This work was supported by the Institute National du Cancer (INCa-DGOS-4664).

1. neutrofili Isolamento e co-coltura con cellule leucemiche primarie NOTA: Le procedure sono state condotte sotto l&#39;approvazione del comitato etico dell&#39;ospedale di Lione, con tutti i pazienti che firmano un consenso informato. <ol><li> Isolamento di cellule leucemiche primarie e neutrofili <ol><li> Raccogliere tubi di sangue periferico in EDTA (1,8 mg EDTA per millilitro di sangue) da pazienti con diagnosi di leucemia linfatica cronica (LLC). </li><li> Aggiungere ogni 15 ml di sangue in una provetta sterile 50 ml e diluire con 15 ml di RPMI (diluizione 1: 1), poi accuratamente e aggiungere lentamente 15 ml di soluzione di gradiente di densità al fondo del tubo senza mescolare le fasi. Assicurarsi che la soluzione gradiente di densità è a RT per la preparazione. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 35 minuti a temperatura ambiente e senza freno. Il sangue deve separare in quattro fasi distinte, come mostrato in figura 1A, dall&#39;alto verso il basso: piastrine e plasma, cellule mononucleate (wanello Hite), soluzione gradiente di densità, i granulociti ed eritrociti. </li><li> Raccogliere l&#39;anello bianco che rappresenta le cellule leucemiche primarie con una pipetta di plastica Pasteur e trasferire in una nuova provetta da 50 ml. <ol><li> Riempire il tubo con PBS (contiene calcio e magnesio) fino a 50 ml in totale e centrifugare a 300 g per 10 min a RT. </li><li> Risospendere il pellet con 5 ml di PBS quindi aggiungere PBS fino a 50 ml in totale e centrifugare a 300 g per 10 minuti a RT. </li><li> Risospendere il pellet con mezzo completo RPMI (RPMI 1640 addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), 2 mM glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina) per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. </li></ol></li><li> Aspirare le fasi superiori lasciando la fase di granulociti e eritrociti e aggiungere PBS fino a 25 ml quindi aggiungere 3% di destrano a 0,9% NaClup a 50 ml in totale. Miscelare le provette 10 volte e tenerli per 30 min a temperatura ambiente senza mescolare. </li><li> Raccogliere il superiore RBC-poveri uno strato neutrofilid metterli in una sterile tubo da 50 ml pulita e centrifugare le provette a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere ogni pellet con 5 ml di PBS poi aggiungere rosso tampone di lisi delle cellule fino a 50 ml in totale. </li><li> Conservare le provette al buio per 15 minuti a RT quindi si centrifuga a 500 g per 10 minuti a RT. Lavare il pellet con PBS (PBS aggiungere fino a 50 ml in totale) centrifugare a 500 g per 10 minuti a RT. </li><li> Risospendere il pellet con terreno completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. Mantenere 3 x 10 5 di ogni tipo di cellula in 50 microlitri di PBS-FBS (4%) in 5 ml tubi di plastica per determinare la purezza del loro isolamento mediante citometria a flusso. </li></ol></li><li> Analizzare Aspetti morfologici delle isolate popolazioni di cellule <ol><li> Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10 4 neutrofili e 3 x 10 4 cellule mononucleari in 150 ml completo RPMI. Montare i vetrini, carte di filtro, e le camere del campione nella centrifuga cytospin, assicurando che tegli centrifugare è ben equilibrato. </li><li> Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e cito-centrifugare a 750 xg per 10 min a RT Rimuovere i vetrini, schede filtro e camere per campioni dalla centrifuga. Smontare con attenzione, in modo da non danneggiare le cellule sul vetrino. Scarta le carte di filtro e le camere del campione. </li><li> Macchiare le cellule utilizzando kit di colorazione Giemsa e mantenere le diapositive per 1 ora a secco. Esaminare le cellule al microscopio con ingrandimento 100X. </li></ol></li><li> Verificare la purezza di cellule isolate da FACS <ol><li> Etichettare le isolate cellule leucemiche primarie con anticorpi CD19 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Etichetta i neutrofili purificati con una miscela di anticorpi anti-umani elencati nella Tabella 1 (5 microlitri / 10 6 cellule). Incubare le cellule nel buio per 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) la centrifuga le provette a 300 g per 5 minuti a RT. </li><li>Risospendere ogni pellet in 200 microlitri di PBS-FBS (4%). </li><li> Analizzare su un citofluorimetro utilizzando la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PerCP-Cy5.5 (695/40 BP ), PE (575/26 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), APC-Cy7 (780/60 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore. </li></ol></li><li> Coculture di cellule leucemiche primari con autologo neutrofili <ol><li> Seed 2 x 10 5 cellule / ml di solo o con neutrofili autologhe al rapporto 1:10 in mezzo completo RPMI cellule leucemiche primarie. Per fare ciò, regolare il numero di cellule diluendo sospensioni cellulari e aggiungere 2 x 10 5 cellule / ml di cellule leucemiche primarie a 2 x 10 6 cellule / ml neutrofili. Mescolare con cura. </li><li> Aggiungere 25 micron di tirosina chinasi (Btk) inibitore di Bruton (Ibrutinib) alle cellule. Incubare per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Cellulare Raccolta e analisi FACS <ol><li> Collect le cellule in provette di plastica 5 ml per analisi FACS e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT. Lavare il pellet con 1 ml di PBS-FBS (4%) e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> pellet Risospendere in annessina V e PI utilizzando kit commerciale e incubare le cellule nel buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Analizzare su un citofluorimetro utilizzando la strategia di controllo dell&#39;immagine figura 2A e la seguente configurazione ottica: laser a 488 nm: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PI (610 / 20 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore. </li></ol></li></ol> 2. differenziazione delle cellule HL60 lungo la granulocitica Pathway e la loro co-coltura con cellule RL linfoma B in 3D del modello <ol><li> Differenziazione delle promielocitica umana (HL60), le cellule in cellule simil-neutrofili <ol><li> Regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10 5 cellule / ml quindi aggiungere 1 mM acido retinoico (RA) e 1,25% DMSO per indurre la loro differenziazione. Seed ogni 3 x 10 5 </sup&gt; cellule HL60 per pozzetto in lamiera 48-bene poi incubare per 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Successivamente, raccogliere le cellule e centrifugare a 300 g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule con terreno completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. </li><li> Poi diluire sospensione di cellule in mezzo completo RPMI per regolare il numero di cellule HL60 a 3 x 10 5 cellule / ml e indurre nuovamente la loro differenziazione aggiungendo 1 mM di acido retinoico (RA) e 1,25% DMSO. Seme ogni 3 x 10 5 HL60 cellule per pozzetto nella piastra a 48 pozzetti e incubare per altri 48 ore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Analisi di differenziazione HL60 (HL60 diff) <ol><li> Raccogliere le cellule e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet con mezzo completo RPMI per il conteggio utilizzando contatore vitalità cellulare. </li><li> Per analizzare i cambiamenti nell&#39;espressione marcatori di superficie cellulare mediante citometria di flusso. Posizionare ogni 3 x 10 5 </sup&gt; cellule indifferenziate HL60 (da colture cellulari) e 3 x 10 5 cellule HL60 diff in provette di plastica 5 ml per analisi FACS e centrifugare le provette a 300 g per 5 minuti a RT. </li><li> Risospendere il pellet in 50 microlitri di PBS-FBS (4%). Etichettare le cellule con CD11b anti-umano coniugati con AF700 o CD38 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Incubare le cellule nel buio per 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavare con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS-FBS (4%). </li><li> Analizzare il citofluorimetro utilizzando la strategia di gating della figura 3A e la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP). </li><li> Per testare i cambiamenti morfologici a HL60 diff, immobilizzare le cellule su vetrini per l&#39;esame microscopico. <ol><li> Per fare ciò, risospendere ogni 3 x 10 <sup&gt; 4 cellule indifferenziate HL60 (da colture cellulari) e 3 x 10 4 HL60 diff in 150 ml completa medie RPMI. Montare i vetrini, carte di filtro, e le camere del campione nella centrifuga cytospin, assicurando che la centrifuga è equilibrata. </li><li> Posizionare ogni tipo di cellula nella camera del campione e cito-centrifugare a 1500 rpm per 10 minuti a RT. Rimuovere le diapositive, le carte di filtro, e le camere di campioni dalla centrifuga. Smontare con attenzione, in modo da non danneggiare le cellule sul vetrino. Scarta le carte di filtro e le camere del campione. </li><li> Macchiare le cellule utilizzando kit di colorazione Giemsa e mantenere le diapositive per 1 ora a secco. Esaminare le cellule al microscopio con ingrandimento 100X. </li></ol></li></ol></li><li> 3 dimensioni (3D) Cultura NOTA: Assicurarsi che i materiali utilizzati in questo esperimento sono freddi e l&#39;esperimento sta prendendo posto sul ghiaccio. <ol><li> Risospendere ogni 5 x 10 4 cellule RL, da solo o in miscela con HL60 diff </em&gt; Al rapporto RL: HL60 diff 01:10, con matrice di membrana basale di 300 ml con 1 ml di punta della pipetta tagliata con una forbice sterile, al fine di ampliare l&#39;apertura di circa 2 a 3 mm. Evitare le bolle durante questa fase. </li><li> Seed ogni 300 ml di sospensione cellulare / bene in 24-pozzetti. Evitare le bolle durante questa fase. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C con 5% di CO 2 si aggiunge 1 ml completare terreno RPMI per ciascun pozzetto ed incubare per 7 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2. Cambiare la media ogni due giorni. Aggiungere 10 nM vincristina al giorno 5. </li></ol></li><li> Analisi FACS <ol><li> Dopo 7 giorni di coltura, aspirare il terreno e lavare i pozzetti con 1 ml di PBS ghiacciata due volte. Aggiungere 3 ml / pozzetto di PBS ghiacciato-EDTA (5 mm). Rimuovere il gel dal fondo del pozzo raschiando utilizzando il fondo di 200 microlitri punta della pipetta. Agitare delicatamente la piastra in ghiaccio per 30 min. </li><li> Trasferire sospensione cellulare in sterile tubo da 15 ml e agitare i tubi delicatamente ice per altri 30 min. Controllare l&#39;aspetto di sospensione omogenea. (Se non è il caso, quindi agitare le cellule per un tempo più lungo o aggiungere più PBS-EDTA). </li><li> Centrifugare le provette a 300 xg per 10 min a RT. Lavare il pellet con PBS poi centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. </li><li> Risospendere con PBS-FBS (4%) e l&#39;etichetta con l&#39;anticorpo CD19 anti-umano coniugato con PE-Cy7 e anticorpi CD38 anti-umano coniugato con APC (5 ml / 10 6 celle). Incubare al buio per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare con 500 microlitri di PBS-FBS (4%) poi provette per centrifuga a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule con annessina V e PI utilizzando il kit commerciale. </li><li> Analizzare il citofluorimetro utilizzando la strategia di gating della figura 4A e la seguente configurazione ottica: 488 nm laser: FSC-A (488 nm), SSC-A (488 / 10BP), coniugati (530/30 BP), PI (610 / 20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633 nm laser: APC (660/20 BP). Assicurarsi che la compensazione del colore. </li></ol></li&gt; </ol>

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	<li>Gocheva, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-4+induces+cathepsin+protease+activity+in+tumor-associated+macrophages+to+promote+cancer+growth+and+invasion.">IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion.</a> Genes Dev. 24, 241-255 (2010).</li><li>Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity,+Inflammation,+and+Cancer.">Immunity, Inflammation, and Cancer.</a> Cell. 140, 883-899 (2010).</li><li>Mitchem, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+tumor-infiltrating+macrophages+decreases+tumor-initiating+cells,+relieves+immunosuppression,+and+improves+chemotherapeutic+responses.">Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses.</a> Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Complexity+Predicts+Breast+Cancer+Survival+and+Functionally+Regulates+Response+to+Chemotherapy.">Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Di Carlo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intriguing+role+of+polymorphonuclear+neutrophils+in+antitumor+reactions.">The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions.</a> Blood. 97, 339-345 (2001).</li><li>Kumar, V., Sharma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils:+Cinderella+of+innate+immune+system.">Neutrophils: Cinderella of innate immune system.</a> Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).</li><li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity.">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).</li><li>Kelbaek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+isolation+of+polymorphonuclear+leukocytes+from+large+blood+volumes.">Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes.</a> J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. F&#252;rKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).</li><li>Aynaud, M. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Tribbles+3+protects+nuclear+DNA+from+cytidine+deamination+by+APOBEC3A.">Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A.</a> J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).</li><li>Zi&#242;&#322;kowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+three-dimensional+cell+culture+and+anticancer+drug+activity+evaluation+in+a+microfluidic+chip.">Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip.</a> Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).</li><li>Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+the+isolation+of+neutrophils+in+high+yield+without+the+use+of+dextran+or+density+gradient+polymers.">Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers.</a> J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).</li><li>Behnen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilized+immune+complexes+induce+neutrophil+extracellular+trap+release+by+human+neutrophil+granulocytes+via+Fc&#947;RIIIB+and+Mac-1.">Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via Fc&#947;RIIIB and Mac-1.</a> J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).</li><li>Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+not+less+sensitive+than+other+blood+leukocytes+to+the+genomic+effects+of+glucocorticoids.">Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids.</a> PloS One. 7, 44606 (2012).</li><li>Dorward, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technical+advance:+autofluorescence-based+sorting:+rapid+and+nonperturbing+isolation+of+ultrapure+neutrophils+to+determine+cytokine+production.">Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production.</a> J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Purification+and+Labeling+of+Mouse+Bone+Marrow+Neutrophils+for+Functional+Studies+and+Adoptive+Transfer+Experiments.">Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments.</a> J Vis Exp. , e50586 (2013).</li><li>Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaplasmaphagocytophilum+reduces+neutrophil+apoptosis+in+vivo.">Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo.</a> Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).</li><li>Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+of+neutrophils.">Apoptosis of neutrophils.</a> ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).</li><li>Dalton, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HL-60+cell+line+was+derived+from+a+patient+with+FAB-M2+and+not+FAB-M3.">HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3.</a> Blood. 71, 242-247 (1988).</li><li>Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+normal+and+transformed+epithelial+cells:+Their+contributions+to+tumourigenesis.">Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).</li><li>Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+cultures:+current+trends+and+beyond.">Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond.</a> Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).</li><li>Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages,+Neutrophils,+and+Cancer:+A+Double+Edged+Sword.">Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword.</a> New J. Sci. , 271940 (2014).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).</li><li>Shojaei, F., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+to+antivascular+endothelial+growth+factor+treatment:+role+of+myeloid+cells.">Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells.</a> Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).</li><li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+promote+the+malignant+glioma+phenotype+through+S100A4.">Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4.</a> Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).</li><li>Teramukai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretreatment+neutrophil+count+as+an+independent+prognostic+factor+in+advanced+non-small-cell+lung+cancer:+an+analysis+of+Japan+Multinational+Trial+Organisation+LC00-03.">Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03.</a> Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).</li><li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-6-STAT3+axis+mediates+a+reciprocal+crosstalk+between+cancer-derived+mesenchymal+stem+cells+and+neutrophils+to+synergistically+prompt+gastric+cancer+progression.">The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression.</a> Cell Death Dis. 5, 1295 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Descritto qui, un protocollo efficace, semplice, veloce ed economico per l&#39;isolamento dei neutrofili dal sangue umano con elevata purezza mediante centrifugazione in gradiente di densità approccio ed entro le stesse cellule mononucleate passo vengono separati e recuperati. Le popolazioni di cellule isolate sono puri ≥90%. Sono disponibili diversi metodi per l&#39;isolamento dei neutrofili dal sangue umano. Questi includono metodi simili utilizzando gradienti discontinui 11,12, o usando kit commerciali per l&#39;isolamento dei neutrofili dalla selezione positiva immuno-magnetica durante il quale i neutrofili sono immuno-magnetiche marcato con anticorpi specifici, come CD16 anti-umano poi neutrofili arricchito dal legame del CD16- cellule positive su una colonna magnetica 13. kit commerciali con selezione negativa immuno-magnetico sono disponibili anche durante il quale il sangue intero o di sospensione di granulociti sono etichettati con un cocktail di anticorpi che si legano sulle cellule altro than neutrofili 9 (vale a dire, i complessi di anticorpi che etichettano globuli rossi, piastrine e cellule indesiderati come CD2, CD3, CD9, CD19, CD36, CD56, glicoforina A e particelle magnetiche rivestite di destrano), poi neutrofili sono arricchite da eluizione come anticorpi frazione negativo di cellule che non si legano alla colonna magnetica. Inoltre, i neutrofili possono essere isolati dalla fluorescenza delle cellule Attivato Ordinamento 14. Alcune tecniche hanno dimostrato di fornire alte rese di neutrofili puri, come la selezione positiva immuno-magnetico. Tuttavia, questo metodo ha svantaggi rispetto alla densità metodi di centrifugazione gradiente dovute agli agenti etichettatura che si legano alla superficie dei neutrofili, che potrebbero alterare la loro funzione inducendo loro attivazione o differenziazione. Inoltre utilizzando il metodo di selezione immuno-magnetica positiva, l&#39;anticorpo marcato neutrofili legato sulla colonna magnetica per la separazione e questo può anche influenzare la loro funzione.Fluorescence Activated Cell Sorting ha un altro limite nella misura in cui questo metodo richiede più tempo per raccogliere le cellule che possono incidere negativamente sulla sopravvivenza dei neutrofili a causa della loro breve emivita. Metodo di centrifugazione in gradiente di densità sono molto simili e la purezza dei neutrofili può superare il 90% utilizzando entrambe le procedure, ma il primo è un gradiente a due strati che è tecnicamente meno impegnativo rispetto alla soluzione gradiente stratificazione che consistono di 40%, 60% e 80% vol / vol in PBS. E &#39;stato detto da Swamydas et al. 15 che mescolamento delle interfacce soluzione gradiente avviene spesso a causa delle piccole differenze di densità tra i tre strati. Rispetto agli approcci selezione immuno-magnetico negativi, sono stati segnalati per essere efficace per l&#39;isolamento dei neutrofili con elevata purezza e vitalità 9. Il loro vantaggio rispetto ai selezione immuno-magnetico positivo e Fluorescence Activated ordinamento cellulare è che i neutrofilinon sono etichettati con agenti etichettatura e non si legano a colonna magnetica, evitando così l&#39;attivazione delle cellule, ma questo metodo è molto più costoso e più tempo rispetto al metodo del gradiente di densità. I neutrofili normalmente subiscono una rapida apoptosi spontanea sia in vitro che in vivo 16,17. HL60promyelocyticcells conservano molte caratteristiche di progenitori dei leucociti umani, come ad esempio la possibilità di sottoporsi a differenziazione in neutrofili 18. A differenza di neutrofili, cellule diff HL60 non lo fanno rapidamente apoptosi e l&#39;utilizzo di queste cellule risolve il problema di avere diverse risposte dei neutrofili a causa del loro isolamento da diversi donatori. Recentemente, culture 3D diventano più maturi e pertinente alla fisiologia umana e animale, e un modello attraente per la ricerca biologica differente soprattutto nel campo dei tumori. Lo spostamento modello da 2D a 3D cultura sta progredendo rapidamente si saidnce quest&#39;ultimo è più evidente durante lo studio varie condizioni patologiche come il cancro 19. Vi è una crescente consapevolezza degli svantaggi della cultura 2D dove aggiungendo una terza dimensione all&#39;ambiente di una cella è importante per dare un&#39;occhiata più da vicino l&#39;importanza delle interazioni cellulari 20 e studiare le differenze nel comportamento cellulare e caratteristiche. Cultura 3D crea un ambiente simile a condizioni in un organismo vivente (per es., Essere umano) che porta alla ricerca più rilevanti. Tuttavia, la cultura 3D coinvolge la complessa interazione tra i diversi partner come le cellule, matrici extracellulari e fluidi interstiziali che non presenti nella cultura 2D. Così, gli sforzi saranno necessari al fine di stabilire la calibrazione metodo e di contare su buone pratiche di laboratorio e forniture efficaci soprattutto i marchi commerciali che sono ampiamente testati e monitorati. Il microambiente tumoralesi compone di più tipi di cellule, tra cui molte popolazioni di cellule del sistema immunitario che partecipano e regolano tumorigenesi, metastasi e risposta agli agenti antitumorali 21,22. Diversi studi hanno dimostrato che un aumento di neutrofili infiltrazione nei tumori è significativamente correlata con resistenza acquisita a diversi agenti anti-cancro come terapia anti-VEGF 23,24. Inoltre, elevazione dello neutrofili pretrattamento conteggio in pazienti con carcinoma renale metastatico 25, così come la presenza di un elevato livello di neutrofili intra-tumorale in pazienti con diversi tumori solidi, 26 sono stati proposti come fattori prognostici per scarsa sopravvivenza. Il nostro studio suggerisce che i neutrofili possono svolgere un ruolo nel proteggere le cellule del linfoma B da antitumorale apoptosi agente indotta. In sintesi, il metodo affidabile e riproducibile qui descritto può essere impiegato da qualsiasi laboratorio per raccogliere neutrofili e cellule mononucleate di ronzioun sangue. Inoltre, la differenziazione di cellule HL60 lungo il percorso granulocitica è presentato per evitare alcuni problemi neurophil come l&#39;apoptosi spontanea rapida. Questi approcci sono stati usati per studiare il ruolo dei neutrofili sulla sensibilità delle cellule di linfoma di agenti anti-linfoma dove neutrofili mostrano un effetto protettivo sulle cellule del linfoma contro questi agenti che utilizzano sistemi di coltura 2D e 3D. Questi approcci possono essere utilizzati per una varietà di studi funzionali neutrofili che dovrebbe approfondire la nostra comprensione del ruolo dei neutrofili nella biologia del cancro. In particolare, questo metodo può essere utilizzato per comprendere meglio il cross-talk tra neutrofili e cellule tumorali o tra neutrofili e altri componenti del microambiente.

Cellule immunitarie innate costituiscono una quota essenziale delle cellule all&#39;interno del microambiente tumorale e sono stati associati con la malignità del tumore nei pazienti e modelli animali di cancro 1. Recentemente, è diventato più ampiamente apprezzati che le risposte immunitarie croniche giocano ruoli critici nella promozione progressione tumorale, metastasi e resistenza alle chemioterapie 2. I macrofagi sono importanti cellule immunitarie innate che hanno dimostrato di regolare direttamente la risposta delle cellule tumorali alla chemioterapia 3,4. Tuttavia, il ruolo dei neutrofili, i principali attori del sistema immunitario innato, nella regolazione della risposta del tumore alla terapia anti-cancro non è noto. Gli obiettivi di questi protocolli sono di utilizzare un metodo veloce e credibile per separare neutrofili da campioni di sangue CLL del paziente e di differenziare le cellule HL60 lungo il percorso granulocitica al fine di studiare il loro ruolo nel regolare la sensibilità delle cellule di linfoma di agenti anti-linfoma. 5 e ad agire come una prima linea di difesa contro i microrganismi invasori 6. I neutrofili hanno un ruolo essenziale nella nascente efficaci risposte immunitarie innate, oltre alle funzioni effettrici variabili in diverse condizioni patologiche 7. Pertanto, un metodo veloce e credibile isolare neutrofili dalle altre cellule del sangue, come metodo di separazione gradiente di densità, è necessaria per gli studi in vitro. Usando questo metodo per l&#39;isolamento dei neutrofili faciliterà ulteriori ricerche sulle funzioni immunologiche neutrofilo-mediata in vivo ed ex vivo. La possibilità di ottenere popolazioni pure di neutrofili è un primo passo importante per lo studio di pazienti con malattie immunologiche 8. Densità metodo di separazione gradiente è una tecnica ideale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule. il method comporta l&#39;aggiunta di soluzione gradiente di densità nella parte inferiore di un tubo contenente sangue umano diluito seguita da centrifugazione a 300 g per 35 min senza interruzione. L&#39;anello delle cellule mononucleari appare a livello di interfaccia e neutrofili risiedere al di sotto del primo. Questo metodo ha vantaggi significativi rispetto ad altri metodi disponibili come kit di isolamento dei neutrofili che sono molto più costosi 9. Inoltre, isolando neutrofili dal sangue umano da kit commerciali utilizzando anticorpi diretti ad un marcatore di superficie specifico per neutrofili umani, aumentare il rischio di attivazione delle cellule o la differenziazione. Densità metodo di separazione gradiente consente l&#39;isolamento dei neutrofili entro un breve periodo di tempo. Entro lo stesso passo, cellule mononucleari vengono separati e recuperati. E &#39;una tecnica fondamentale in cui si ottiene un elevato rendimento di cellule puri per conseguire integrità funzionale. Al fine di simulare il microenv tumoreironment, sono stati effettuati esperimenti di 3D. Data la breve emivita dei neutrofili in vitro, gli esperimenti 3D con neutrofili umani freschi non sono conclusivi. Per questo motivo, promielocitica cellule (HL60) vengono indotte a differenziarsi in cellule neutrofili simili che utilizzano gli induttori di differenziazione dimetilsolfossido (DMSO) e l&#39;acido retinoico (RA). Utilizzando cellule HL60 differenziate (HL60 diff) impedirà avere diverse risposte dei neutrofili a causa di isolamento da diversi donatori. In 3D vitro modelli di coltura rappresentano una fase intermedia tra i modelli in 2D in vitro e in modelli in vivo. Nella cultura 2D, le cellule sparse sulla superficie di plastica formando allegati cellulari innaturali alle proteine ​​depositati che sono denaturate su questa superficie sintetica. Viceversa, le cellule allegati cellula-cellula naturale forma coltura 3D poiché le cellule e la matrice extracellulare sintetizzano sono il materiale naturale a cui sono attaccati.Per questo motivo, i modelli co-coltura 3D, in particolare tra le cellule tumorali e di altri tipi di cellule, sono stati molto utili per indicare il loro contributo alla crescita del tumore, l&#39;angiogenesi, e le metastasi. Come risultato, culture 3D rendono la coltura cellulare mimare le condizioni fisiologiche che esistono in vivo 10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1161">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">21875-034</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">Phosphate-buffered saline (PBS contains calcium and magnesium)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-acetyl-L-alanyl-L-glutamine (L-Glutamine)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:156px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin streptomycin (Pen Strep)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bruton&#39;s tyrosine kinase (Btk) inhibitor (Ibrutinib)&#160;</td>
			<td style="width:157px;">CliniSciences</td>
			<td style="width:156px;">A3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vincristine&#160;</td>
			<td style="width:157px;">EG labo</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">BD Matrigel basement membrane matrix&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td>Put at 4 oC overnight before the day of the experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Red cell lysis buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:156px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll (Pancoll)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td style="width:156px;">P04-60500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextran&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td style="width:535px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Annexing V-FLOUS staining kit&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Roche</td>
			<td>11&#160;988&#160;549&#160;001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Kit RAL 555 Modified Giemsa staining kit</td>
			<td style="width:157px;">Cosmos Biomedical</td>
			<td style="width:156px;">CB361550-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRII flow cytometry</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:157px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica DMR-XA microscope</td>
			<td style="width:157px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Cellometer Auto T4 Cell Viability Counter</td>
			<td style="width:157px;">Nexcelom&#160; Bioscience</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutrophil isolation and analysis to determine their role in lymphoma cell sensitivity to therapeutic agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Densità metodo di separazione gradiente qui descritto fornisce cellule leucemiche primarie e neutrofili non stimolate isolate dal sangue di pazienti affetti da LLC figura 1A rappresenta i diversi livelli di sangue ottenuti dopo gradiente di densità centrifugazione (dall&#39;alto verso il basso:. Piastrine e plasma, anello bianco rappresenta le cellule mononucleate, gradiente di densità soluzione, granulociti e eritrociti). Figura 1B e 1C mostrano le differenze nelle apparenze morfologiche tra i neutrofili (cellule di multi-lobi nuclei) e le cellule mononucleate rispettivamente. Risultati in Figura 1D rappresentano il forward-scatter (FSC) vs side-scatter (SSC) appezzamento di cellule leucemiche primarie (cellule mononucleate). Etichettare questa popolazione con CD19 anti-umano coniugato con APC mostra uno spostamento a destra completo dell&#39;istogramma (Figura 1E) con un solopicco che indica che questa popolazione è positiva per CD19 e puro. I neutrofili sono anche puro ≥90% come verificato mediante citometria di flusso dopo l&#39;etichettatura dei neutrofili isolati con una miscela di anticorpi monoclonali coniugati a fluorocromi elencati nella tabella 1. Figura 1F rappresenta FSC vs SSC diagramma a dispersione dei neutrofili isolati che sono positivi per CD45 (Figura 1G), positivo per CD15 e negativo per CD14 (Figura 1 H), positivo sia per CD15 e CD16 (Figura 1I), positivo per CD16 e negativo per CD56 (Figura 1 undecies). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig1.jpg" /> Figura 1. Analisi delle Apparizioni morfologici e la purezza delle cellule leucemiche primarie e neutrofili isolati dal sangue dei pazienti. (A) Rappresentazione schematica rappresenta diversi strati di sangue dopo gradi densitàent centrifugazione. (BC) Giemsa rappresenta le differenze morfologiche tra i neutrofili (B) e (C) cellule leucemiche (cellule mononucleate) primarie. Le foto sono state scattate da microscopio con ingrandimento 100X. (D) Forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC) trama rappresenta il isolato popolazione di cellule leucemiche primarie. (E) isolate cellule leucemiche primarie sono stati etichettati con anti-CD19-APC e analizzati per l&#39;espressione di CD19. La linea rossa indica le cellule senza etichetta e la linea blu indica cellule marcate con anti-CD19-APC. (F) FSC vs trama SSC dispersione rappresenta la popolazione dei neutrofili isolati. (GJ) neutrofili isolati sono stati etichettati con una miscela di anticorpi elencati nella tabella 1 e analizzati per l&#39;espressione di (G) CD45, (H) CD14 e CD15, (I) CD15 e CD16, (J) CD16 und CD56. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Gli antigeni </td><td> fluorocromo </td><td> Clone </td></tr><tr><td> CD14 </td><td> APC-Vio770 (Cy-7) </td><td> TÜK4 </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> APC </td><td> VIMC6 </td></tr><tr><td> CD16 </td><td> FITC </td><td> VEP13 </td></tr><tr><td> CD45 </td><td> PerCP-Vio700 (Cy5.5) </td><td> 5B1 </td></tr><tr><td> CD56 </td><td> PE </td><td> AF12-7H3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. coniugato a un fluorocromo purificati monoclonali anticorpi utilizzati per verificare la purezza isolato neutrofili. Tutti gli anticorpi sono stati ottenuti da Miltenyi biotech. <p class="jove_content"fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Per studiare l&#39;effetto dei neutrofili sulla sensibilità delle cellule leucemiche primarie (CLL) per Ibrutinib, queste ultime sono state coltivate da solo o con neutrofili autologhe (N) per 24 ore a rapporto N : CLL 10: 1, in presenza o assenza di Ibrutinib a 25 pM. La percentuale di cellule leucemiche primarie vive (annessina V negativo / PI negativo) è stata misurata mediante doppia colorazione con annessina V-FITC e PI, seguita da analisi di citometria di flusso. FSC vs SSC dispersione nella figura 2A rappresenta le porte di neutrofili e di cellule leucemiche primarie. I neutrofili sono molto più granulari rispetto alle cellule leucemiche primarie in modo da apparire con una maggiore SSC. Gating sulle cellule leucemiche primarie co-coltura con neutrofili in presenza di Ibrutinib, risultati mostrano percentuale di cellule vive (Figura 2C, 84.8%) rispetto alle cellule coltivate solo (Figura 2B, 53,1%). Il grafico di dialogo nella figura 2D mostra che i decrease di vitalità cellulare indotta da Ibrutinib era significativamente inibito dalla presenza di neutrofili (40,1 ± 3,1 vs 60,1 ± 3,5, p &lt;0.001, 19 pazienti). <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig2.jpg" /> Figura 2. autologo neutrofili proteggere le cellule leucemiche primaria contro Ibrutinib. Il sangue è stato raccolto da pazienti con diagnosi di leucemia linfatica cronica (LLC). cellule leucemiche primarie sono state isolate e coltivate da soli o insieme con neutrofili autologhe (N) a cellule leucemiche primarie Nratio 01:10 per 24 ore, in presenza o assenza di 25 pM Ibrutinib. La percentuale di cellule leucemiche primarie in tempo reale (Allegato IV V negativo / PI negativo) è stata misurata mediante doppia colorazione con annessina V-FITC e PI, seguita da analisi di citometria di flusso. (A) Forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC) trama rappresenta le porte di neutrofili e di cellule leucemiche primarie. (B) Bi-dimensionale dot-blot mostra la percentuale di cellule leucemiche primarie vivi e apoptotici coltivate solo e trattati con 25 mM Ibrutinib. (C) Bi-dimensionale dot-blot mostra la percentuale di cellule leucemiche primarie vivi e apoptotici cooperazione coltivate con neutrofili e trattati con 25 mM Ibrutinib. trama (D) Box rappresenta la percentuale di vivo cellule leucemiche primarie di 19 pazienti. I dati sono espressi come media ± SD. *** p &lt;0.001 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> La breve emivita di neutrofili in vitro rende il loro uso nella cultura 3D inefficace. La differenziazione delle cellule HL60 lungo il percorso granulocitica è stata indotta da induttori di differenziazione. Due diversi parametri (marcatori di superficie cellulare espressione e morfologica changes) sono stati utilizzati per misurare la differenziazione di HL60. FSC vs SSC plot dispersione nella figura 3A mostrano che le cellule HL60 sono di dimensioni maggiori rispetto alle cellule HL60 diff con una maggiore FSC. Etichettare le cellule (HL60 o HL60 diff) con anticorpi CD11b anti-umano coniugato con AF700 e CD38antibody anti-umano coniugato con APC mostra un aumento CD11b e CD38 (Figura 3B) su differenziazione, che è indicativo di differenziazione granulocitica. Cellule HL60 diff mostrano anche cambiamenti morfologici rilevati dalla comparsa di nuclei multilobata (Figura 3C). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig3.jpg" /> Figura 3. parametri strutturali di cellule differenziate HL60. (A) Forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC) trame rappresentano HL60 e le cellule HL60 differenziate (HL60 diff). (B) HL60 e HCellule diff L60 sono stati etichettati con anti-CD11b-AF700 o anti-CD38-APC seguita da analisi di citometria a flusso. Dopo gating su ogni popolazione cellulare nel FSC-A vs SSC-A grafico a dispersione (A), le cellule sono state analizzate per le espressioni di CD11b e CD38. Celle (C) HL60 mostrano cambiamenti morfologici coerenti con la differenziazione verso granulociti. Le foto sono state scattate da microscopio con ingrandimento 100X. Bold freccia nera punta il nucleo multi-lobata. I grafici sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53846/53846fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per testare l&#39;effetto di cellule HL60 diff sulla normalizzazione risposta cellulare RL a vincristina nel modello 3D, cellule RL state coltivate solo o con HL60 diff nella matrice membrana basale in presenza o assenza di vincristina a 10 nM. Usando la strategia di gating mostrato nella Figura 4A, entrambe le popolazioni sono discriminati sulla base di espressione CD19 e CD38; Cellule RL positivi per le cellule CD19 diff e HL60 positive per CD38. Gating su cellule RL co-coltura con cellule HL60 diff in presenza di vincristina, risultati mostrano percentuale di cellule vive (Figura 4C, 35,9%) rispetto alle cellule coltivate RL sola (Figura 4B, 19,7%). Il grafico nella figura 4D mostra un aumento significativo nella percentuale di cellule vive RL (CD19 Annessina V positivo negativo / PI negativo) in presenza di cellule HL60 diff (19,5 ± 0,2 vs 33,1 ± 1.0, p &lt;0.001). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53846/53846fig4.jpg" /> Figura 4. cellule HL60 diff neutrofili come proteggere le cellule RL linfoma contro Vincristina nella cultura 3D. Cellule RL<html> sono state coltivate da soli o insieme con le cellule HL60 diff a RL: rapporto diff HL60 1:10 per 7 giorni a matrice di membrana basale. Il giorno 5, vincristina (VCR) è stato aggiunto ad una concentrazione di 10 nM. Sferoidi sono state dissociate il giorno 7 e cellule sono state marcate con anti-CD19-PECy7 e anti-CD38-APC poi risospeso con annessina V-FITC e PI seguita da analisi di citometria di flusso. (A) Forward-scatter (FSC) e side-scatter (SSC) trama rappresenta le porte delle celle RL e cellule diff HL60. (B) Bi-dimensionale dot-blot mostra la percentuale di cellule RL vivo e apoptotici coltivate solo e trattati con 10 nM vincristina. (C) DOT- Bi-dimensionale macchia mostra le percentuali di cellule RL vivo e apoptotici co-coltura con HL60 diff e trattati con 10 nM vincristina. (D) il grafico a barre rappresenta la percentuale di cellule vive RL. I dati sono espressi come media ± SD. *** P ≤0.001.jove.com/files/ftp_upload/53846/53846fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

neutrophil-isolation-analysis-to-determine-their-role-lymphoma-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Views.  Cancer Research Center in Lyon. Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. 

Video: Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified mice, such as Atm-/- and p53-/- consistently develop thymic lymphoma early in life 1,2, and thus, can serve as a reliable source for derivation of murine T-cell lines. Here we present a detailed protocol for the development of established murine thymic lymphoma T-cell lines without the need to add interleukins as described in previous protocols 1,3. Tumors were harvested from mice aged three to six months, at the earliest indication of visible tumors based on the observation of hunched posture, labored breathing, poor grooming and wasting in a susceptible strain 1,4. We have successfully established several T-cell lines using this protocol and inbred strains ofAtm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 and p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5 mice. We further demonstrate that more than 90% of the established T-cell population expresses CD3, CD4 and CD8. Consistent with stably established cell lines, the T-cells generated by using the present protocol have been passaged for over a year.

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

In this video we demonstrate a protocol to establish mouse thymic lymphoma cell lines. By following this protocol, we have successfully established several T-cell lines from Atm-/- and p53-/- mice with thymic lymphoma.

Derivazione di timica linfoma a cellule T Linee da Atm - / -</sup E P53 - / -</sup Mouse

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

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Immunologia e infezioni

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Metodi per studiare il ruolo di regolamentazione dei piccoli RNA ribosomiale e di occupazione<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

Metodi in vitro per il confronto obiettivo vincolante e CDC induzione Tra terapeutiche Anticorpi: Applicazioni nel Analisi Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...