Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation della Cina (Grant n. 31400936, 31460260) e il Natural Science Foundation di Jiangxi Provincia della Cina (20171BAB215020). Ringraziamo anche il programma congiunto tra Università di Nanchang e Queen Mary University of London per sostenere questo lavoro.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Università di Nanchang.
1. Montare l'attrezzatura e collegare il microtomo
<ol><li>Progettare il parametro per i requisiti (integrativa Figura 1).</li>
	<li>Inviare il parametro per una fabbrica locale per produrre i pannelli acrilici.</li>
	<li>Montare tutte le parti in sequenza: utilizzare cloroformio per combinare 7 pannelli acrilici commerciale in un serbatoio con un bagno di acqua e canale di sezione (Figura 1). Attenzione: Cloroformio produce sostanze tossiche quando incontra la luce e l'ossigeno. Montare l'apparecchiatura in una cappa aspirante.</li>
	<li>Installare l'elemento riscaldante elettrico tubolare attraverso il foro nel bordo acrilico #1 (Figura 2A, punta di freccia).</li>
	<li>Per installare il regolatore di temperatura, creare un piccolo foro sul bordo acrilico #2 con un trapano elettrico e installare il rilevatore di temperatura (Figura 2A, freccia). Installare un termostato digitale sul serbatoio (Figura 2A). Nota: Il rilevatore di temperatura dovrebbe essere all'interno di 1 cm sotto la superficie dell'acqua.</li>
	<li>Per fornire l'accesso di potere, regolare la tensione sotto 24 V prima di accendere l'apparecchio.</li>
	<li>Rimuovere il vassoio dei rifiuti di sezione dal microtomo.</li>
	<li>Collegare il canale di sezioni con il supporto della lama del microtomo con sigillante siliconico neutro (Figura 2B). Nota: Non striscio qualsiasi sigillante siliconico neutro sopra la parte superiore della lama, affinché la vecchia lama può essere facilmente sostituita.</li>
	<li>A secco durante la notte per consentire il cloroformio e neutro del silicone sigillante per solidificare.</li>
	<li>Installare la lama per il supporto della lama. Versare acqua nel bagno d'acqua (Figura 2). La superficie dell'acqua deve solo toccare la parte superiore della lama (Figura 2D, testa di freccia).</li>
</ol>2. paraffina sezionamento
Nota: Detriti spesso si accumulano sui bordi superiori o inferiori del blocco di cera e la superficie dell'acqua. Questo detriti deve essere deselezionato regolarmente.
<ol><li>
Eseguire paraffina convenzionale sezionamento10.
	<ol>
<li>Bloccare il preparato di paraffina-incastonato su un microtomo rotativo e posizionare la lama in un portalama.</li>
		<li>Ruotare il volantino e la sezione del campione.</li>
		<li>Trasferire il nastro sezionato a bagno d'acqua calda di 38,5 ° C.</li>
		<li>Raccogliere che le sezioni sul microscopio scivolare dalla superficie dell'acqua dopo lo svolgimento.</li>
		<li>Asciugare i vetrini in un forno a 42 ° C durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paraffina migliorata sezionamento (Figura 3)
	<ol>
<li>Accendere l'apparecchiatura.</li>
		<li>Aprire la stufa con interruttore di rilevamento temperatura e impostare la temperatura mirata tra 38,0 ° C a 40,0 ° C per 1 h in anticipo di riscaldare l'acqua.</li>
		<li>Modificare il blocco di paraffina acquisito da inclusione in paraffina; quindi posizionare il blocco di paraffina su morsetto di microtomo e bloccarlo. Nota: I bordi superiori ed inferiori del blocco paraffina dovrebbero essere modificati in orizzontale per evitare che il nastro di sezione da formando un arco e diventando in grado di fluire attraverso il canale di sezioni strette.</li>
		<li>Avvicinarsi rapidamente il campione di taglio di sezioni più spesse.</li>
		<li>Regolare ad uno spessore di sezione adeguata (10 µm per cervelli di topo adulto, reni di topo adulto e cervelli di topo di embrione, 4 µm per zebrafish occhi). Ruotare il volantino e le sezioni verranno immesso automaticamente il canale sezioni e bagno.</li>
		<li>Sezione il campione in una corsa di taglio lento e uniforme (Figura 3A). Nota: Utile della prima sezione sarà modificato dopo il volantino è stato interrotto per qualche minuto. Le lame monouso devono essere sostituite quando le sezioni hanno graffi consecutivi.</li>
		<li>Guida le sezioni nella camera del bagno a galleggiare in una linea (Figura 3B, 3C). Nota: Se nella sezione head aderisce alla parete della camera, è possibile utilizzare una guida di pennello per tenerlo galleggianti.</li>
		<li>Rispettare le sezioni su vetrini da microscopio. Dopo le sezioni dispiegarsi pienamente nel bagno d'acqua, sezioni separate diverse con le pinzette. Poi li pick up dal bagno di acqua sui vetrini al microscopio (Figura 3D). Nota: Sezioni dovrebbero essere prelevati dalla parte posteriore del bagno d'acqua, come quelli del canale di sezioni e l'anteriore del bagno d'acqua non sarà ancora completamente spiegati.</li>
		<li>Asciugare i vetrini mettendoli in un forno di 42 ° C durante la notte. Le diapositive quindi possono essere conservate a temperatura ambiente a tempo indeterminato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare la colorazione ematossilina-eosina (HE) per motivi di valutazione del metodo migliorato8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+for+mapping+the+nervous+system.">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li><li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography.">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li><li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. 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(46), e2438 (2010).</li><li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis.">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).</li><li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies.">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification.">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796 (2017).</li><li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus.">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933 (2013).</li><li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD163:+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples.">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets.">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068 (2012).</li></ol>

Gli autori hanno un brevetto su questo dispositivo e non dichiarano interessi concorrenti.

Per migliorare la paraffina sezione morfologia e risolvere il problema del tempo sprecato durante il sezionamento di paraffina convenzionale, abbiamo creato una paraffina migliore metodo che combina taglio e dispiegarsi di sezionamento. Questo metodo migliorato si basa su semplici attrezzature che comprende un canale di sezione, un bagno di acqua e un riscaldatore con un interruttore di rilevazione di temperatura. La barra multifunzione sezione entra nel bagno d'acqua attraverso il canale di sezione e si svolge automaticamente durante il taglio. Di conseguenza, questo metodo migliora paraffina sezionamento qualità ed efficienza, che è stata verificata dalla divisione di paraffina di topo adulto ippocampo, reni di topo adulto, cervelli di topo E15.5 e adulti dello zebrafish.
Per evitare la sezione curling durante paraffina convenzionale di sezionamento, sono stati fatti molti aggiustamenti, come inumidire la superficie del tessuto, il raffreddamento del blocco di cera, aumentando l'umidità e combinando cryosectioning6,7, 8; Tuttavia, queste regolazioni rendono più noioso paraffina sezionamento. Un sistema di trasferimento di sezione commerciale che si basa sul fluido acqua ha avuto più successo. In questo sistema, la sezione contatti la superficie dell'acqua subito dopo il sezionamento e il flusso di acqua azionate da motori elettrici trasferisce le sezioni dal portalame per l'inferiore acqua calda bagno9. Grazie al suo meccanismo, elettricità statica non inibisce il sezionamento, con conseguente miglioramento della sezione della qualità. Inoltre, come questo sistema evita il trasferimento manuale di sezioni dal portalame a bagno d'acqua, facilmente danneggiare il fragile sezioni, aiuta anche nell'acquisizione di sezioni sottili di alta qualità.
Con il nostro metodo migliorato, l'attrezzatura semplice avvalendosi dell'esperienza del sistema di trasferimento sezione commerciale con alcuni vantaggi. In primo luogo, l'attrezzatura è più conveniente, che potrebbe diffondere questo metodo nei laboratori di sviluppo delle regioni e possono integrare il sistema di trasferimento di sezione commerciale. In secondo luogo, l'acqua nell'apparecchiatura è statico e non disturba mai le sezioni, che permette di acquisire sezioni più sottili. Abbiamo sezionato consecutivamente dello zebrafish di 2 µm spessore utilizzando il metodo migliorato, e le sezioni acquisite erano di qualità superiore. In terzo luogo, vasca di bagno d'acqua più grande viene utilizzato nelle apparecchiature, che consente almeno 40 sezioni per spiegare e galleggiare contemporaneamente, permettendo due operatori a cooperare. Una persona può tagliare il campione di tessuto continuamente e l'altro può pescare direttamente le sezioni. Questo riduce il tempo di attesa per le sezioni a svolgersi. Successivo taglio con un colpo di taglio uniforme migliora anche la qualità di sezione.
La struttura e l'aspetto della nostra attrezzatura semplice richiede un miglioramento. Ad esempio, i componenti, quali il potere, una stufa e un regolatore di temperatura, è integrabile per rendere questa apparecchiatura più integrante e portatile. Inoltre, commerciali microtomi rotativi hanno dimensioni diverse. Per connettersi a altri microtomi, l'angolo e l'altezza di questa apparecchiatura deve essere regolate. Paraffina sezionamento combinato con altre tecniche molecolari è ampiamente usato in neurobiologia, morfologia del tessuto ed altri ricerca campi11,12,13. Potenzialmente, questo metodo può migliorare ispezione clinica efficienza14,15 e altri campioni biologici oltre i tipi di tre tessuto utilizzati qui.

Lo studio morfologico è importante nella ricerca biologica. Anche se la nuova tecnologia ha permesso ai ricercatori di osservare loro obiettivi direttamente dall'intero tessuto o organismi1,2,3, l'esemplare di taglio in sezioni sottili, seguirono dalla macchiatura, rimane il primario morfologia del metodo solo tessuto, ma anche proteine targeting direttamente nel tessuto. La microscopia chiara utilizza tre tipi di sezione: paraffina, congelato e semifini. Sebbene cryosectioning è comune per proteggere l'antigenicità del tessuto e la preparazione del campione è semplice, la morfologia del tessuto mantenuto è scadente e non adatto per sottile taglio4,5. Sezionamento di paraffina è il metodo più frequentemente utilizzato per l'esposizione di morfologia ben conservato. Come gli esemplari sono completamente disidratati e incorporati in cera, i blocchi di paraffina possono essere conservati a tempo indeterminato. Inoltre, paraffina sezionamento produce sezioni sottili che migliorare l'accesso della sonda biologico in ulteriori esperimenti e riducono la sovrapposizione di strati di cella nella direzione Z.
Tuttavia, paraffina convenzionale di sezionamento è noioso e richiede abilità dell'operatore. Sezioni della paraffina subiscono fissazione, disidratazione, incastonatura, taglio e galleggianti. È importante trasferire nastri sezione dal portalama a bagno d'acqua è necessaria, ma difficile per operatori junior. Specialmente in aria asciutta, i nastri di sezione torcerà elettricità statica e sono difficili da spiegare sulla superficie dell'acqua calda. Per migliorare la sezione qualità, inumidire la superficie di tessuto esposto tra microtomo lama passate, i blocchi di cera di raffreddamento immergendole in acqua con ghiaccio, o alzando l'umidità con un umidificatore vicino il microtomo sono consigliate6,7 . I più nuovi metodi per migliorare la paraffina sezionamento includono ibrido inclusione in paraffina, cryosectioning8e sezione commerciale trasferimento sistema assistenza9. Sebbene questi metodi migliorano parzialmente paraffina sezionamento velocità e qualità, fanno di sezionamento molto più ingombrante, e sistemi di trasferimento di sezione commerciale sono costosi.
In questo protocollo, dimostriamo come creare attrezzature passo dopo passo, semplice, economico e flessibile che possono essere collegata per il supporto della lama di un microtomo rotativo. Questa apparecchiatura è composta da un canale di sezione, un bagno di acqua e un riscaldatore con un interruttore di rilevazione di temperatura. Dopo il taglio, decine di sezioni fluiscono nella scanalatura della sezione e inserire il bagnomaria direttamente, così sta svolgendo automaticamente. Questo migliora l'efficienza di taglio di paraffina e rende questa tecnologia più conveniente. Utilizzando questo metodo, più adulti sezioni di hippocampal di topo, sezioni di rene di topo adulto, embrionale 15,5 sezioni giorno-vecchio (E15.5) del mouse del cervello e occhio di zebrafish adulto sezioni sono state raccolte in meno tempo e morfologicamente più intatto. Questo metodo può essere utilizzato anche per altri campioni di tessuto che richiedono paraffina accelerata di sezionamento, evitando perdita di distinzione di sezione.

<table><tbody><tr><td>Incubator</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Heated Paraffin Embedding Module</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Commercial acrylic board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloromethane</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>Tubular electric heating element(12 V 200 W)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controller(12 V 120 W)</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>Rotary microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutral silicone sealant</td><td></td><td></td><td>Link the water channel with the microtome knife holder</td></tr><tr><td>Voltage transformer</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>Disposable blade</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Baso Diagnostics Inc.</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>Microslide</td><td>Sail Brand</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>Neutral balsam</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Lid</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip&amp;nbsp;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Xilong Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for paraffin sections</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&amp;nbsp;- Cold Plate</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>paraffin repellent spray&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

the cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning

Sezionamento del tessuto paraffina-incastonato è ampiamente usato in istologia e patologia. Tuttavia, è noioso. Per migliorare questo metodo, diverse aziende commerciali hanno messo a punto sistemi di trasferimento di sezione complessa utilizzando acqua liquida. Per semplificare questa tecnologia, abbiamo creato un semplice metodo utilizzando attrezzature fatte in casa che combina taglio e galleggianti all'interno di una semplice camera termostatica; Pertanto, le sezioni immettere automaticamente il bagno d'acqua sulla superficie dell'acqua. L'ippocampo da cervelli di topo adulto, reni di topo adulto, cervelli embrionali del mouse e dello zebrafish adulto sono stati tagliati utilizzando paraffina convenzionale di sezionamento e il metodo proposto per il confronto. Analisi statistica dimostra che il nostro metodo migliorato salvato tempo e sezioni più alte qualità di prodotto. Inoltre, paraffina sezionamento di un esemplare intero in breve tempo è facile per gli operatori junior.

Il metodo migliorato ha aumentato il numero delle sezioni di paraffina intatto. Abbiamo testato questo metodo nuovo su tessuto ippocampale topo adulto, reni di topo adulto, cervelli embrionali del mouse e dello zebrafish. Acqua è stato aggiunto al serbatoio, e la temperatura dell'acqua è stata mantenuta tra 38,0 ° C a 40,0 ° C. Dopo una preparazione in serie i campioni di tessuto, sono stati sezionati e rispetto alla divisione convenzionale. Il nuovo metodo di evitata perdita di sezione e hanno aumentato la quota delle sezioni intatte nell'ippocampo di topo adulto, reni di topo adulto, cervelli di topo E15.5 e adulti dello zebrafish (Figura 4A4C, 4E, 4G). In conclusione, il nostro metodo migliorato il sezionamento di prevenire la perdita di sezione e la raccolta di sezioni più intatti per campione.
Il metodo migliore è diminuito il tempo trascorso per campione. Confrontando il tempo impiegato tra il metodo convenzionale e migliorato il nostro metodo, abbiamo effettuato tutta la serie di sezionamento (dalla prima sezione per l'ultimo tratto di un organo) il topo adulto ippocampo, reni di topo adulto, cervelli di topo E15.5 e adulto occhi di zebrafish. I risultati indicano che il metodo migliorato accelerato la paraffina sezionamento velocità in tutti i campioni testati (Figura 4B4D, 4F, 4 H). In generale, il nostro metodo consentito per il sezionamento di paraffina di alta qualità più velocemente.
Sezioni di serie della retina ottica zebrafish è stata osservata macchiando H ed E. Per il taglio di serie del segmento disco ottico della retina zebrafish, erano meglio le sezioni raccolte dal metodo migliorato ha migliore integrità rispetto a quelli dalla paraffina convenzionale (Figura 5A, 5B) metodo a sezione ottica. Non c'era differenza significativa tra questi due metodi per quanto riguarda la qualità delle sezioni più raccolti (Figura 5, 5D). In alcuni casi, la qualità delle sezioni raccolte dal metodo convenzionale erano relativamente basso (Figura 5E, 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig1.jpg"> Figura 1: il processo per l'assemblaggio i 7 pannelli acrilici commerciale in un serbatoio. (A) vista d'insieme delle 7 tavole acriliche. (B-G) Montaggio graduale del serbatoio dal Consiglio n. 1 a bordo #7. (H) serbatoio primario dopo l'assemblaggio. (I) dimensioni del serbatoio generale; la membrana di protezione sulla superficie del serbatoio è stato rimosso per una installazione successiva. L = 400 mm, L' = 220 mm, H = 122 mm, L = 200 mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig1large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig2.jpg"> Figura 2: le attrezzature opportunamente assemblata pronta per l'uso. Attrezzature (A) l'intatta dopo essere stata collegata per il microtomo rotativo. Indicazione di freccia, il rilevatore di temperatura è installato attraverso il piccolo foro di trapano elettrico. Testa di freccia, il riscaldatore (elemento riscaldante elettrico tubolare) viene installato attraverso il foro nel Consiglio #1. (B) l'area tratteggiata amplificato in una, la caratteristica della connessione tra il supporto della lama del microtomo e il canale di sezioni. Arrow head, il portalama e canale sezioni sono collegate da sigillante siliconico neutro. (C) stesso di B, con l'acqua versata e lama installata. (D) vista laterale della zona tratteggiata in testa della freccia C., la superficie dell'acqua è vicino al bordo della lama. VT: trasformatore di tensione; WB: bagno di acqua; DT: termostato digitale; B: lama; BH: portalama; SC: canale sezioni. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig3.jpg"> Figura 3: la paraffina migliorata processo di sezionamento. Le figure che si trova nell'angolo sinistro inferiore sono rispettivamente le aree tratteggiate amplificate in A-D. Indicazioni della freccia, la prima sezione. (A, A') La sezione entra nel canale sezioni immediatamente e direttamente dopo taglio. (B, B') Il nastro di sezioni attraversa il confine tra la vasca di acqua e canale di sezioni. (C, C') Le sezioni del galleggiante per la parte posteriore del bagno d'acqua e sono completamente spiegate. (D, D') Le sezioni sono prelevate dal vetrino da microscopio quando raggiungono la parte posteriore del bagno d'acqua e sono completamente spiegati. SC: canale sezioni; WB, bagno d'acqua. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig4.jpg"> Figura 4: il metodo di taglio migliorato migliorato il tasso di efficienza e rendimento significativamente per tutta la serie sezioni. Il tasso di rendimento uguagliato la proporzione delle sezioni intatte in tutte le sezioni di taglio. I dati sono mostrati come la media ± SEM e acquistati dallo stesso operatore. (A, C, E, G) Il metodo migliorato ha impedito la perdita di sezione dell'ippocampo topo adulto (91.04 ± 1.429% N = 3, vs 97,63 ± 0.4864% N = 3, p = 0.0120), adulto del mouse reni (92.30 ± 0.5689% N = 3, vs 95.99 ± 0.7055% N = 3, p = 0.0153), cervello di topo E15.5 (90,67 ± 1.549%, N = 3 vs 97.01 ± 0.2816%, N = 3, p = 0.0158) e adulti dello zebrafish (91.27 ± 0.9734% N = 4 vs 96.32 ± 0.7217% N = 4, p = 0,0059). (B, D, F, H) Il metodo migliorato salvato tempo confrontato con il metodo convenzionale per l'ippocampo di topo adulto (126.0 3,606 min vs 79,67 ± 1,856 min, N = 3, p = 0,0003), adulto del mouse reni (66.67 1,764 min vs 41.33 ± 2,186 min, N = 3, p = 0,0008), E15.5 del mouse br Ain (99.67 3,480 min vs 52,33 ± 4,333 min, N = 3, p = 0,0010) e adulti dello zebrafish (48.00 2,160 min vs 30,75 ± 1,797 min, N = 4, p = 0,0009). * P < 0,05, * * P < 0.01, * * * P < 0,005. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58288/58288fig5.jpg"> Figura 5: H ed E colorazione delle sezioni tutta la serie del segmento disco ottico di zebrafish occhi acquisito dai metodi convenzionali e migliorato paraffina sezionamento dallo stesso operatore vengono confrontati. (A) paraffina convenzionale sezionamento (21 sezioni). (B) migliorata di paraffina sezionamento (24 sezioni). (C) area tratteggiata della A6. (D) area tratteggiata di B7. (E) area tratteggiata di A17. (F) area tratteggiata di B19. Asterischi, le sezioni con relativamente scarsa qualità. Punte di freccia, disco ottico; Frecce, grave lacerazione del tessuto retinico. Barra della scala = 200 µm (A e B); Barra della scala = 50 µm (C, D, E, F). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/58288fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Complementare figura 1: I parametri di dimensione delle 7 schede commerciali acriliche. Il numero rappresenta la lunghezza del corrispondente margine di bordo. Unità: mm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58288/supplementary_figure.AI">per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Il taglio e il metodo di galleggiamento per tessuto paraffina-incastonato per il sezionamento

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la paraffina sezionamento. Questo metodo combina taglio e mobile utilizzando una semplice camera termostatica per evitare il processo di trasferimento richiesto secondo il metodo convenzionale. Di conseguenza, l'efficienza e il numero di sezioni della paraffina intatti furono notevolmente migliorate.

Sectioning of the paraffin-embedded tissue is widely used in histology and pathology. However, it is tedious. To improve this method, several commercial ...

the-cutting-floating-method-for-paraffin-embedded-tissue-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.3K Views.  Nanchang University. Qui, presentiamo un protocollo per migliorare la paraffina sezionamento. Questo metodo combina taglio e mobile utilizzando una semplice camera termostatica per evitare il processo di trasferimento richiesto secondo il metodo convenzionale. Di conseguenza, l'efficienza e il numero di sezioni della paraffina intatti furono notevolmente migliorate.

Video: The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Sezionamento sottile fetta di preparativi per immunoistochimica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Ricerca

Biologia

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its excellent preservation of morphology. Personalized medicine increasingly provides individually adapted and targeted therapies for characterized individual diseases enabled by combined morphological and molecular analytical technologies and diagnostics. Performance of morphologic and molecular assays from the same FFPE specimen is challenging because of the negative impact of formalin due to chemical modification and cross-linking of nucleic acids and proteins. A non-cross-linking, formalin-free tissue fixative has been recently developed to fulfil both requirements, i.e., to preserve morphology like FFPE and biomolecules like cryo-preservation. Since FISH is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics, we tested the applicability of FISH protocols on tissues treated with this new fixative. We found that formalin post-fixation of histological sections of non-cross-linking, formalin-free and paraffin-embedded (NCFPE) breast cancer tissue generated equivalent results to those with FFPE tissue in human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) FISH analysis. This protocol describes how a FISH assay originally developed and validated for FFPE tissue can be used for NCFPE tissues by a simple post-fixation step of histological sections.

Fluorescence in-situ hybridization (FISH) is often required in combination with histopathology and molecular diagnostics for selection of therapy in personalized medicine. A novel non-cross-linking, formalin-free tissue fixative that allows high quality morphologic, molecular and FISH analyses from the same specimen by addition of a post-fixation step before FISH is presented.

Protocollo per HER2 pescare con un fissativo tessuto-cross-linking, privo di formalina per combinare i vantaggi di crioconservazione e fissazione in formalina

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

Ricerca sul cancro

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Immunologia e infezioni

Transplantation Into the Mouse Ovarian Fat Pad

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic transplantation of ovarian surface and tubal epithelia include intraperitoneal and intrabursal administration of cells. The respective limitations of these methods include poorly defined location of injected cells and limited space volume. Furthermore, they are poorly suited for long-term structural preservation of transplanted organs. To address these challenges, we have developed an alternative approach, which is based on the introduction of cells and tissue fragments into the mouse fat pad. The mouse ovarian fat pad is located in the immediate vicinity of the ovary and uterine tube (aka oviduct, fallopian tube), and provides a familiar microenvironment for cells and tissues of these organs. In our approach fluorescence-labeled mouse and human cells, and fragments of the uterine tube are engrafted by using minimally traumatic dorsal incision surgery. Transplanted cells and their outgrowths are easily located in the ovarian fat pad for over 40 days. Long-term transplantation of the entire uterine tube allows correct preservation of all principle tissue components, and does not result in adverse side effects, such as fibrosis and inflammation. Our approach should be uniquely applicable for answering important biological questions such as differentiation, regenerative and neoplastic potential of specific cell populations. Furthermore, it should be suitable for studies of microenvironmental factors in normal development and cancer.

We describe an ovarian fad pad transplantation assay suitable for studies of normal and transformed epithelia of the female reproductive tract. The mouse fat pad allows transplantation of large tissue fragments, is easily accessible for surgery and imaging, and provides the most favorable native environment for tissues of M&#252;llerian origin.

Trapianto nel Mouse Pad ovarico Fat

Orthotopic transplantation assays in mice are invaluable for studies of cell regeneration and neoplastic transformation. Common approaches for orthotopic ...

Medicina

Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the multicellular interactions of native tissue. Tissue&#160;slices immediately cut from freshly resected tumors preserve spatial aspects of intratumor heterogeneity (ITH), thus making them useful surrogates of in vivo biology. Careful optimization of tissue slice preparation and cultivation conditions is fundamental for the predictive diagnostic potential of tumor slice explants. In this regard, murine models are valuable, as these provide a consistent flow of tumor material to perform replicate and reproducible experiments. This protocol describes the culturing of murine lung tumor-derived tissue slices using a rotating incubation unit, a system that enables intermittent exposure of tissues to oxygen and nutrients. Our previous work showed that the use of rotating incubation units improves the viability of tissue compared to other culture methods, particularly floating slices and stagnant filter supports. Here, we further show that slice thickness influences the viability of cultured slices, suggesting that optimization of slice thickness should be done for different tissue types. Pronounced ITH in relevant oncogenic functions, such as signaling activities, stromal cell infiltration or expression of differentiation markers, necessitates evaluation of adjacent tissue slices for the expression of markers altered by drug treatment or cultivation itself. In summary, this protocol describes the generation of murine lung tumor slices and their culture on a rotating incubation unit and demonstrates how slices should be systematically analyzed for the expression of heterogeneous tissue markers, as a prerequisite prior to drug response studies.

We provide a method for the generation, cultivation and systematic analysis of organotypic slices derived from murine lung tumors. We also describe how to optimize for slice thickness, and how to select drug concentrations to treat tumor slices.

Valutazioni e analisi di tumore fetta espianti come prerequisito per la prova diagnostica

Organotypic primary tissue explant cultures, which include precision-cut slices, represent the three-dimensional (3-D) tissue architecture as well as the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some plant cells have rigid cell walls, tough fibers and crystals (calcium oxalate, silica, etc.), and high water content that often disrupt tissue integrity during plant tissue sectioning.
This study establishes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method. This protocol modifies a paraffin-based sectioning technique and improves the integrity of tissue sections from different plants. Plant tissues were embedded in paraffin before sectioning in a cryostat at -16 &#176;C. Sectioning under low temperature hardened the paraffin blocks, reduced tearing and scratching, and improved tissue integrity significantly. This protocol was successfully applied to calcium oxalate-rich Phalaenopsis orchid tissues as well as recalcitrant tissues such as reproductive organs and leaves of rice, maize, and wheat. In addition, the high quality of tissue sections from Hybrid-Cut could be used in combination with in situ hybridization (ISH) to provide spatial expression patterns of genes of interest. In conclusion, this protocol is particularly useful for recalcitrant plant tissue containing high crystal or silica content. Good quality tissue sections enable morphological and other biological studies.

This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).

Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modello murino di endometrio sottile ottimizzato con bassa mortalità e aderenze minime

Establishing a Mouse Model of Thin Endometrium

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory treatment options are still urgently needed. Several animal models of TE have been developed, but the mouse model involving abdominal surgery and injection of 95% ethanol presents a formidable challenge due to the high mortality rate and risk of intrauterine adhesions if not performed correctly. Here, we describe a detailed protocol that produces reliable and reproducible TE with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus with varying infusion times. The results showed that all of the mice successfully developed TE with infusion times ranging from 1-3 min, characterized by a typical reduction in endometrial thickness and the number of glands, as well as excessive endometrial fibrosis. These findings suggest that this mouse model is suitable for studying thin endometrium and can serve as a platform for developing future TE treatments.

<meta charset="utf8"></head><body>Stabilire un modello murino di endometrio sottile

This article describes a detailed protocol for producing a reliable and reproducible thin endometrium with a very low mortality rate and minimal intrauterine adhesions by injecting 95% ethanol into the mouse uterus within 1-3 min.

Stabilire un modello murino di endometrio sottile

Thin endometrium (TE) has been widely recognized as a critical cause of infertility. However, the pathogenesis of TE remains unclear, and satisfactory ...

Il taglio e il metodo di galleggiamento per tessuto paraffina-incastonato per il sezionamento

Riepilogo

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Sezionamento sottile fetta di preparativi per immunoistochimica

Protocollo per HER2 pescare con un fissativo tessuto-cross-linking, privo di formalina per combinare i vantaggi di crioconservazione e fissazione in formalina

Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

Trapianto nel Mouse Pad ovarico Fat

Valutazioni e analisi di tumore fetta espianti come prerequisito per la prova diagnostica

Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Stabilire un modello murino di endometrio sottile

Stabilire un modello murino di endometrio sottile

Stabilire un modello murino di endometrio sottile