Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. preparazione di soluzioni e tirato Vetro ago <ol><li> Fare una soluzione 25x magazzino di Tricaine (3-amino acido benzoico etil estere, chiamato anche etil 3-aminobenzoate) a 4 mg / ml in 20 mM Tris pH 8.8 e portare questa soluzione è a pH 7. aliquota del 4 ml e conservare a -20 ° C. NOTA: L&#39;anestetico Tricaine agisce preferenzialmente sui canali del sodio voltaggio-dipendenti neurali bloccando così contrazioni muscolari e il movimento 6. </li><li> Effettuare una soluzione di lavoro di Tricaine ad una concentrazione finale di 0,17 mg / ml in terreno di embrione E3. 7 NOTA: Rendere il Tricaine soluzione di lavoro estemporaneamente come il pH di questa soluzione va alla deriva. </li><li> Sciogliere l&#39;agarosio a basso punto di fusione ad una concentrazione finale di 1,5% in E3 medio embrione in un tubo da 50 ml riscaldando la soluzione in un forno a microonde. Lasciate che questa soluzione equilibrare a 42 - 45 ° C sia in un bagno d&#39;acqua o da banco incubatore. Se la preparazione di piatti di grandi dimensioni per il verticaleluce fogli di imaging (fase 4), fanno un ulteriore 25 ml di 1% di fusione standard di agarosio nel medio embrione E3. </li><li> Utilizzare vetro borosilicato con capillari filamento con dimensioni di diametro 1,20 millimetri, ID 0,69 millimetri, la lunghezza di 10 mm. </li><li> Se capillari sono tirati dal tipo di riscaldamento-filamento ago estrattore descritto nella tabella di attrezzature e reagenti, utilizzare le seguenti impostazioni: Calore 600, Pull 120, velocità 50, Tempo 225, pressione 500. Con un paio di pinze taglienti, pausa l&#39;ago appena passato il punto in cui si flette per creare un ago pulito e tagliente per orientare embrioni e rimuovendo l&#39;eccesso di agarosio. Un micro-bisturi può anche essere usato per rimuovere l&#39;eccesso di agarosio. </li></ol> 2. Integrazione di embrioni per la microscopia invertito o verticale <ol><li> Alza gli embrioni fino allo stadio appropriato in media embrione E3. 7 </li><li> In fase di richiesta, gli embrioni dechorionate con un paio di pinze forte sotto un binocolo dissezioneMicroscopio ting. </li><li> Incubare gli embrioni dechorionated per almeno 5 minuti nella soluzione di lavoro Tricaine. </li><li> Una volta che la soluzione di agarosio fuso è stata raffreddata a 45 ° C, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro per trasferire l&#39;embrione dechorionated direttamente nel tubo 50 ml con trasferimento minimo di mezzo E3. </li><li> Rimuovere embrione insieme con circa 1 ml di mezzo di montaggio e aggiungere circa. 100 pl di mezzo di montaggio insieme con l&#39;embrione al cerchio centrale di una capsula di Petri con fondo 35 mm, con micropozzetti 10 mm. </li><li> Poiché il mezzo di montaggio è l&#39;impostazione, spostare l&#39;embrione al bordo del cerchio di agarosio con la coda rivolta verso l&#39;esterno (Figura 1A). Utilizzare l&#39;ago capillare per mantenere l&#39;embrione con l&#39;orientamento laterale desiderato fino a quando il gel è completamente impostata. Per un&#39;immagine di sviluppo del corpo posteriore, fare attenzione a orientare l&#39;embrione come laterale un orientamento il più possibile. Pertanto, mantenere l&#39;embrione in questa posizione da attenti Rettifichets con l&#39;ago capillare. NOTA: embrioni multipli possono essere aggiunti al piatto di montaggio, a questo punto, se necessario. Se questo è il caso, trasferire il bassofondente agarosio nel piatto prima e aggiungere gli embrioni al centro della goccia di agarosio. Poi, spingere gli embrioni verso i bordi dell&#39;anello vetro e orientare nella posizione desiderata. Fino a sei embrioni può essere montato in questo modo prima che il agarosio diventa solidificato. </li></ol> 3. La rimozione di un eccesso di agarosio intorno al corpo posteriore NOTA: Questa sezione descrive la procedura con la quale agarosio viene rimosso dalla regione che circonda il corpo posteriore. Nel caso di allungamento del corpo posteriore, è importante garantire che la coda può crescere-out normalmente. Rimuovendo l&#39;agarosio dopo l&#39;embrione è stato completamente incluso da agarosio, l&#39;embrione viene lasciata delimitata dalla regione della testa e circa la metà del sacco vitellino. <ol><li> Una volta che la goccia di agarosio ha fissato, inondare il petri diSH con la soluzione di lavoro Tricaine. </li><li> Sotto un microscopio binoculare dissezione con una base a luce trasmessa, regolare la posizione dello specchio e l&#39;angolo della luce incidente tale che la forte contrasto permette ai tagli nella agarosio per essere visto chiaramente attraverso l&#39;operazione. </li><li> Per eseguire taglio 1 (Figura 1), utilizzare l&#39;ago capillare o micro-bisturi per tagliare la metà strada agarosio lungo il tuorlo, da una posizione immediatamente posteriore al campo cuore formatura alla posizione del somite 5 (5 ° somite anteriore). </li><li> Avviare il taglio iniziale adiacente al cuore formatura come mostrato, e il modo completo attraverso l&#39;agarosio al vetro. </li><li> Tenere il capillare o micro-bisturi in profondità all&#39;interno della agarosio, e lentamente ha visto su e giù mentre cominciando a fare un lungo taglio sopra l&#39;embrione come mostrato Figura 1. Tagliare il più vicino per l&#39;embrione possibile senza pungere l&#39;embrione o il tuorlo. </li><li> Successivamente, effettuare tagli 2 e 3 (Figura 1 </strong&gt;), Partendo dalla posizione contro l&#39;embrione e con il taglio andando fino in fondo al vetro a fondo piatto. Rendere taglio 2 in modo che sia tangente ai primi 5 somiti, consentendo piena dorsalward dispiegamento del corpo posteriore. Rendere tagliare 3 a 90 ° con la superficie tuorlo e partendo dal Heartfield. NOTA: Taglio agarosio finché il bordo del cerchio di vetro (come mostrato in figura 1) aiuti nel rimuovere il agarosio come blocco completo (passo 3.6). Tuttavia, questo non è necessario. </li><li> Partendo all&#39;intersezione di tagli 1 e 3, fare un taglio lenta diagonale verso la fine del taglio 2 mentre lentamente sollevamento verso l&#39;alto per rimuovere il quadrato agarosio che circonda il corpo posteriore. Note: In alcuni casi, questo sarà rilasciato in un blocco e l&#39;operazione viene completata in un colpo solo. In altri casi, potrebbero essere necessari diversi tentativi per dis-lodge tutto il agarosio che circonda l&#39;embrione. </li><li> Con un paio di pinze taglienti, rimuovere il b sloggiatociocche di agarosio dal mezzo embrione. Per facilitare questo processo, spostare i pezzi agarosio al lato del piatto e utilizzare la parete della capsula di Petri da supporto sollevando i pezzi agarosio. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Figura 1: Schemi di montaggio set-up. (A) Il diagramma mostra la posizione dell&#39;embrione montato all&#39;interno dell&#39;anello bicchiere centro di una piastra di Petri. Sulla destra è uno zoom di un embrione con ogni taglio successivo attraverso il circostante agarosio mostrata con linee rosse dottted. (B) Gli embrioni montato è diagrammed in vista laterale la visualizzazione della facilità di accesso per entrambi gli obiettivi invertiti e in posizione verticale. (C) Un digram simile che mostra come gli embrioni possono essere montati per immagini fogli luce verticale set-up. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cl</a>ick qui per vedere una versione più grande di questa figura. <ol start="9"><li> Se contrazioni muscolari non è completamente bloccato in quel punto, aggiungere gocce di Tricaine dalla soluzione madre di 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. Montaggio di embrioni per la Luce della scheda verticale Microscopia NOTA: Questa è una variante del metodo sopra descritto, che consente l&#39;accesso di obiettivi multipli per l&#39;imaging di campioni da SPIM verticalmente orientati. L&#39;idea alla base di questa variante è quella di togliere il campione leggermente superiore al fondo del piatto, per consentire un facile accesso delle due obiettivi di imaging. <ol><li> Prima del campione di montaggio, cappotto una capsula di Petri in plastica 100 mm con 1% agarosio in medium E3 ad un&#39;altezza di 5 mm e lasciare solidificare. </li><li> Mettere una goccia di 1 ml di basso punto di fusione agarosio al centro del piatto e lasciare solidificare. </li><li> embrioni Incorpora in basso punto di fusione agarosio come nella sezione 2. Tuttavia, questa volta, rimuovere l&#39;embrione dal tubo 50 mldi agarosio con una goccia più piccola di soluzione (0,5 ml) e collocarlo piccola goccia in cima al 1 ml cadere nel centro del piatto. </li><li> Utilizzare l&#39;ago capillare per posizionare l&#39;embrione nel centro della piccola goccia e mantenere il corretto orientamento fino ad impostare gel. </li><li> Inondare il piatto con soluzione di lavoro Tricaine e rimuovere l&#39;eccesso di agarosio come nella sezione 3, ma senza tagliare attraverso il cuscino del 1% agarosio standard. </li></ol>

<ol>
	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questa tecnica di montaggio consente di embrioni da tenere ancora durante il trasferimento al microscopio e oltre esperimenti di imaging time-lapse a lungo termine volti a seguito posteriore allungamento del corpo a più scale di lunghezza. Inoltre, è versatile in quanto consente per l&#39;esposizione su entrambi microscopia verticale e capovolto set-up, e un suggerimento è fatto per come questo può essere ulteriormente adattata per SPIM orientato verticalmente. Un passo fondamentale in questo protocollo è l&#39;attenta rimozione di un eccesso di agarosio che circonda il corpo posteriore, che è importante per consentire il normale sviluppo di tale struttura. È importante fare attenzione qui non danneggiare l&#39;embrione, soprattutto quando si rimuove l&#39;agarosio intorno alla parte superiore del tuorlo. Inoltre, è necessario prestare attenzione quando si rimuove il blocco agarosio taglio intorno dell&#39;embrione, come a volte è possibile perdere l&#39;embrione dallo stampo durante questo processo. Per queste ragioni, questo è un metodo a basso rendimento that non è adatto per il montaggio di molti embrioni zebrafish simultaneamente, in contrasto già pubblicato metodi che utilizzano 3D stampata stampi di plastica. 8, 9 Tuttavia, gli embrioni sono altamente stabile con questo metodo di montaggio e di conseguenza possono essere trasportati molto più facile microscopio, e mantengono il loro orientamento 3D tutto allungamento corpo posteriore. Un altro punto critico è l&#39;accuratezza dell&#39;orientamento laterali iniziale dell&#39;embrione, evitando qualsiasi antero-posteriore o tilt dorso-ventrale. Inclinare preclude la visione laterale del corpo di estensione posteriore che è il più conveniente angolo di visualizzazione per ulteriori analisi. L&#39;inclinazione antero-posteriore sarà in seguito aggiunta nel corpo posteriore, che cresce verso l&#39;alto o verso il basso rispetto al piano orizzontale, il che significa l&#39;acquisizione di una sovrapposizione maggiore in curva e quindi di tempo decade con una risoluzione temporale inferiore. Questo metodo è versatile e ha consentito per l&#39;imaging di tassi divisione cellulare con l&#39;utilizzo della linea Fucci 5, 10 nonché analisi morfometriche multi-scalare. 5 Tuttavia, data la cilindrata totale drammatica del tailbud durante l&#39;allungamento dell&#39;asse corpo posteriore, obiettivi solo relativamente basso ingrandimento può essere utilizzato per catturare l&#39;intero processo come mostrato in Figura 2. Questo perché maggiore produce ingrandimento della regione di interesse lasciando il campo di vista entro 3 - 4 h di acquisizione (Video Figura 1). Pertanto, un modo per migliorare ulteriormente l&#39;imaging del tailbud è di avere un algoritmo di inseguimento automatico che può seguire il movimento complessivo del tailbud e regolare il x, y, z della posizione palco microscopio durante l&#39;acquisizione. Data la maggiore stabilità dell&#39;embrione in tutte le dimensioni assiali con il metodo di montaggio qui descritto, dovrebbe essere suscettibili ditale approccio.

Posteriore allungamento corpo è un processo essenziale nello sviluppo embrionale da cui l&#39;embrione si estende per formare una grande parte dell&#39;asse corpo. Si tratta di un esempio di un complesso processo morfogenetico da cui comportamenti delle cellule multiple agire coordinatamente per generare la morfogenesi a livello dei singoli tessuti. Queste deformazioni tissutali differenziale quindi agiscono insieme per generare l&#39;allungamento del corpo posteriore, a tutto il livello della struttura. Per capire come questi processi sono controllati e coordinati durante lo sviluppo, dobbiamo essere in grado di seguire questi processi a scale multiple (cioè a livello di molecole, cellule, le popolazioni di cellule e tessuti) e di mettere in relazione questo direttamente alla morfogenesi di tutta la struttura . zebrafish embrioni sono ideali per l&#39;imaging posteriore allungamento corpo come la trasparenza ottica e piccole dimensioni permette l&#39;applicazione di immagini poco minimamente invasiva approcci adatta a live imaging. 1 Ciò è stato evidenziato da una serie di recenti pubblicazioni che hanno fatto luce sullo sviluppo del corpo posteriore a livello di molecole, 2 singole cellule, 3 e inter-tessuto comportamenti, 4 nonché a livello della popolazione cellulare e tutto l&#39;organo. 5 tecniche di imaging avanzate come confocale, microscopia multi-fotone e piano selettivo illuminazione microscopia (SPIM) stanno permettendo la formazione immagine a lungo termine dei processi di sviluppo, con effetto di tossicità luce e fotometabolismo diminuito. tecniche robuste per il montaggio di campioni vivi sono necessari per raggiungere tre obiettivi: 1) sostegno sufficiente per mantenere campioni nell&#39;orientamento corretto durante il trasferimento al microscopio e durante l&#39;acquisizione, 2) sufficiente libertà di movimento del campione per consentire la conseguenza di la regione di corpo posteriore senza compromettere la sua normale develluppo, e infine 3) un certo grado di versatilità del metodo di montaggio per consentire imaging diverse immagini set-up. Questo protocollo introduce una tecnica di montaggio per l&#39;imaging lo sviluppo del zebrafish D. rerio. Questa tecnica comporta embrioni montaggio in modo che le regioni della testa e del sacco vitellino sono quasi interamente inclusi in agarosio, lasciando la regione di body posteriori ad allungarsi e svilupparsi normalmente. Come tale, è anche un metodo appropriato per imaging a lungo termine delle altre regioni del corpo di sviluppo come l&#39;agarosio permette l&#39;imaging mediante tecniche di imaging luce standard. Questo protocollo dimostra montaggio di embrioni in un orientamento laterale, anche se è possibile montare embrioni in orientamenti alterative. Sarà inoltre mostrerà come adattare il metodo per configurazioni microscopia ottica fogli verticali, invertiti e verticali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="727">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">CONSUMABLES</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass-bottomed dishes</td>
			<td>Mattek</td>
			<td>P35-1.5-10-C</td>
			<td>35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td>&#160;Sutter&#160;</td>
			<td>BF 120-94-10</td>
			<td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>P-715</td>
			<td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low-melting point agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps&#160;</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&#160;</td>
			<td>11252-30&#160;</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle puller&#160;</td>
			<td>Sutter&#160;</td>
			<td>P97</td>
			<td>Heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S8 Apo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

embrioni di zebrafish offrono un sistema sperimentale ideale per studiare processi morfogenetici complessi a causa della loro facilità di accessibilità e trasparenza ottica. In particolare, l&#39;allungamento del corpo posteriore è un processo essenziale nello sviluppo embrionale da cui più deformazioni tissutali agiscono insieme per dirigere la formazione di una grande parte dell&#39;asse corpo. Per osservare questo processo time-lapse imaging a lungo termine è necessario utilizzare una tecnica di montaggio che consente il supporto sufficiente a mantenere campioni nell&#39;orientamento corretto durante il trasferimento al microscopio e acquisizione. Inoltre, il montaggio deve anche fornire sufficiente libertà di movimento per la conseguenza della regione di corpo posteriore senza alterarne il normale sviluppo. Infine, ci deve essere un certo grado di versatilità del metodo di montaggio per consentire imaging diverse immagini set-up. Qui vi presentiamo una tecnica di montaggio per l&#39;imaging lo sviluppo di posteriori elongatio corpon nel zebrafish D. rerio. Questa tecnica comporta embrioni tale che le regioni della testa e del sacco vitellino sono quasi interamente inclusi in agarosio montaggio, lasciando la regione di body posteriori ad allungarsi e svilupparsi normalmente. Vi mostreremo come questo possa essere adattato per posizione verticale, capovolta e verticale luce fogli microscopia set-up. Anche se questo protocollo si concentra su embrioni per l&#39;imaging per il corpo posteriori di montaggio, potrebbe facilmente essere adattato per l&#39;imaging dal vivo di molteplici aspetti dello sviluppo zebrafish.

Il protocollo descritto sopra dettagli una tecnica versatile per il montaggio di embrioni di zebrafish per l&#39;imaging lasso di tempo a lungo termine. Un esempio di questo è mostrato in Figura 2A e animato / video Figura 1. Gli embrioni sono stati iniettati nella fase 1 cella con mRNA codificante la proteina fluorescente fotoconvertibile kikumeGR. Nella fase 15 somite sono stati montati come descritto sopra e ripreso per 12 ore su un microscopio confocale invertito con un obiettivo 10X. Le pile confocale risultanti sono stati proiettati al massimo per essere visualizzato come mostrato. Questo film mostra chiaramente che il corpo posteriore è consentito di muoversi liberamente per tutta la durata del film e mostra cambiamenti simili nella morfologia come si vede negli embrioni che sono autorizzati a sviluppare liberamente la loro corion in condizioni di coltura normali. Un ulteriore esempio è mostrato in F IGURA 2Be animazione / video Figura 2. Qui, gli embrioni sono stati iniettati nella fase 16 celle con una combinazione di mRNA codificanti istone 2B-mCherry proteine (che le etichette i nuclei) e eGFP: scatola CAAX (che le etichette membrane; per dettagli vedere di riferimento 5). Sono stati poi ripreso su un microscopio multiphoton in posizione verticale con un obiettivo immersione in acqua 25X come schematizzato in figura 1B. Le immagini sono state scattate per 3 ore dal palco 10 somite al fine di visualizzare i comportamenti cellulari durante tailbud formazione. Le celle possono essere visti da generare sporgenze attivi e movimenti direzionali come le forme tailbud normalmente. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig2.jpg" /> Figura 2: Esempi di Time-lapse imaging di posteriore Corpo allungamento a 10 ingrandimenti. (A) fotogrammi consecutividi un film rappresentante copre il processo di allungamento assiale. Gli embrioni sono mostrati in vista laterale con posteriormente al lato destro dell&#39;immagine. (B) fotogrammi consecutivi di un più alto ingrandimento filmato che mostra i comportamenti delle singole celle durante la formazione tailbud. Gli embrioni sono mostrati in vista laterale con posteriore alla destra. Le linee tratteggiate delineano la tailbud formatura. Le piccole linee colorate mostrano tracce di nuclei di seguire i movimenti delle singole celle. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/55210fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210video1.jpg" /> Animato / Video Figura 1: Time-lapse film di posteriore Corpo Allungamento di un KikumeGR mRNA iniettato zebrafish da Microscopia confocale. Embrione è mostrato con anteriore a sinistra e manifestoIOR a destra. Le immagini sono state prese a intervalli di 10 min a 10X di ingrandimento. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/Video_Figure_1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/55210/55210video2.jpg" /> Animato / Video Figura 2: Time-lapse film di posteriore Corpo Allungamento di un embrione Nucleare-mCherry e membrana GFP Labelled Zebrafish immaginata dal microscopia a due fotoni. Embrione è mostrato con anterior verso destra e posteriore sinistra. Le immagini sono state scattate ad intervalli di 2 min a 25X di ingrandimento. Linee colorate visualizzare le tracce delle celle per gli ultimi dieci passi temporali per ogni cella monitorato. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55210/video_figure_2.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

a-versatile-mounting-method-for-long-term-imaging-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Views.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Video: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

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Biologia dello sviluppo

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Una Camera Semplice per l&#39;Imaging Confocale a lungo termine dello sviluppo di radici e ipocotili

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Sviluppo di un modello di infezione del pesce zebra Larval per Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...