Gli organismi mostrano un'enorme varietà nelle loro forme. Siamo molto interessati ai meccanismi molecolari e cellulari alla base della formazione, diversificazione ed evoluzione di queste forme. Per capirlo, abbiamo studiato come le cellule abbiano determinato il destino a formare la forma finale della zampa adulta di Drosophila.
Utilizzando l'imaging dal vivo, abbiamo trovato un comportamento inaspettatamente sorprendente delle cellule. Durante la formazione della forma finale della gamba, le cellule epiteliali hanno formato transitoriamente la struttura speciale come abbiamo chiamato la struttura simile al Partenone. Questa struttura sembra essere una caratteristica generale delle cellule epiteliali quando stabiliscono la loro forma finale Per l'imaging dal vivo a lungo termine durante la fase di pupa, è importante rimuovere il pupario mantenendo l'umidità.
Il nostro metodo, che utilizza un piatto con fondo di vetro e una goccia d'acqua, è stabile, affidabile e facile da maneggiare, anche per i principianti. I nostri risultati dimostrano che le cellule subiscono cambiamenti di forma dinamici inaspettati durante il processo finale di formazione della forma. Per comprendere con precisione i meccanismi finali di formazione della forma, è essenziale comprendere a fondo i continui cambiamenti nella forma cellulare e indagare i meccanismi alla base di questi cambiamenti e la loro importanza per la morfogenesi.
Le prossime domande che vogliamo affrontare sono come la struttura simile al Partenone si forma transitoriamente e come contribuisce alla formazione della forma più fine. Per iniziare, raccogli le pupe bianche del ceppo desiderato di Drosophila melanogaster dalle fiale e mettile in piatti o fiale vuote usando un pennello. Incubare le pupe bianche raccolte a 25 gradi Celsius per almeno 14 ore fino a quando non raggiungono lo stadio desiderato per l'osservazione.
Utilizzando un pennello imbevuto di acqua distillata, rimuovere con cura la colla e il cibo per mosche dalla superficie del pupario. Quindi posizionare le pupe pulite su salviette detergenti e lasciarle asciugare per alcuni minuti. Ora attacca un pezzo di nastro biadesivo a un vetrino e posiziona le pupe essiccate sul nastro biadesivo con il lato ventrale rivolto verso il basso.
Usando un pennello asciutto, spingere delicatamente il lato dorsale delle pupe per migliorare l'adesione al nastro biadesivo. Sotto uno stereomicroscopio, usa un paio di pinze per aprire con cautela l'opercolo del pupario. Inserire una punta della pinza nello spazio tra la pupa e il pupario dal bordo dell'opercolo aperto.
Quindi, usando la pinza, afferra il pupario e tiralo verso l'esterno finché non si apre. Solleva i frammenti strappati del pupario e incollali al nastro biadesivo. Per iniziare, prepara la zampa pupale di Drosophila melanogaster per l'imaging.
A seconda dell'obiettivo utilizzato, applicare un microlitro di acqua distillata o olio di silicone sul fondo di un piatto con fondo di vetro. Quindi immergi un pennello in acqua distillata e raccogli delicatamente la pupa. Posizionare la pupa con il lato ventrale rivolto verso il basso sull'acqua distillata o sull'olio di silicone nel piatto.
Utilizzando una micropipetta, aggiungere 10 microlitri di acqua distillata vicino al bordo della porzione di vetro del piatto. Usando una siringa, applica un cerchio di grasso siliconico attorno al bordo della parte in vetro del piatto. Quindi posizionare un vetrino coprinte sul grasso siliconico per sigillare il piatto.
Dopo aver acceso il microscopio confocale e il software, posizionare il piatto inferiore in vetro con la pupa sul tavolino del microscopio e visualizzare l'area di interesse desiderata. Le cellule epiteliali nel tarso formavano proiezioni basali apicobasali e connessioni basali, che ricordano il Partenone tra 16 ore e 27,5 ore dopo la formazione del pupario. La progressiva riduzione dello spessore epiteliale è stata osservata da 41 ore a 60 ore dopo la formazione del pupario, anche dopo che il contorno del tessuto della gamba è diventato più definito.
