偏光易位荧光蛋白爪蟾外胚层响应Wnt信号

非洲爪蟾胚胎外胚层已经成为一个有吸引力的模型研究细胞极性。描述一个试验，荧光蛋白的亚细胞分布在外胚层细胞进行评估。该协议将有助于地址问题涉及到空间的信号控制。

细胞极性是一个动态调节胚胎发育过程中^1，2两个内在因素和外在因素的真核细胞的根本属性。在本规例所涉及的信号转导通路之一是Wnt信号通路，这是胚胎发育过程中使用了许多人类疾病^的3，4，5倍和关键。此通路的多个分子组成的协调调节信号在空间受限的方式，但基本的机制尚不完全清楚 。爪蟾胚胎上皮细胞是一个很好的系统研究各种信号蛋白的亚细胞定位。荧光融合蛋白是由RNA显微注射爪蟾胚胎中表达，外胚层外植体准备和蛋白定位是由epifluorescence评估。在本实验的协议，我们将描述如何Diversin，胞浆蛋白已在信令和细胞极性^{的决心6，7}牵连的亚细胞定位爪外胚层细胞中的可视化^研究 Wnt信号转导8。一个Wnt配体或Frizzled信号受体的共同表达改变Diversin分布与红色荧光蛋白，RFP的融合，和新兵到细胞膜的^{极化时尚8，} 9。这种体外的协议应该是一个有益的补充，在体外培养的哺乳动物细胞，在空间控制信令不同于完整的组织，更是难以分析研究。

1， 在爪蟾卵体外受精

1. 获得女蛙实验前，注射人绒毛膜促性腺激素（400单位/青蛙）12小时的鸡蛋。
2. 将鸡蛋放置少量（0.5-1毫升），1个马克的修改林格氏溶液^（MMR）10鸡蛋和施肥，在体外用解剖睾丸小块。 2-3分钟后，加入0.1 × MMR覆盖整个表面的鸡蛋。卵子的透明带是在20分钟内，由3％半胱氨酸 - 盐酸（调整pH值用氢氧化钠8）中删除。鸡蛋洗净，用0.1 ×孕产妇死亡率的三倍，并留在寒冷的孵化器（13℃）注射。
3. 受精卵可发展到2-4细胞阶段。注射，胚胎转移到含聚蔗糖3％，孕产妇死亡率0.5 ×溶液。

2。 RNA的显微注射

1. 使用mMessage mMachine试剂盒（Ambion公司）从线性DNA模板合成的RNA股票在0.1-1μg/μL的浓度，并用无RNase水稀释。在试点实验确定最佳剂量注射的RNA。 Diversin RFP，膜标记GFP - CAAX和Frizzled信号8 RNA是用于在每次注射0.1-1纳克。
2. 准备注射针头与针从毛细血管，然后用针磨床拉马。注射前，每一针的校准与水弹出10 NL每次注射的液体。
3. 注射，胚胎被放在一个塑料盘成一个大液滴聚蔗糖3％，孕产妇死亡率0.5 ×。 Narishige微量注射针吸进一个RNA溶液微升。 10 NL的RNA注射到动物的卵裂球的8细胞胚胎的2-3倍。注射的胚胎被转移到12孔板以及。

3。准备外胚层植

1. 当注入胚胎达到早期原肠胚阶段，他们被转移到0.6 ×孕产妇死亡率在3厘米的塑料盘涂用1％琼脂糖溶液。卵黄膜是一双镊子手动删除。外胚层外植体切除胚胎从使用的钨针和一个hairloop。
2. 外胚层外植体转移到一个玻璃小瓶，用3.7％甲醛磷酸盐固定30分钟缓冲液（PBS）。固定植洗净，用PBS洗3次（每次10分钟）。纳入第三洗染色细胞核的DAPI。
3. 植安装一个玻璃片上。透明胶带条连接到幻灯片和外植体之间放置两个条。由于外植体的外表面色素沉着，外植体的内侧应该面对显微镜目标。新增两三个20的安装方案（70％甘油PBS中包括25毫克/毫升的DABCO，抗褪色试剂^）11μL滴。盖玻片放在上面。

4。外植体荧光显微镜下成像

1. 蔡司Axioplan适当的过滤器的荧光显微镜下观察样品。
2. Apotome附件可视具体从几个独立的外植体平面图像。

5。 Cryosectioning

Cryosectioning是一种替代的方法来可视化的荧光蛋白在细胞内的分布和更适用的免疫。 10期，胚胎是固定的登特的固定液（20％DMSO，80％的甲醇）为1-2小时，用PBS冲洗，15％的鱼^gelatin/15 11％的蔗糖溶液中嵌入。干冰嵌入式胚胎快速冷冻和冰冻切片徕卡低温恒温器生成的。截面将包括继承注入的RNA和其翻译的蛋白产物的外胚层细胞。部分保留荧光和免疫染色与特异性抗体，然后与用荧光标记的二抗体标记。细胞核用DAPI染色。安装媒体的上述相同。如上所述，可以进行成像。

6。代表性的成果：

图1。 Frizzled信号受体新兵Diversin细胞膜。外胚层细胞中表达Frizzled信号8（Xfz8）和DIV - RFP的RNA的显示DIV - RFP的细胞膜，而不是的中心体（G -微管蛋白染色显示）。实验计划是在顶部显示一个典型的横截面。

我们已经使用了上述协议，来表征的亚细胞定位Diversin。在动物极植，Diversin RFP的检测细胞核，并与G -微管蛋白，在冰冻切片（图1），一个中心体标记共同定位。一旦确定的一种蛋白质的亚细胞定位，删除构造可以生成，以确定哪些蛋白质域是必要的和足够的亚细胞定位。使用这种方法，已经Diversin中心体本地化域映射到中间的蛋白质的羧基端的域，都含有卷曲螺旋^图案 8 。

可以使用相同的协议在研究，在蛋白定位在信令改变。我们发现，Wnt信号分泌蛋白搬迁DIV - RFP在细胞膜上相邻的点状结构，而FZ8新兵DIV - RFP细胞膜的修补程序（图1）。我们进一步发现，羧基末端结构域是不是膜招聘本身的本质，但招聘偏振膜要求。

综上所述，上述实验的协议将有助于在不同蛋白质相互作用和蛋白质的本地化，以不同的细胞具有特异性生长因子或信号蛋白的细胞刺激后车厢的研究。

索科尔实验室的研究是由卫生部全国Institues赞助。