presente regolamento è la via Wnt, che viene utilizzato più volte durante l'embriogenesi e critica per la malattia umana ^{3, 4, 5.} Molteplici componenti molecolari di questa via di segnalazione coordinatamente regolano in maniera spazialmente limitato, ma i meccanismi alla base non sono pienamente compresi. Xenopus cellule embrionali epiteliali è un ottimo sistema per studiare la localizzazione subcellulare delle diverse proteine ​​di segnalazione. Proteine ​​di fusione fluorescenti sono espressi in embrioni di Xenopus da microiniezione di RNA, gli espianti ectodermiche sono preparati e la localizzazione delle proteine ​​viene valutato epifluorescenza. In questo protocollo sperimentale descriviamo come localizzazione subcellulare di Diversin, una proteina citoplasmatica che è stato implicato nella segnalazione e polarità determinazione delle cellule ^{6, 7} viene visualizzato in Xenopus cellule ectodermiche per lo studio di trasduzione del segnale Wnt ^8. Coespressione di un ligando Wnt o un recettore Frizzled altera la distribuzione di Diversin fuse con il rosso proteina fluorescente, RFP, e reclute alla membrana cellulare in maniera polarizzata ^{8, 9.} Questo protocollo ex vivo dovrebbe essere un'utile aggiunta a studi in vitro su colture di cellule di mammifero, in cui il controllo spaziale del segnale è diversa da quella del tessuto intatto ed è molto più difficile da analizzare.

1. Fecondazione in vitro di uova di Xenopus

1. Ottenere le uova da rane femminile che sono stati iniettati con gonadotropina corionica umana (400 unità / rana) 12 ore prima dell'esperimento.
2. Mettere le uova in una piccola quantità (0.5-1 ml) di soluzione 1 x Marc Ringer modificati (MMR) ¹⁰ per le uova e fecondare in vitro con un piccolo pezzo di testicolo sezionato. Dopo 2-3 minuti, aggiungere 0,1 x MMR per coprire tutta la superficie delle uova. In 20 minuti, uova cappotto gelatina viene rimosso da 3% cisteina - HCL (portata a pH 8 con idrossido di sodio). Le uova vengono lavate con 0,1 x MMR tre volte e lasciato in un freddo incubatore (13 ° C) per preparazioni iniettabili.
3. Uova fecondate sono permesso di sviluppare a 2-4 stadio cellulare. Per preparazioni iniettabili, gli embrioni vengono trasferiti nella soluzione contenente il 3% Ficoll, 0,5 x MMR.

2. RNA Microiniezione

1. RNA vengono sintetizzate dai modelli di DNA linearizzato utilizzando mMessage mMachine kit (Ambion) e diluita con acqua RNase-free alla concentrazione stock di 0,1-1 mg / mL. Dosi ottimali di RNA per preparazioni iniettabili sono determinati in esperimenti pilota. RNA per Diversin-RFP, il marcatore membrana GFP-CAAX Frizzled e 8 sono utilizzati al 0,1-1 ng per iniezione.
2. Gli aghi da iniezione sono preparati con un estrattore ago da una capillare e poi con una smerigliatrice ago. Prima dell'iniezione, ogni ago è calibrato con acqua per espellere 10 nl di iniezione di liquido per.
3. Per preparazioni iniettabili, gli embrioni sono posti su un piatto di plastica in una grande goccia del 3% Ficoll, 0,5 x MMR. Una microlitri di soluzione RNA è risucchiata in un ago da iniezione con Narishige microinjector. 10 nl di RNA viene iniettato in blastomeri animali embrioni di 8 cellule 2-3 volte. Gli embrioni iniettati vengono trasferiti in un pozzo di 12-pozzetti.

3. Preparazione ectodermica Espianti

1. Quando gli embrioni iniettati raggiungere presto stadio di gastrula, vengono trasferiti in una soluzione 0,6 x MMR in un piatto di 3 centimetri di plastica rivestiti con 1% di agarosio. Membrana vitellina viene rimosso manualmente con un paio di pinze. Espianti ectodermica sono asportati dagli embrioni utilizzando un ago di tungsteno e un hairloop.
2. Espianti ectodermica vengono trasferiti in un flacone di vetro e fissato con 3,7% di formaldeide in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 30 minuti. Espianti fissi vengono lavati con PBS per tre volte (10 minuti ciascuno). DAPI è incluso nel terzo lavaggio a macchia nuclei.
3. Espianti sono montati su un vetrino. Due strisce di nastro adesivo sono attaccati alla slitta e la espianti sono posti tra le due strisce. Dal momento che la superficie esterna di espianti è pigmentata, la parte interna del espianti deve essere rivolto l'obiettivo microscopio. Aggiungere 2-3 gocce 20 ml di soluzione di montaggio (70% glicerolo in PBS di cui 25 mg / ml DABCO, anti-sbiadimento reagente) ^11. Mettere un coprioggetti sopra.

4. Imaging di Espianti al microscopio a fluorescenza

1. I campioni sono visti al microscopio Zeiss Axioplan a fluorescenza con filtri appropriati.
2. Le immagini sono scattate con l'attaccamento Apotome di visualizzare uno specifico piano da diversi espianti indipendenti.

5. Criosezionamento

Criosezionamento è un modo alternativo per visualizzare la distribuzione delle proteine ​​fluorescenti nella cella e più applicabile per immunocolorazione. Nella fase 10, gli embrioni sono fissati per 1-2 ore con fissativo Dent (20% DMSO, 80% metanolo), lavate con PBS, e incorporate nel 15% soluzione di saccarosio pesce gelatin/15% ^11. Gli embrioni congelati sono rapidamente integrati in ghiaccio secco e criosezioni sono generate su Leica criostato. Sezioni che comprendono le cellule ectodermiche che ereditano RNA iniettato e loro prodotti proteici tradotte. Le sezioni mantenere fluorescenza e può essere immunoistochimica con anticorpi specifici e poi etichettati con anticorpi secondari coniugati con fluorescenza. I nuclei sono colorati con DAPI. I mezzi di montaggio sono gli stessi come descritto sopra. L'imaging può essere eseguita come descritto sopra.

6. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Recettore Frizzled reclute Diversin alla membrana cellulare. Cellule che esprimono Ectoderma 8 Frizzled (Xfz8) e Div-RFP RNA rivelare Div-RFP a livello della membrana cellulare, al posto del centrosoma (come rivelato da g-tubulina co-scarico). Lo schema dell'esperimento è al top, una tipica sezione trasversale è mostrato.

Abbiamo usato il protocollo di cui sopra per caratterizzare la localizzazione subcellulare di Diversin. In espianti polo animale, Diversin-RFP è stata rilevata accanto al nucleo e colocalized con g-tubulina, un marker centrosomica, in criosezioni (Figura 1). Una volta che la localizzazione subcellulare di una proteina è identificato, costruisce la cancellazione può essere generata per stabilire quali domini di proteine ​​sono necessarie e sufficienti per la localizzazione subcellulare. Usando questo approccio, i domini di localizzazione centrosomica Diversin sono stati mappati al centro e nella regione carbossi-terminale domini della proteina, entrambi contenenti il motivo a spirale-coil ^8.

Lo stesso protocollo può essere utilizzato negli studi, nei quali la localizzazione delle proteine ​​è alterata in risposta alla segnalazione. Abbiamo scoperto che le proteine ​​Wnt secrete agire per riposizionare Div-RFP puntata alle strutture adiacenti alla membrana cellulare, mentre FZ8 reclute Div-RFP alle patch membrana cellulare (Figura 1). Abbiamo inoltre scoperto che il dominio carbossi-terminale non è essenziale per la membrana di reclutamento di per sé, ma necessari per l'assunzione a membrana polarizzata.

In sintesi, il protocollo sperimentale sopra vi aiuterà a diversi studi di interazioni proteina-proteina e localizzazione delle proteine ​​ai diversi compartimenti cellulari dopo la stimolazione delle cellule con fattori di crescita specifici o proteine ​​di segnalazione.

La ricerca nel laboratorio Sokol è patrocinata dal Institues Nazionale di Salute.