الاستقطاب إزفاء من البروتينات في نيون القيطم الأدمة في الاستجابة لاشارة Wnt

أصبح القيطم الجنينية الأديم الظاهر نموذجا جذابا للدراسات القطبية الخلية. وصفت والفحص ، التي يتم فيها توزيع التحت خلوية المقررة من البروتينات الفلورية في خلايا الأديم الظاهر. وسوف يساعد هذا البروتوكول تعالج المسائل المتعلقة بمكافحة المكاني للإشارات.

قطبية الخلية هي الخاصية الأساسية للخلايا حقيقية النواة التي يتم تنظيمها بشكل حيوي على حد سواء بفعل عوامل ذاتية وخارجي أثناء التطور الجنيني ^{1 و 2.} واحد من مسارات إشارات تشارك في هذا النظام هو الطريق Wnt ، والذي يستخدم عدة مرات خلال مرحلة التطور الجنيني والحرجة لأمراض الإنسان ^{3 ، 4 ، 5.} المكونات الجزيئية متعددة من هذا الممر تنظيم coordinately يشير بطريقة مكانيا المقيدة ، ولكن لا يفهم الآليات الكامنة بشكل كامل. القيطم طلائي الخلايا الجنينية هو نظام ممتاز لدراسة توطين التحت خلوية من مختلف البروتينات الإشارة. يتم التعبير عن البروتينات الفلورية الانصهار في الأجنة القيطم microinjection بواسطة الحمض النووي الريبي ، مستعدون explants الأدمة ويتم تقييم الترجمة البروتين epifluorescence. في هذا البروتوكول التجريبي نحن تصف كيفية الترجمة من Diversin التحت خلوية ، وهو بروتين حشوية التي تورطت في الإشارات وتحديد الخلية القطبية ^{6 ، 7} هو تصور في خلايا الأدمة القيطم لدراسة Wnt نقل الإشارة ^8. Coexpression ليجند Wnt أو مستقبلات Frizzled يغير توزيع Diversin تنصهر مع بروتين فلوري الأحمر ، RFP ، والمجندين لغشاء الخلية بطريقة الاستقطاب ^{8 و 9.} ينبغي لهذا البروتوكول فيفو السابقين تكون إضافة مفيدة للدراسات في المختبر من خلايا الثدييات مثقف ، والتي تتحكم المكاني للإشارة يختلف من الأنسجة سليمة وأكثر صعوبة في تحليلها.

1. الإخصاب في المختبر من البيض القيطم

1. الحصول على البيض من الضفادع الإناث التي حقنت مع موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (400 وحدة / الضفدع) 12 ساعة قبل التجربة.
2. البيض في المكان على كمية صغيرة (0.5-1 مل) من 1 × مارك محلول رينغر تعديل (MMR) ¹⁰ إلى البيض وتخصيبها في المختبر منهم بقطعة صغيرة من الخصية تشريح. بعد 2-3 دقيقة ، إضافة 0.1 X MMR لتغطية كامل سطح البيض. في 20 دقيقة ، يتم إزالة البيض هلام معطف بواسطة السيستين 3 ٪ -- HCL (معدلة لدرجة الحموضة (8) مع هيدروكسيد الصوديوم). يتم غسل البيض بنسبة 0.1 X ثلاث مرات MMR وغادرت في حاضنة الباردة (13 درجة مئوية) للحقن.
3. ويسمح لوضع البويضات المخصبة إلى مرحلة الخلية 2-4. عن الحقن ، ويتم نقل الأجنة في محلول يحتوي على 3 ٪ Ficoll ، 0.5 X MMR.

2. RNA Microinjection

1. تم تجميعها من الرناوات قوالب باستخدام الحمض النووي خطي mMessage mMachine مجموعة (Ambion) والمخفض مع ريبونوكلياز خالية من المياه على تركيز المخزون من 0،1-1 ميكروغرام / ميكرولتر. ويتم تحديد الجرعات المثلى من RNAs للحقن في التجارب الرائدة. وتستخدم لالرناوات Diversin - RFP ، علامة غشاء GFP - CAAX وFrizzled 8 في 0،1-1 نانوغرام في الحقن.
2. إبر الحقن مستعدون مع مجتذب إبرة من شعري ثم مع طاحونة الإبرة. قبل الحقن ، ويتم معايرة كل إبرة مع الماء لطرد 10 لحقن السائل NL الواحد.
3. عن الحقن ، وتوضع على طبق الأجنة البلاستيكية إلى قطرات كبيرة من Ficoll 3 ٪ ، 0.5 X MMR. يرشح احد ميكروليتر من محلول الحمض النووي الريبي في إبرة الحقن مع microinjector Narishige. يتم حقن 10 NL من الحمض النووي الريبي في الأجنة الحيوانية blastomeres الخلية أغسطس 2-3 مرات. يتم نقل الأجنة في بئر حقن من لوحة ال 12 أيضا.

3. إعداد Explants الأدمة

1. عندما تصل إلى حقن الأجنة المبكرة مرحلة المعيدة ، يتم نقلهم الى حل MMR 0.6 x في طبق من البلاستيك 3 سم مغلفة agarose 1 ٪. تتم إزالة الغشاء المحي يدويا مع زوج من الملقط. يتم رفعه explants الأدمة من أجنة باستخدام إبرة التنغستن وhairloop ملف.
2. يتم نقل explants الأدمة في قارورة زجاجية وثابتة مع الفورمالدهايد 3.7 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 30 دقيقة. تغسل explants ثابت مع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني (10 دقيقة لكل منهما). يتم تضمين دابي في ثالث لغسل وصمة عار النوى.
3. هي التي شنت على الزجاج Explants الشريحة. وترد قطعتين من الشريط سكوتش إلى الشريحة ويتم وضع شرائط explants بين البلدين. منذ السطح الخارجي للexplants غير مصطبغة ، يتعين على الجانب الداخلي من explants مواجهة الهدف المجهر. إضافة 2-3 قطرات 20 ميكرولتر من الحل تركيب (70 ٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني من بينهم 25 ملغ / مل DABCO ومعاداة يتلاشى الكاشف) ^11. وضع ساترة على القمة.

4. تصوير Explants تحت المجهر نيون

1. وينظر العينات تحت المجهر Axioplan زايس الفلورسنت مع الفلاتر المناسبة.
2. يتم التقاط صور مع المرفق Apotome لتصور محدد من طائرة explants مستقلة عديدة.

5. Cryosectioning

Cryosectioning هو وسيلة بديلة لتصور توزيع البروتينات الفلورية في الخلية وأكثر قابلية للتطبيق لimmunostaining. في المرحلة 10 ، والأجنة ثابتة لمدة 1-2 ساعات مع لتثبيتي دنت (20 ٪ DMSO ، و 80 ٪ الميثانول) ، وغسلها مع برنامج تلفزيوني ، وجزءا لا يتجزأ من حل 15 ٪ سكروز gelatin/15 الأسماك ¹¹ ٪. يتم تجميد الأجنة بسرعة مضمن على الثلج الجاف ويتم إنشاؤها على cryosections ناظم البرد لايكا. والمقاطع العرضية وتشمل خلايا الأدمة التي ترث الرناوات حقن البروتين ومنتجاتها ترجمتها. المقاطع الاحتفاظ مضان ويمكن immunostained مع الاجسام المضادة المحددة ، ثم المسمى مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع مضان. هي ملطخة النوى مع دابي. وسائل الإعلام المتصاعدة هي نفسها كما هو موضح أعلاه. لا يمكن أن يؤديها التصوير على النحو المبين أعلاه.

6. ممثل النتائج :

الشكل 1. مستقبلات Frizzled المجندين Diversin إلى غشاء الخلية. خلايا الأدمة معربا عن 8 Frizzled (Xfz8) والرناوات الدرجة الدرجة تكشف - RFP - RFP في غشاء الخلية ، وبدلا من الجسيم المركزي (كما يتضح من ز تويولين تلطيخ المشترك). مخطط التجربة في أعلى ؛ يتم عرض نموذجي عبر الباب.

لقد استخدمنا بروتوكول أعلاه لتميز الترجمة في Diversin التحت خلوية. explants في القطب الحيواني ، تم الكشف عن Diversin - RFP بجوار النواة وcolocalized تويولين مع الجميع ، علامة centrosomal ، cryosections في (الشكل 1). حالما يتم التعرف على توطين التحت خلوية من البروتين ، يمكن إنشاء بنيات الحذف لإنشاء المجالات التي البروتين ضرورية وكافية لتوطين التحت خلوية. باستخدام هذا النهج ، فقد تم تعيين مجالات الترجمة من centrosomal Diversin إلى وسط وفي المجالات كربوكسي محطة من البروتين ، وكلاهما يحتوي على لفائف ملفوف عزر ^8.

ويمكن استخدام البروتوكول نفسه في الدراسات ، التي غيرت التعريب البروتين ردا على الإشارة. وجدنا أن تفرز بروتينات Wnt العمل على نقل فرقة المشاة - RFP للهياكل المنقط المتاخمة لغشاء الخلية ، في حين Fz8 المجندين الدرجة - RFP إلى بقع غشاء الخلية (الشكل 1). اكتشفنا كذلك أن المجال كربوكسي المحطة ليست عنصرا أساسيا للتوظيف الغشاء في حد ذاتها ، ولكن المطلوب للتجنيد الغشاء المستقطب.

باختصار ، فإن بروتوكول أعلاه تجريبية مساعدة في دراسات متنوعة من البروتين البروتين التفاعلات وتوطين البروتين لمقصورات الخلوية المختلفة بعد تنشيط الخلايا مع عوامل نمو معينة أو بروتينات الإشارة.

ويرعى الأبحاث في المختبر من قبل المركز الإنترنت سوكول الوطنية للصحة.