Organismen zeigen eine enorme Vielfalt in ihren Formen. Wir interessieren uns sehr für die molekularen und zellularen Mechanismen, die der Bildung, Diversifizierung und Evolution dieser Formen zugrunde liegen. Um dies zu verstehen, haben wir untersucht, wie schicksalsbestimmt die Zellen die endgültige Form des adulten Beins in Drosophila bilden.
Mit Hilfe von Live-Bildgebung haben wir ein unerwartet überraschendes Verhalten von Zellen gefunden. Bei der endgültigen Formbildung des Beins bildeten die Epithelzellen vorübergehend die spezielle Struktur, wie wir sie die Parthenon-ähnliche Struktur nannten. Diese Struktur scheint ein allgemeines Merkmal von Epithelzellen zu sein, wenn sie ihre endgültige Form etablieren. Für die Langzeit-Live-Bildgebung während des Puppenstadiums ist es wichtig, das Puparium unter Beibehaltung der Feuchtigkeit zu entfernen.
Unsere Methode, bei der eine Glasbodenschale und ein Tropfen Wasser verwendet werden, ist stabil, zuverlässig und auch für Anfänger einfach zu handhaben. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Zellen während des endgültigen Formbildungsprozesses unerwartete dynamische Formänderungen erfahren. Um die endgültigen Formbildungsmechanismen genau zu verstehen, ist es wichtig, die kontinuierlichen Veränderungen der Zellform gründlich zu erfassen und die Mechanismen hinter diesen Veränderungen und ihre Bedeutung für die Morphogenese zu untersuchen.
Die nächsten Fragen, die wir beantworten wollen, sind, wie die Parthenon-ähnliche Struktur vorübergehend gebildet wird und wie sie zur feineren Formbildung beiträgt. Sammeln Sie zunächst weiße Puppen des gewünschten Stammes von Drosophila melanogaster aus Fläschchen und legen Sie sie mit einem Pinsel in Schalen oder leere Fläschchen. Inkubieren Sie die gesammelten weißen Puppen mindestens 14 Stunden lang bei 25 Grad Celsius, bis sie das gewünschte Stadium für die Beobachtung erreicht haben.
Entfernen Sie mit einem in destilliertem Wasser getränkten Pinsel vorsichtig Kleber und Fliegenfutter von der Oberfläche des Pupariums. Legen Sie dann die gereinigten Puppen auf Reinigungstücher und lassen Sie sie einige Minuten trocknen. Befestigen Sie nun ein Stück doppelseitiges Klebeband an einem Objektträger und legen Sie die getrockneten Puppen mit der Bauchseite nach unten auf das doppelseitige Klebeband.
Drücke mit einem getrockneten Pinsel vorsichtig auf die dorsale Seite der Puppen, um die Haftung auf dem doppelseitigen Klebeband zu verbessern. Unter einem Stereomikroskop öffnen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das Operculum des Pupariums. Führen Sie eine Spitze der Pinzette vom Rand des geöffneten Operculums aus in den Raum zwischen der Puppe und dem Puparium ein.
Fassen Sie dann mit der Pinzette das Puppe und ziehen Sie es nach außen, bis es aufbricht. Heben Sie die abgerissenen Fragmente des Pupariums an und kleben Sie sie auf das doppelseitige Klebeband. Bereiten Sie zunächst das Puppenbein von Drosophila melanogaster für die Bildgebung vor.
Tragen Sie je nach verwendeter Linse einen Mikroliter destilliertes Wasser oder Silikonöl auf den Boden einer Glasbodenschale auf. Tränken Sie dann einen Pinsel in destilliertem Wasser und schöpfen Sie die Puppe vorsichtig auf. Lege die Puppe mit der Bauchseite nach unten auf das destillierte Wasser oder Silikonöl in die Schale.
Füge mit einer Mikropipette 10 Mikroliter destilliertes Wasser in der Nähe des Randes des Glasteils der Schale hinzu. Trage mit einer Spritze einen Kreis aus Silikonfett um den Rand des Glasteils der Schale auf. Legen Sie dann einen Deckglas auf das Silikonfett, um die Schale zu verschließen.
Nachdem Sie das konfokale Mikroskop und die Software eingeschaltet haben, stellen Sie die Glasbodenschale mit der Puppe auf den Mikroskoptisch und bilden Sie den gewünschten Interessenbereich ab. Die Epithelzellen in der Fußwurzel bildeten zwischen 16 Stunden und 27,5 Stunden nach der Pupariumbildung apikobasale Basalfortsprünge und basale Verbindungen, die an den Parthenon erinnern. Eine fortschreitende Verringerung der Epitheldicke wurde von 41 Stunden bis 60 Stunden nach der Pupariumbildung beobachtet, selbst nachdem der Umriss des Beingewebes genauer definiert wurde.
