Il progetto descritto è stato sostenuto dalla Uniformed Services University Health Sciences a JJM. Le opinioni o le affermazioni contenute nel presente documento sono quelle private degli autori e non sono per essere interpretato come ufficiale o riflettenti le viste del dipartimento della difesa, la Uniformed Services University Health Sciences o qualsiasi altra agenzia degli Stati Uniti Governo.
WGV eseguito tutti gli esperimenti e analizzato i dati; JJM progettato e supervisionato lo studio; WGW e JJM ha scritto il libro.

I campioni di siero utilizzati per illustrare il protocollo descritto qui sono stati ottenuti da macaques del reso che erano alloggiate e curate secondo locale, statale e federale politiche in un'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care Internazionale (AAALAC)-accreditato facility. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionali e i campioni sono stati acquisiti attraverso un protocollo di condivisione di tessuto.
1. giorno 1
Nota: Eseguire tutti i passaggi descritti di seguito in una flusso laminare sterile biosicurezza usata per coltura tissutale in un laboratorio BSL-2.
<ol><li>Scongelare i campioni di siero a temperatura ambiente e trasferire 100 µ l di ciascun campione di siero in una provetta sterile. Inattivare con il calore a 56° C in un bagno d'acqua o un thermomixer regolabile in temperatura per 30 minuti. Effettuare diluizioni seriali 10 volte campione di siero che vanno da 1:1 a 1:1,000 utilizzando freddo RPMI-10 (RPMI con 10% siero bovino fetale).</li>
	<li>Trasferire 10 µ l di campione di siero diluito serialmente in ciascun pozzetto di una piastra di fondo V 96 pozzetti sterile. Sono due serie di pozzetti di controllo, RPMI-10 con RVP solo e senza campione di siero e RPMI-10 solo senza RVP e senza campione di siero. Impostare ogni campione di siero e RPMI-10 controlli in triplici copie.</li>
	<li>Rimuovere il Dengue-1, 2, 3 e 4 RVP da-80 ° C e scongelare loro in bagnomaria a 37 ° C. Trasferire il RVP scongelati immediatamente in ghiaccio. Ottenere RVP circa 170 µ l per ogni campione di siero (10 µ l di RVP x 3 pozzi per ogni diluizione del siero (1:1, 01:10, 1: 100, 1:1, 000) e 10 µ l di RVP x 3 pozzi per ognuna delle RPMI-10 con RVP solo controllo pozzi).</li>
	<li>Pipettare 10 µ l di RVP in ciascun bene la piastra di fondo V 96 pozzetti contenenti il campione di siero e RPMI-10 con pozzetti di controllo RVP (nessun siero). Non aggiungere RVP RPMI-10 solo (nessun campione di siero e nessun RVP) pozzi. Mix accuratamente pipettando su e giù 5 – 10 volte. Aggiungere 10 µ l freddo RPMI-10 al posto di RVP per ogni freddo RPMI-10 soltanto pozzetti di controllo (nessun campione di siero e nessun RVP).</li>
	<li>Trasferire la piastra di fondo V 96 pozzetti per un'incubatrice e incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C in presenza di 5% CO2. Mentre la piastra a 96 pozzetti fondo V è in incubazione, pulire la superficie della cappa di biosicurezza con etanolo al 70% ed eseguire la luce UV per 15 min.</li>
	<li>Rimuovere un pallone T75 completamente confluente di cellule K562 dall'incubatrice, mescolare le celle anche utilizzando una pipetta sterile 5 mL e trasferire 5 mL di cellule in una provetta conica sterile 15 mL. Nota: Le cellule K562 sono mantenute in RPMI-10 e una subcoltura a 1 x 106/ml.</li>
	<li>Contare il numero di cellule rimuovendo 10 celle µ l dalla provetta conica sterile 15 mL e mescolare con il blu di tryphan 10 µ l. Contare le celle utilizzando un emocitometro per determinare il numero totale di cellule nella provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare il 15 mL conica con cellule a ~ 1.200 x g per 10 minuti, decantare il supernatante e risospendere le cellule in caldo RPMI-10 ad una concentrazione di 80.000 cellule/30 µ l di media (2,66 x 106 cellule/ml).</li>
	<li>Rimuovere la piastra a 96 pozzetti fondo V dall'incubatrice (passo 1.6), trasferire 30 µ l di cellule K562 in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti fondo V e mescolare accuratamente pipettando su e giù 5 – 10 volte. Trasferire la piastra di fondo V 96 pozzetti per un'incubatrice e incubare la piastra per 1 ora a 37 ° C in presenza di 5% CO2.</li>
	<li>Dopo incubazione per 1 h, è necessario rimuovere la piastra a 96 pozzetti fondo V dall'incubatore e centrifugare a ~ 1.200 x g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, decantare i media dai pozzetti ruotando la piastra capovolta in un contenitore contenente candeggina al 10%.</li>
	<li>Lavare le cellule in ogni pozzetto da loro risospendere in 125 µ l di RPMI-10 caldo, mescolare accuratamente con una pipetta e centrifugare la piastra a ~ 1.200 x g per 5 min, decantare i media girando la piastra capovolta in un contenitore contenente candeggina al 10%. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.</li>
	<li>Dopo il lavaggio, aggiungere 100 µ l di caldo RPMI-10 a ciascuno mescolare bene, su e giù con la pipetta e incubare la piastra per 48 h a 37 ° C in presenza di 5% CO2.</li>
</ol>2. giorno 3
<ol><li>Rimuovere la piastra di fondo V 96 pozzetti contenenti 100 µ l di cellule e media/pozzetto dall'incubatrice e spostarlo in una cappa di biosicurezza. Usando una pipetta multicanale, miscela il contenuto di ogni bene e trasferire le cellule e media per un fondo U ben 96 piastra o per pre-etichettata provette in polipropilene da 5 mL.</li>
	<li>Sciacquare ciascun pozzetto della piastra di fondo V 96 pozzetti con 100 µ l di 1% paraformaldeide (PFA) 1 x Phosphate Buffered Saline (PBS) e trasferimento ai rispettivi pozzetti in 96 ben U-fondo piatto o tubi in polipropilene da 5 mL con etichetta dal passaggio 2.1 per produrre una finale concentrazione dello 0,5% PFA/pozzetto o tubo. Mescolare accuratamente usando una pipetta multicanale, coprire la piastra con un foglio di alluminio e lasciarlo riposare nell'incubatrice per 30 minuti per fissare le cellule.</li>
	<li>Preparare il citometro a flusso (Vedi ad esempio la Tabella materiali ) eseguendo le cellule K562 non macchiate per calibrare il lato e forward scatter insieme alle impostazioni di fluorescenza. Il canale di fluorescenza solo richiesto è FL1, come GFP è l'unica fluorescenza emessa dalle cellule. Acquisire ~ 30, 000 – 50.000 cellule da ciascun campione. Nota: Qualsiasi cytometer di flusso in grado di leggere una singola fluorescenza può essere utilizzato per l'acquisizione dei dati, come le cellule infettate con RVP solo emette fluorescenza verde per la presenza di GFP, e nessun altro canale di fluorescenza sono necessari.</li>
</ol>3. analisi dei dati
<ol><li>
Analizzare i dati acquisiti sul citofluorimetro utilizzando qualsiasi software di analisi di citometria a flusso (Vedi tabella materiali).
	<ol>
<li>Insieme al primo cancello basato su FSC-A (forward scatter – zona) vs FSC-H (forward scatter – altezza) per includere singole cellule ed escludere auto-fluorescente doppietti da analisi12. Quindi, cancello singoletto-gated celle basate su SSC-A (dispersione laterale – zona) vs FSC-A per escludere eventuali detriti autofluorescenti.</li>
		<li>Analizzare vs SSC-A cellule gated FSC-A per l'espressione della GFP basato su vs SSC-A GFP-A. Determinare la percentuale di cellule GFP + per ogni diluizione dei campioni del siero e controllo impostando un cancello intorno cellule GFP +.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare la percentuale media di cellule GFP + per ogni diluizione del campione di siero e pozzetti di controllo dividendo la percentuale totale di cellule GFP + nei pozzetti triplicate per 3.</li>
	<li>Piega-potenziamento dell'infezione viene calcolato dividendo la percentuale media di cellule GFP + nei campioni del siero per ogni diluizione diviso per la percentuale media di cellule GFP + in RPMI-10 con pozzetti di controllo RVP (nessun campione di siero).</li>
	<li>Piega-valorizzazione (asse y) del grafico contro diluizione (asse x) ed effettuare analisi statistiche, facendo uso di ANOVA seguito dal test post-hoc di Tukey per i confronti multipli.</li>
</ol>

<ol>
	<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques.">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity,+cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes.">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).</li><li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562.">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li><li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+K562+cell+line,+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia.">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li><li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever.">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li><li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection.">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li><li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity.">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li><li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans.">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li><li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro.">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li><li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies.">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive,+memory-derived+plasmablasts.">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus.">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Flavivirus come DENV e ZIKV condividere testimonianze significative di omologia in entrambe le loro proteine strutturali e non strutturali che generano gli anticorpi che cross-reagiscono con a vicenda13,14. Queste risposte di anticorpi cross-reattivi sono state indicate per migliorare di infezione sia in vivo che in vitro con un sierotipo eterologo o altro relativi flavivirus1,2. Il potenziale di croce migliorare infezione ha implicazioni significative per la gestione della malattia e anche per lo sviluppo di vaccini.
Saggi di cultura tradizionale basato utilizzano celle non permissivi che sono infettate con infettive DENV live in presenza del siero. Potenziamento dell'infezione è misurata quantificando la quantità di virus nel surnatante mediante placca standard saggi11. Questo test richiede cultura del virus in due linee cellulari e significativamente lunghi periodi di tempo per eseguire. Inoltre, non tutti la DENV sierotipi placca allo stesso modo, aggiungendo un ulteriore livello di complessità di queste analisi.
Altri saggi hanno modificato il protocollo di dosaggio di placca basata per misurare l'infezione delle linee cellulari combinando colorazione intracellulare per DENV usando gli anticorpi fluorescente contrassegnati e flusso cytometry9,10,14. Anche se questo riduce il tempo necessario per determinare il livello di infezione rispetto alla placca di base di analisi ci sono un numero di passaggi di ottimizzazione necessari per queste analisi di lavorare costantemente. Protocolli di colorazione intracellulari sono richiede tempo, in quanto richiedono di fissaggio e permeabilizing delle cellule seguita da colorazione intracellulare e richiedono ben titolato DENV gli anticorpi specifici che possono chiaramente distinguere ciascun sierotipo. Inoltre, queste analisi non sono facilmente trattabili in un formato di throughput elevato e soffrono di alti livelli di variabilità intra-saggio.
In contrasto con i dosaggi descritti sopra, il dosaggio di DENV RVP base è facile da configurare, non utilizza virus contagioso ed è altamente suscettibile di throughput elevato che può essere facilmente utilizzato per misurare il potenziale del siero per migliorare l'infezione. Inoltre, questo test non è come lavoro intensivo come altri dosaggi e può essere completato entro 2-3 giorni, che offre un vantaggio importante sopra attuali protocolli di analisi di ADE. Anche se il test descritto nel manoscritto ha esaminato la capacità del siero ZIKV infettata per migliorare infezione DENV-1, 2, 3 e 4 sierotipi, il dosaggio può essere facilmente adattato per esaminare il siero da entrambi sperimentale e campioni clinici ottenuti dagli altri infezioni da flavivirus come virus della febbre gialla (YFV), virus dell'encefalite equina giapponese (JEEV) e virus del Nilo occidentale (WNV) se RVP sono disponibili e con altre linee cellulari. È, tuttavia, fondamentale per ottimizzare il dosaggio di titolazione il volume di RVP, numero di cellule per pozzetto e la durata dell'incubazione per consentire la marcatura ottimale delle cellule senza colorazione di fondo.
Titolazioni devono essere eseguite incubando un numero definito di cellule bersaglio (ad esempio cellule K562 80.000 o una linea cellulare in fase di test) con volumi variabili di RVP (ad esempio, 2,5 µ l, 5 µ l, 7,5 µ l, 10 µ l, 20 µ l, ecc.). Una volta ottenuto il titolo corretto per ogni RVP, la durata di incubazione può essere determinata utilizzando il titolo ottenuto insieme al numero definito di cellule e incubarle come descritto nel protocollo per periodi variabili di tempo (ad esempio, 24h, 48h h 72, ecc.).
Abbiamo osservato ADE di infezione di 4 tutti i sierotipi di DENV a una diluizione di 01:10, suggerendo che un livelli di anticorpi nel siero dovevano essere diluito 10 volte per rilevare la valorizzazione dell'infezione. D'altra parte, altri studi hanno riferito miglioramento alle diluizioni inferiori, che indicano che le concentrazioni di anticorpi nel campione del siero erano probabilmente troppo alta, che necessitano di diluizioni inferiori per rilevare ADE in vitro. Come ADE dipende la giusta concentrazione di anticorpi nel campione del siero, maggior parte dei campioni sono probabile mostrare ADE a diluizioni inferiori il siero non diluito.
In conclusione, il protocollo descritto in questo manoscritto è semplice e facile da adottare e permette per la scalabilità per attivare screening ad alta resa di un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo periodo di produrre dati di alta qualità che possono essere facilmente analizzati e interpretato.

Anticorpo dipendente miglioramento (ADE) dell'infezione è un processo per cui le risposte parzialmente traversa-reattivo anticorpo indotte da un sierotipo del virus migliora l'assorbimento di un altro sierotipo del virus, che conduce la viremia e replicazione virale aumentata. ADE è stato ampiamente documentato nelle infezioni di Dengue virus (DENV) dove quattro principali sierotipi sono prevalenti. In un sottogruppo di pazienti, ADE è associata con febbre emorragica Dengue (DHF). Abbiamo recentemente dimostrato che l'infezione del virus (ZIKV) di Zika indotto significativamente elevati livelli di risposte di anticorpi cross-reattivi DENV causato ADE di DENV in vitro , che probabilmente ha contribuito alla valorizzazione di DENV viremia in vivo1 , 2. analisi dell'anticorpo dipendente di potenziamento sono uno strumento prezioso per valutare la capacità degli anticorpi per migliorare secondario infezione con virus collegati e offrire preziose comprensioni nella patogenesi delle infezioni da flavivirus e informare il sviluppo di vaccini.
Il test descritto qui usa DENV RVP insieme con le cellule K562 che sono normalmente inammissibile all'infezione. RVP sono strutturalmente intatto replica incompetente DENV particelle virali che codificano un replicone sub-genomica della proteina fluorescente verde (GFP) che è espresso dopo un singolo ciclo di replica3. Come tale, le cellule che infettano con RVP reagiscono in verde e possono essere facilmente individuate mediante citometria a flusso o microscopia. La RVP usato per questo test sono stati ottenuti da fonti commerciali. Tuttavia, possono essere generati contro altri virus e usato per il test descritto in questo manoscritto. Nel frattempo, le cellule K562 sono un'espressione FcγIII-linea cellulare di leucemia che si legano alla regione Fc degli anticorpi e infettarsi in presenza di Sub-neutralizzare le concentrazioni di anticorpi4,5.
Saggi di ADE sono stati ampiamente utilizzati negli studi che studiano i fattori di rischio per grave dengue e di delineare i meccanismi di in vitro ADE6,7,8. Il dosaggio di ADE descritto qui può essere rapidamente e facilmente utilizzato per determinare la capacità del siero per migliorare l'infezione in vitro utilizzando RVP e flusso cytometry, rispetto ad altri dosaggi utilizzati attualmente, che richiedono sia la determinazione della placca formando unità (pfu) in cellule Vero o macchiatura dell'anticorpo di infetti cellule6,7,8,9,10,11, entrambi i quali sono in termini di tempo e manodopera intensivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="794">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DENV 1-4 RVP</td>
			<td style="width:139px;">Integral Molecular</td>
			<td style="width:119px;">RVP-501</td>
			<td style="width:323px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">K562 cells</td>
			<td style="width:139px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">FBS</td>
			<td style="width:139px;">GE lifesceinces</td>
			<td style="width:119px;">SH 30910.03</td>
			<td>10% FBS in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">1670049</td>
			<td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:139px;">Cellegro</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td>0.025M in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7145</td>
			<td>1x in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:139px;">Cellegro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-Cl</td>
			<td>1mM in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005CI&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sterile V-bottom plates</td>
			<td style="width:139px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">333-8001-01V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Non-sterile U-bottom plates</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">Ref 353910</td>
			<td>A high throughput alternative to FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">5mL, sterile, serological pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200uL sterile pipette tips</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3020 CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20uL sterile pipette tips</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50-200uL multichannel pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3975-8-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">5-50uL multichannel pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3975-9-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20% formadehyde</td>
			<td style="width:139px;">Tousimis</td>
			<td style="width:119px;">&#160;#1008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water Bath</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">TSCOL35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">thermomixer</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000387</td>
			<td>An alternative to a waterbath for heat inactivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Liquid Bleach</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9724348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Flowjo 9.8</td>
			<td style="width:139px;">TreeStar, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACSDiva 6.1.2</td>
			<td style="width:139px;">Becton Dikinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">BD LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:139px;">Becton Dikinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Liquid Bleach</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9724348</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum

Il potenziamento dipendente dell'anticorpo dell'infezione ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella patogenesi virale Dengue. Tradizionale analisi che misurano la capacità di anticorpi o siero per migliorare infezione nelle linee cellulari impermissible hanno fatto affidamento sull'utilizzo uscita virale nei media seguiti da saggi di placca per quantificare l'infezione. Più recentemente, queste analisi hanno esaminato l'infezione di febbre rompiossa virus (DENV) nelle linee cellulari usando gli anticorpi fluorescente contrassegnati. Entrambi questi approcci presentano limitazioni che limitano l'uso molto diffuso di queste tecniche. Qui, descriviamo un'analisi semplice in vitro usando Dengue virus reporter particelle virali (RVP) che esprimono la proteina fluorescente verde e le cellule K562 per esaminare potenziamento dipendente dell'anticorpo (ADE) dell'infezione di DENV usando il siero che è stato ottenuto da rhesus macachi 16 settimane dopo l'infezione con il virus di Zika (ZIKV). Questa tecnica è affidabile, comporta la minima manipolazione delle cellule, non implicano l'uso di virus competente replica dal vivo e può essere eseguita in un formato di throughput elevato per ottenere una lettura quantitativa mediante citometria a flusso. Inoltre, questo test può essere facilmente adattato per esaminare aumento dipendente dell'anticorpo (ADE) di altre infezioni da flavivirus come il virus della febbre gialla (YFV), virus dell'encefalite equina giapponese (JEEV), virus del Nilo occidentale (WNV) ecc dove RVP sono disponibili. La facilità di configurazione di test, analisi dei dati e interpretazione dei risultati rende altamente favorevole alla maggior parte delle impostazioni di laboratorio.

I sieri da 4 rhesus macaques erano raccolti a 16 settimane dopo l'infezione con ZIKV e testato per il loro potenziale migliorare DENV-1, 2, 3 e 4 infezione in cellule K562. Gli animali hanno avuti viremia di picco di ~ 1 x 105 copie di ZIKV RNA/mL di plasma dal giorno 3 dopo infezione che è sceso a livelli che erano sotto il limite di rilevazione di 7 giorni dopo l'infezione. No la viremia è stata rilevata nel plasma post-all'infezione 16 settimane. L'analisi RVP è stata eseguita, quindi i dati raccolti sono stati analizzati, come descritto nel protocollo di cui sopra.
La strategia di gating utilizzata per identificare le cellule GFP + sono mostrati nella Figura 1. La porta iniziale è stata impostata su autofluorescent doppietti di escludere e includere solo singole celle basate su FSC-A vs FSC-H. Il grafico successivo Mostra solo le celle dalla porta singola cella; lì, un cancello è stato disegnato sulla base SSC-A vs FSC-A per escludere eventuali detriti autofluorescenti. Questi gated cellule allora sono state visualizzate in una terza trama basata su SSC-A vs FL1-A identificare cellule GFP +. Le cellule infettate con RVP esprimono GFP e la percentuale di cellule GFP + è stata determinata impostando un cancello intorno a queste cellule. Circa il 12,2% di cellule GFP + sono rilevabili nel campione del siero infetto ZIKV, rispetto a nessun cellule GFP + del campione di controllo. Questa strategia di gating è seguita per ogni campione di siero diluizione e controllo incluso nell'analisi.
La percentuale di cellule GFP + è stata determinata per ogni diluizione del campione e il campione di controllo come descritto in precedenza (Figura 1). Dati da un animale rappresentativo utilizzando RVP DENV-1 sono mostrati in Figura 2. Rispetto a nessun campione del siero controllo che aveva cellule GFP + 0.253%, la percentuale di cellule GFP + erano 2,58% nel campione non diluito, 12,8% alle 01:10, 0,735% a 1: 100 e 0,022% 1:1,000 il fattore di diluizione. La percentuale di cellule GFP + cambierà come il siero viene diluito a causa delle concentrazioni decrescenti dell'anticorpo nel campione.
Come potenziamento dell'infezione è associato con la concentrazione di anticorpi è ideale per aumentare l'assorbimento del virus, abbiamo osservato un drammatico aumento della percentuale di cellule GFP + alle 01:10 diluizione rispetto ad uno non diluito diluizioni del campione o altri, suggerendo che il campione non diluito ha avuto le più alte concentrazioni di anticorpi mentre le diluizioni 1: 100 e 1:1,000 hanno avuti livelli più bassi dell'anticorpo che non era sufficiente per indurre ADE di infezione. Se le concentrazioni nell'anticorpo sono significativamente elevati, ulteriori diluizioni del siero dovrebbero essere incluse per determinare la diluizione in cui ADE diventa apparente. In campioni di siero che abbiamo esaminato, abbiamo osservato ADE ad una diluizione di 01:10. D'altra parte, ADE può essere osservati a diluizioni inferiori se la concentrazione di anticorpi nel siero è abbastanza alta.
Successivamente, abbiamo calcolato la piega-valorizzazione dell'infezione dividendo la percentuale media di cellule GFP + nei pozzetti triplice copia per ogni diluizione con la percentuale media di cellule GFP + nei pozzetti triplicate per nessun controllo del siero. La cinetica di ADE contro DENV-1, 2, 3 e 4 sierotipi sono stati determinati da rappresentare graficamente piega-potenziamento sulla diluizione del siero e dell'asse y sull'asse x (Figura 3). I dati mostrano che il siero raccolti a 16 settimane post infezione significativamente migliorato l'infezione delle cellule K562 da DENV-1, 2, 3 e 4 sierotipi ad una diluizione di 01:10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57371/57371fig1.jpg"> Figura 1: Gating strategia per l'acquisizione e l'analisi di citometria a flusso. Cellule K562 infettate DENV RVP esprimono GFP che è stato analizzato utilizzando un citometro a flusso. (A) nessun controllo del siero e (B) 16 settimana post-ZIKV infettati del siero. Le cellule sono state prima gated basato su zona di forward scatter (FSC-A) vs forward scatter altezza (FSH-H) per escludere i doppietti seguite da un lato a dispersione (SSC-A) vs FSC-A escludere detriti. Il vs SSC-A FSC-A gated cellule era quindi gated basato su vs SSC-A GFP-A (fluorescenza verde proteina-zona). I rettangoli neri e ovali rappresentano i cancelli, e i numeri sopra le porte sono la percentuale di cellule che rientrano all'interno di quel cancello. La freccia nera tra le trame di FACS Mostra la sequenza delle porte utilizzate. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57371/57371fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57371/57371fig2.jpg"> Figura 2: rappresentante dot appezzamenti risultati frequenza di DENV RVP + cellule. La percentuale delle cellule K562 che sono stati infettati con RVP DENV-1 è stata determinata tramite flusso cytometry. Siero raccolto da un macaco Rhesus rappresentanza alle 16 settimane post infezione è stato incubato con RVP DENV-1 o non diluito su un 01:10, 1: 100 e 1:1,000 diluizioni e confrontato ai campioni di controllo senza siero. Viene visualizzata la percentuale di cellule GFP + ad ogni concentrazione di siero. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57371/57371fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57371/57371fig3.jpg"> Figura 3: potenziamento significativo della Dengue-1, 2, 3 e 4 infezione è osservato alle 01:10 diluizione del siero. Il potenziamento dipendente dell'anticorpo di infezione di febbre rompiossa è stato esaminato per i 4 sierotipi DENV da diluizioni del siero tracciato sull'asse x e piega-valorizzazione (rispetto a controlli a campione senza siero) sull'asse y. Sieri raccolti da 4 macachi rhesus immuni di ZIKV a 16 settimane dopo l'infezione è stato usato per questo test. Barre di errore rappresentano errore standard e * rappresenta p < 0.05. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57371/57371fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Descriviamo un protocollo semplice e facile per misurare il miglioramento dipendente dell'anticorpo dell'infezione di siero convalescente di Zika virus utilizzando le particelle virali di Reporter di virus della Dengue.

Base di un semplice flusso Cytometry Assay per determinare In Vitro dell'anticorpo dipendente valorizzazione del Virus di febbre rompiossa utilizzando siero convalescente Zika Virus

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

8.7K Views.  Uniformed Services University. Descriviamo un protocollo semplice e facile per misurare il miglioramento dipendente dell'anticorpo dell'infezione di siero convalescente di Zika virus utilizzando le particelle virali di Reporter di virus della Dengue.

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Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Immagine a base di Citometria a flusso Tecnica per valutare le variazioni Granulocyte Funzione<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Virus di Zika specifico diagnostico dell'epitopo Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...