Siamo grati a Chun-lan Hsu e Yu-Chi Yang per la preparazione del cibo mosca e il mantenimento delle scorte mosca, e Su-Ping Lee e l&#39;IMB Imaging Nucleo per il loro aiuto con la microscopia confocale. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni a YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, PIÙ 103-2311-B-001 -035 -MY3) dal Consiglio nazionale della Scienza e il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Repubblica Popolare cinese.

Impostazione 1. Pre-sperimentale <ol><li> Raccogliere un uovo mosca che esprime nucleare proteina fluorescente verde (GFP) sotto mδ0.5-GAL4 e la cultura a 25 ° C per 5 giorni. </li><li> Microonde 0,7 g di agarosio bassofondente in 10 mL di 1x salina tamponata con fosfato (PBS) finché l&#39;agarosio è completamente sciolto. Mantenere il gel bassofondente 0,7% in un incubatore a 37 ° fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Sterilizzare tutti gli utensili, tra cui pinze, forbici, 42 mm x 0,17 mm coprioggetto, di una piastra di vetro 9-well, e una camera di coltura magnetico, con il 70% di etanolo per più di 12 ore. </li><li> Preparare il terreno di coltura 3: media Drosophila Schneider integrato con 2% di siero fetale bovino (FBS), 0,5% di penicillina-streptomicina, e 1,25 mg / ml di insulina. Per evitare la contaminazione, preparare il mezzo in una cappa di coltura cellulare. Conservare il terreno di coltura preparato a 4 ° C ed utilizzato entro un mese. </li><li> Pulire la piattaforma dissezione e lo sperimentatore&#39;s mani con il 70% di etanolo prima di iniziare la dissezione. </li></ol> Dissection 2. Disco <ol><li> Far asciugare tutta l&#39;attrezzatura dal 70% di etanolo. </li><li> Seleziona una larva terzo instar da una fiala mosca. Per evitare la contaminazione dalla fiala mosca, lavare la larva in 1x PBS 3x per rimuovere i rifiuti. </li><li> Sezionare la larva pulito in 1 ml di terreno di coltura (a RT) nel posto piatto di vetro 9-bene sotto un microscopio di dissezione. </li><li> Afferrare la larva con un paio di pinze a circa un terzo della distanza tra l&#39;estremità posteriore e un altro pinza del gancio bocca. Tirare le due pinze in direzioni opposte per rilasciare i tessuti interni. <ol><li> Rimuovere le ghiandole salivari, il grasso corporeo, e cuticola dal complesso occhio-cervello attaccato al gancio bocca. Se il cordone nervoso ventrale è ancora attaccato, tagliare con le forbici. </li></ol></li><li> Utilizzare un paio di pinze per afferrare il gancio bocca e una coppia di pinze per rimuovere un pezzo di tessuto che connects il cervello e dischi degli occhi nella parte dorsale. NOTA: Se questo tessuto non viene rimosso, i due dischi eye-antenne saranno vicini l&#39;uno all&#39;altro e il cervello. I dischi oculari verranno quindi non piatte sul vetrino perché questo tessuto, il cervello, e il disco eye-antennale formeranno un triangolo. </li><li> Ruotare l&#39;intero complesso ad una posizione ventrale-alto. Rimuovere il filamento che collega il gancio o disco al cervello. NOTA: Se il filamento non viene rimosso, il disco occhio-antennale si dividerà in due pezzi quando il gancio bocca viene rimosso. <ol><li> Rimuovere il gancio bocca. Fare attenzione a non danneggiare il disco occhio durante il processo. NOTA: Il disco occhio è ora gratuito nel medio e solo collegata al cervello attraverso il gambo ottica. </li></ol></li></ol> 3. Montaggio <ol><li> Aria secca e assemblare i componenti della camera con un 42 copri oggetto x 0,17 millimetri. Collegare un doppio strato di O-ring al centro del vetrino per tenere the agarosio. </li><li> Montare la camera con coprioggetto. Mettere i 42 mm x 0,17 millimetri vetrino sul palco accettore. Posizionare l&#39;anello O-silicio sul vetrino. Posizionare la base. Bloccare l&#39;armadietto di tenuta e posizionare il coperchio (Figura 1). </li><li> Trasferire accuratamente il complesso occhio-cervello sezionato al centro di O-ring con una micropipetta 20 l con una punta di 10-200 microlitri. </li><li> Rimuovere la maggior parte del mezzo e aggiungere 12 ml di 0,7% agarosio bassofondente (a 37 ° C) al campione. NOTA: La posizione del disco occhio può essere modificata con una pinza prima della solidificazione del agarosio. L&#39;agarosio si solidifica entro 5 minuti. <ol><li> Aggiungere 1 ml di terreno di coltura a temperatura ambiente al centro di O-ring; ciascun O-ring può caricare fino a 4 campioni. Assicurarsi che l&#39;agarosio è incollato alla O-ring per evitare la deriva del campione. NOTA: Non aerazione o di circolazione del mezzo è necessaria. </li></ol></li></ol>4. Microscopia confocale <ol><li> Posizionare la camera sulla scena di un microscopio confocale invertito per 30 minuti per equilibrare la temperatura. Questo può evitare la dispersione asse Z durante l&#39;imaging. </li><li> Prima di immagini dal vivo a lungo termine, controllare se il tessuto è intatto dal microscopio a contrasto di interferenza differenziale. </li><li> Per evitare la fototossicità, utilizzare un laser di potenza inferiore al 2 mW. Utilizzare un obiettivo 40X per l&#39;imaging. </li><li> Acquisire 62 um immagini Z-stack di 12 min con un intervallo ottico di 1 um. Acquisire 40 cicli di scansione per un totale di 10 h. Assicurarsi che ogni ciclo contiene 12 min di imaging e 3 min di riposo. </li></ol>

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangement+and+cell+division+during+the+tissue+level+morphogenesis+of+evaginating+Drosophila+imaginal+discs.">Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs.</a> Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).</li><li>Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+in+living+animals+reveals+dynamic+developmental+responses+to+ecdysone+during+drosophila+metamorphosis.">GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis.</a> Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).</li><li>Gibbs, S. M., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+cyclic+GMP+regulate+retinal+patterning+in+the+optic+lobe+of+Drosophila.">Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila.</a> Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).</li><li>Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+and+Minimal+Culture+Requirements+for+Evagination+of+Imaginal+of+Drosophila-Melanogaster+in-Vitro.">Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro.</a> Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo studio, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per un esperimento di imaging dal vivo a lungo termine su dischi immaginali Drosophila. Abbiamo passato un sacco di tempo praticando la dissezione attenta per evitare danni disco e per consentire il fissaggio del disco vicino alle lamelle. Abbiamo provato Poli-L-lisina (PLL) e basso punto di fusione agarosio per tenere il tessuto; Alla fine, l&#39;agarosio a bassa fusione ha mostrato una migliore capacità di trattenere il tessuto. Anche se solo il disco occhio è stato utilizzato in questo documento per dimostrare la normale verificarsi di differenziazione dei fotorecettori e rotazione ommatidial durante il periodo in vivo imaging 10 h, questo metodo può essere applicato ad almeno un altro disco, il disco ala, come dimostrato in un studio precedente 3. Inoltre, la preparazione del mezzo di coltura e la configurazione di imaging in tempo reale sono semplici e non richiedono l&#39;aerazione o medio circolazione. Continuo immagini dal vivo in grado di fornire una chiara sequenza temporale di vigilia biologicanti. Nella nostra precedente relazione di differenziazione glia e la migrazione nel disco occhio, abbiamo fornito la prova diretta che glia avvolgenti differenziano dalla glia esistente dopo la migrazione a anteriore del disco occhio 3. A lungo termine ex vivo della cultura consente la specifica di etichettatura laser-attivata di cellule, come la foto-conversione della proteina fluorescente KAEDE, a seguire i loro comportamenti 3. Può ospitare anche la sperimentazione di sostanze chimiche che vengono aggiunti direttamente al mezzo di coltura; Quindi, può essere utilizzato come piattaforma di screening farmaco. Da qualche processo dinamico verifica entro minuti o secondi, è richiesta un&#39;elevata risoluzione temporale. Per migliorare la risoluzione temporale, foglio microscopia ottica 15, 16 o filatura disco microscopia 17 può essere una buona opzione. La condizione cultura attuale non è perfetta. Non supporta la crescita del disco. cellulare proliferation è supportata solo fino a 12 h 3. Dopo 12 ore in coltura ex vivo, il tasso di differenziazione dei fotorecettori inizia a diminuire 3. Ciò può essere dovuto alla mancanza di determinate sostanze nutritive o ormoni. Poiché la differenza principale in questo terreno di coltura è l&#39;alta concentrazione di insulina, l&#39;insulina mammiferi può essere parzialmente mimando la funzione di peptidi insulino-simile endogeni. L&#39;aggiunta di estratto di volare, l&#39;insetto trealosio di zucchero nel sangue, e varie concentrazioni dell&#39;ormone muta 20-hydroxyecdysone, non erano favorevoli 3. Tuttavia, il periodo di coltura 12-18 h è sufficiente per studiare molti processi di sviluppo. Metodi di coltura alternativi per la coltura dischi immaginali larvali sono stati confrontati 3, e la nostra coltura e di imaging condizioni fornisce la finestra di tempo più lungo e più chiarezza per l&#39;imaging dal vivo. Sebbene i dischi all&#39;interno di larve vive e pupe possono essere esposte direttamente18, 19, 20, 21, 22, la finestra risoluzione e il tempo per le osservazioni sono limitate. Tardi larvale e dischi pupa possono essere coltivate per lungo tempo 23, 24, ma i dischi subiscono significativa morfogenesi. Per sfruttare le piane, dischi larvali 2D, il nostro metodo di coltura e di imaging è la soluzione migliore finora.

I Drosophila larvali dischi imaginali sono stati un sistema sperimentale favorita per lo studio di una grande varietà di meccanismi biologici. Questi dischi invaginate dall&#39;epitelio embrionale e diventano strutture sac-come costruito da due strati epiteliali, Peripodial Epitelio (PE) e Disc Proper (DP) 1, 2. Le cellule disco imaginal proliferano e progressivamente differenziano durante gli stadi larvali e pupe ed eventualmente sviluppare nelle strutture corporee degli adulti. A causa della struttura a due strati piatta e semplice dei dischi imaginali, sono facili da osservare quando sezionato da larve. Tuttavia, nonostante molti sforzi da molti gruppi, i metodi attuali per la cultura a lungo termine dei dischi immaginali non sono stati soddisfacenti. Abbiamo recentemente messo a punto un metodo di coltura che può sostenere il normale sviluppo di molteplici dischi immaginali per un massimo di 18 ore e che permette l&#39;imaging dal vivo 3 </sup&gt;. Il metodo di coltura può supportare la differenziazione e migrazione cellulare, ma può sostenere la proliferazione cellulare solo per 7-12 ore e non può sostenere la crescita disco. La differenza principale nel mezzo di coltura è l&#39;alta concentrazione di insulina 3. Il metodo è semplice, e non richiede alcun particolare aerazione o medio circolazione. Uno dei dischi immaginali più studiato è il disco di eye-antenne. L&#39;occhio di Drosophila è costruita di circa 800 ommatidi. Ogni ommatidium comprende otto fotorecettori (R1-R8). Nel disco occhio larvale, le cellule visive differenziare dopo il passaggio del Morfogenetica Solco (MF), che spazia attraverso il disco occhio da posteriore ad anteriore 4, 5. I fotorecettori in un ommatidium differenziano in sequenza, cominciando con R8, seguita da R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 e 6. L&#39;ommatidi nella dorsale e vemetà ntral del disco dell&#39;occhio subiscono una rotazione di 90 ° in senso opposto, con conseguente chiralità opposta 7, 8. Il processo di rotazione avviene in due fasi: in primo luogo, una rotazione di 45 ° inizia a ed è completato alla sesta fila ommatidi dietro la MF; la seconda rotazione di 45 ° si completa in circa 16 fila 9, 10. Questo studio ha utilizzato rotazione ommatidial, contrassegnata dalla R3 / 4-specifici mδ0.5-GA4 11, per dimostrare la differenziazione cellulare normale e dinamiche che possono essere osservati attraverso questo metodo di coltura e vivere immagine disco occhio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:71px;">AMRESCO&#160;</td>
			<td style="width:215px;">0815-25G</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0780-2PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">42x0.17 mm cover slips&#160;</td>
			<td>PST</td>
			<td>G401-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Schneider&#8217;s Drosophila medium&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>21720-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:215px;">I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture chamber&#160;</td>
			<td>PECON</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>POC-R2 Cell Cultivation System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x objective</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td>C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fly strain:nls.GFP</td>
			<td style="width:71px;">Bloominggton</td>
			<td align="right" style="width:215px;">4775</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term live imaging of drosophila eye disc

Immagini dal vivo offre la possibilità di monitorare continuamente i processi cellulari e dello sviluppo dinamico in tempo reale. Drosophila dischi imaginal larvali sono stati utilizzati per studiare molti processi biologici, quali la proliferazione cellulare, la differenziazione, la crescita, migrazione, apoptosi, concorrenza, segnalazione cellula-cellula, e la formazione confine compartimentale. Tuttavia, i metodi per il lungo termine ex vivo della cultura e immagini dal vivo dei dischi immaginali non sono stati soddisfacenti, nonostante i molti sforzi. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo per il lungo termine ex vivo la cultura e l&#39;imaging dal vivo di dischi immaginali per un massimo di 18 ore. Oltre a utilizzare una concentrazione elevata di insulina nel mezzo di coltura, un agarosio bassofondente è stato utilizzato anche per incorporare il disco per evitare che deriva durante il periodo di imaging. Questo rapporto utilizza i dischi eye-antennomero come esempio. / 4-specifico espressione fotorecettore R3 mδ0.5-GA4 stata seguita per dimostrare che fotorecettore differenziazione e rotazione ommatidial possono essere osservati durante un periodo imaging dal vivo 10 h. Questo è un protocollo dettagliato descrive questo metodo semplice.

<html> In questo esempio, i fotorecettori R3 / R4 sono stati marcati con mδ0.5-GA4 per monitorare differenziazione dei fotorecettori. mδ0.5-GA4 spinge forte espressione in R4 ed espressione debole in R3 11, rendendolo un eccellente indicatore di R3 e R4, nonché per il processo di rotazione ommatidial. Nel film 1, R3 e R4 sono stati etichettati con GFP. All&#39;inizio del 10 h sessione live-imaging, c&#39;erano 8 file di cluster ommatidial (Figura 2A e film 1) e 14 righe di cluster ommatidial alla fine (Figura 2B). Il tasso di differenziazione ommatidial era 1,67 h per riga, che è vicino al tasso di 1,5-2 h / riga dischi in vivo 7, 8, 9, 10, 11,s = &quot;xref&quot;&gt; 12, 13, 14. Sulla base delle posizioni relative di R3 e R4, rotazione ommatidial verificato nel disco coltivate ex vivo durante l&#39;imaging in tempo reale (Figura 2A &#39;A &#39;&#39;, B&#39;, e B &#39;&#39;). Un singolo gruppo R3 / R4 è stato marcato con una sfera bianca nel primo fotogramma del film 2. In principio, l&#39;asse R3 / R4 sembra essere perpendicolare all&#39;equatore (Figura 2C e film 2). Quindi sembra ruotare di 15 °, 30 °, e 45 ° a 3 (Figura 2C &#39;), 6 (Figura 2C &#39;&#39;) e 9 (figura 2C &#39;&#39;&#39;) h, rispettivamente. Questi dati suggeriscono che questo metodo può sostenere la differenziazione dei fotorecettori durante la 10 ore di immagini in diretta. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig1.jpg" /> Figure 1: Schema dell&#39;Assemblea Camera. Schema di montaggio della camera: (1) Inserire il coprioggetto doppio strato O-ring-attaccato sulla accettore palco. (2) Inserire l&#39;O-ring silicio sul vetrino. (3) Posizionare la base. (4) Bloccare l&#39;armadietto di tenuta. (5) Caricare il campione al centro della O-ring e posizionare il coperchio. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55748/55748fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748fig2.jpg" /> Figura 2: Imaging vivo di R3 / R4 Differenziazione e rotazione. R3 / R4 etichettato con mδ0.5-GAL4 espressione forma nucleare GFP per 10 h di imaging dal vivo. Tutte le figure sono state catturate dal film 1. (A) Immagine catturata all&#39;inizio. ( <strong<html> &gt; A&#39;-A&quot;) Immagine ingrandita dalla zona in scatola a sinistra (A&#39;) e destra (A&quot;). (B) immagine presa al termine del periodo di 10 h. (B&#39;-B&quot;) Immagine ingrandita dalla zona in scatola a sinistra (B&#39;) e destra (B&quot;). (CC &#39;&#39; &#39;) Una singola coppia R3 / R4 (contrassegnata da una freccia in A&#39;) è seguita nel tempo per mostrare la rotazione della coppia R3 / R4. Barre di scala = 15 micron, 10 micron e 5 micron in A, B, e C, rispettivamente. Tutte le figure sono di massima intensità z-proiezioni. La scala temporale è mostrata in h: min. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55748/55748fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov1.jpg" /> Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Clicca qui per scaricare questo film. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/55748/55748mov2.jpg" /> Film 1: <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55748/Movie_2.avi" target="_blank">Si prega di cliccare qui per scaricare questo film.</a>

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per il lungo termine coltura ex vivo e in vivo imaging di un disco immaginale Drosophila. Dimostra la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidial entro il periodo di 10 h di immagini dal vivo del disco occhio. Il protocollo è semplice e non richiede l&#39;installazione costosa.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

long-term-live-imaging-of-drosophila-eye-disc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

8.4K Views.  National Yang-Ming University.  Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per il lungo termine coltura ex vivo e in vivo imaging di un disco immaginale Drosophila. Dimostra la differenziazione dei fotorecettori e la rotazione ommatidial entro il periodo di 10 h di immagini dal vivo del disco occhio. Il protocollo è semplice e non richiede l'installazione costosa. 

Video: Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

Imaging Dpp Release da un disco ala Drosophila

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...