Gli autori vorrebbero ringraziare Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert per la loro assistenza nella caratterizzazione del virus derivato dal clone. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dell&#39;Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive, NIH con sovvenzioni AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).

1. Trasformazione e recupero dei plasmidi di cloni infettivi <ol><li> Trasformare entrambi i plasmidi (separatamente) utilizzando un protocollo di trasformazione commerciale ( ad esempio , NEB 5 Minute Transformation Protocol) con alcune modifiche. Entrambi i plasmidi contengono un gene che codifica per la resistenza all&#39;ampicillina, quindi utilizzare ampicillina o carbenicillina per la selezione. La carbenicillina è preferita, in quanto è più stabile. <ol><li> Rimuovere le celle (vedere tabella dei materiali) da congelatore da -80 ° C e scongelare su ghiaccio per 5-10 min. Brodo Lysogeny (LB) (contenente 10 g / L NaCl e 25 μg / mL carbenicillina, chiamato LB-carb) e il brodo con repressione catabolita (SOC (senza antibiotici) - venuta con le cellule) a 37 ° C. </li><li> Aggiungere fra 100 pg-10 ng in 1 μl di plasmide DNA in un tubo contenente 50 μL di cellule competenti; Mescolare delicatamente spostando il tubo. </li><li> Incubare i tubi in ghiaccio per 5 min. </li><li> Tubazioni a scossa termica a 42 ° C per 30 sIn un bagno d&#39;acqua. Ritorna al ghiaccio per 2 minuti subito dopo lo shock termico. </li><li> Pipettare 950 μL di temperatura ambiente SOC in ogni tubo e mescolare pipettando. Distribuire 100 μL di miscela batterica su un piatto di LB-carb e incubare per una notte a 37 ° C (circa 12-14 h). </li></ol></li><li> Rimuovere le piastre da incubatore a 37 ° C dopo 12-14 h di incubazione. Posizionare le piastre in un cassetto scuro a temperatura ambiente per permettere alle colonie di continuare a crescere (circa 8-9 h). </li><li> Utilizzando 5 ml di brodo Terrific (TB, contenente 25 μg / mL di carbenicillina, chiamato TB-carb), coltivate 5-10 piccole colonie per ogni plasmide per una notte a 30 ° C in un agitatore batterico (circa 14-16 h). NOTA: Le piccole colonie sono un indicatore che il plasmide è intatto; Le colonie con plasmidi contenenti delezioni, riarrangiamenti o mutazioni (qui chiamati eventi di instabilità) crescono più velocemente e quindi saranno più grandi. Pertanto, si dovrebbe cercare di prendere le colonie più piccole sul piatto, in particolare noT selezionando le più grandi colonie presenti. Alcune colonie di medie dimensioni possono anche essere selezionate per completezza. La temperatura inferiore utilizzata riduce la probabilità che le cellule si svilupperanno (OD 600 superiore a 0,6-0,8). Poiché la maggior parte dei ricercatori esegue la crescita durante la notte, consente un maggiore controllo e riduzione delle probabilità di sovraesposizione. </li><li> Controllare le colture liquide per la torbidità (circa OD 600 di 0,6-0,8). Posizionare eventuali tubi torbidi a 4 ° C e permettere a altri tubi di diventare torbidi crescendo per più tempo. NOTA: Non coltivare i batteri ai valori OD 600 maggiori di quelli raccomandati, in quanto possono verificarsi eventi di instabilità plasmidica. </li><li> Estrarre il DNA plasmidico da batteri con un kit di miniprep plasmide commerciale (vedi tabella dei materiali). Eluire in 15 μl di pre-riscaldato (a 70 ° C in un blocco di riscaldamento) tampone di eluizione. Lasciare che il buffer di eluizione si incuba sulla colonna per 5 minuti prima della centrifugazione. NOTA: conservare almeno 1 ml di questa coltura di starter a 4 ° C perUlteriore utilizzo nella fase successiva. </li><li> Digest 10 μL dei plasmidi recuperati per valutare se gli eventi di instabilità del plasmide si sono verificati durante la coltura. NOTA: Digest p1 con SalI / NheI e p2 con BamHI / HindIII a 37 ° C per 1 h. Confermare la presenza delle bande corrette dopo la digestione ( Figura 2a ) mediante elettroforesi a gel e procedere al punto 2. Se si prepara il DNA del plasmide mediante l&#39;amplificazione a cerchio di rotolamento (RCA), riservare un po &#39;di eluato di miniprep per servire come template. </li></ol> 2. Preparazione di un sufficiente DNA plasmidico per la legatura NOTA: La legatura e la successiva elettroporazione richiedono una quantità sufficiente di DNA plasmidale che deve essere generato tramite maxiprep o RCA. Mentre il maxiprep è l&#39;approccio tradizionalmente utilizzato, RCA offre il vantaggio di non richiedere batteri, eliminando così il potenziale di tossicità indotta dal plasmide nei batteri che possono causare eventi di instabilità. <ol><li><stRong&gt; Eseguire la seguente procedura maxiprep. <ol><li> Per ciascun plasmide che ha dimostrato il corretto schema di digestione dell&#39;enzima di restrizione nella sezione precedente, aggiungere 500 μl di coltura d&#39;avviamento a 1 L di brodo di TB-Carb (25 μg / mL carbenicillina) e agitare per una notte a 30 ° C (circa 14-16 h , Circa OD 600 di 0,6-0,8). NOTA: non consentire alla coltura di crescere oltre questo valore OD 600 . Ciò potenzialmente può determinare eventi di instabilità all&#39;interno dei plasmidi. </li><li> Raccogli i batteri e eseguite maxipreps per protocollo del produttore (vedi tabella dei materiali). </li></ol></li><li> Utilizzando il miniprep salvato dal punto 1.6, eseguire quanto segue per la procedura RCA. <ol><li> Trasferire 1 μl di plasmide DNA in un tubo contenente 50 μl di campione di tampone. </li><li> Diluire il campione a 95 ° C per 3 minuti e poi incubare a 4 ° C fino a quando non è pronto per l&#39;uso. </li><li> Preparare l&#39;amplificazione commercialePremix (vedi tabella dei materiali ). Combinare 50 μl di tampone di reazione con 2 μl di miscela enzimatica in un tubo posto sul ghiaccio. NOTA: La premiscela di amplificazione deve essere mantenuta sul ghiaccio fino a quando non sarà pronta per l&#39;uso. È conveniente preparare un mix master combinando reagenti sufficienti per il numero richiesto di reazioni di amplificazione. Ogni premiscela non utilizzata deve essere scartata. </li><li> Trasferire 50 μl di preparata preparata di amplificazione al campione denaturato. </li><li> Incubare i tubi di reazione a 30 ° C per 18 ore. </li><li> Incubare i tubi a 65 ° C per 10 minuti per inattivare la polimerasi ø29 DNA. </li><li> Conservare i tubi di reazione a 4 ° C oa -20 ° C fino all&#39;uso pronto. NOTA: A questo punto, il plasmide DNA preparato con entrambi i metodi dovrebbe essere quantificato (utilizzando l&#39;assorbanza a 260 nm) e il genoma ZIKV dovrebbe essere Sanger sequenziato interamente per confermare eventi di instabilità (delezioni e riarrangiamenti) durante la preparazione. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome primario </td><td> Sequenza (5 &#39;- 3&#39;) </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 1For. </td><td> AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 632For. </td><td> GCCCTATGCTGGATGAGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 692Rev. </td><td> GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1313Rev. </td><td> CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1201For. </td><td> CCAACACAAGGTGAAGCCTAC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 1663For. </td><td> GCAGACACCGGAACTCCACACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 2008For. </td><td> CAGATGGCGGTGGACATGC </td></tr><tr><td> ZIKV conservato 2350Rev. </td><td> GTGAGAACCAGGACATTCCTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 2605Per. </td><td> TACAAGTACCATCCTGACTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 3499Rev. </td><td>GCCTTATCTCCATTCCATACCA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 3961Rev. </td><td> TTGCCAACCAGGCCAAAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4132For. </td><td> CATTTGTCATGGCCCTGG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4561Rev. </td><td> CTATTGGGTTCATGCCACAGAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 4665For. </td><td> GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 5189Rev. </td><td> AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 5219For. </td><td> GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6086Rev. </td><td> CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6119Per. </td><td> GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6721Rev. </td><td> CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 6769Per. </td><td> CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 7209Rev. </td><td> ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 7343Per. </td><td> GTTGTGGATGGAATAGTGGT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 8243Per. </td><td> TGCCCATACACCAGCACTATGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 8893Rev. </td><td> TGCATTGCTACGAACCTTGTTG </td></tr><tr><td> ZIKV conservato 9133For. </td><td> AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA </td></tr><tr><td> ZIKV PRVABC59 9673Rev. </td><td> AACGCAATCATCTCCACTGACT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 9686For. </td><td> GATGATAGGTTTGCACATGCC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10321Rev. </td><td> GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10455Per. </td><td> CAGGAGAAGCTGGGAAACC </td></tr><tr><td> ZIKV Conservato 10621Rev. </td><td> CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Primer per il sequenziamento di cloni cDNA. I plasmidi possono essere sequenziati interamente con i primer elencati. Primeri contrassegnati come indici &quot;conservati&quot;Che sono probabilmente in grado di sequenziare / amplificare tutti i genotipi di ZIKV. I primer contrassegnati come &quot;PRVABC59&quot; sono specifici a questo ceppo ma possono anche funzionare per altri ceppi di genotipo asiatici e forse altri genotipi. 3. Preparazione di RNA trascritto in vitro <ol><li> Impostare la reazione di digestione del DNA preparato con maxiprep o RCA. <ol><li> Per la digestione p1, mescolare 10 μL di tampone di reazione 10x, 3 μL di ApaLI, 3 μL di BamHI-HF, 3 μL di rSAP o CIP e 3,3 μg di DNA p1. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Per la digestione p2, mescolare 10 μl di tampone di reazione 10x, 3 μL di ApaLI, 3 μL di EcoRI-HF e 13,3 μg di DNA p2. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Incubare a 37 ° C per 1-2 ore. </li><li> Purificare con un gel commerciale e un kit di pulizia PCR (vedi tabella dei materiali). Eluire in 30 μl di tampone di eluizione pre-riscaldato a 70 ° C in un blocco di riscaldamento (incubare ilColonna per 5 min prima della rotazione). NOTA: tenere 1 μL in esecuzione su un gel in seguito. </li></ol></li><li> Preparare la reazione di legame. <ol><li> Combinare 10 μl di tampone di reazione di DNA di 10x T4, 3 μL di ligasi del DNA di T4 (400 U / μL), 29 μl di p1 purificato e 29 μl di p2 purificato. Aggiungere ddH 2 O a 100 μL. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 2 ore o 16 ° C per una notte. </li><li> Purificare con un gel commerciale e un kit di pulizia PCR (vedi tabella dei materiali). Eluire in 10 μl di tampone di eluizione pre-riscaldato a 70 ° C in un blocco di riscaldamento (incubare colonna per 5 minuti prima della filatura). NOTA: tenere 1 μL in esecuzione su un gel in seguito. </li></ol></li><li> Eseguire i plasmidi non digeriti, i plasmidi digeriti e la legatura su un gel agarosico. Il prodotto di legatura dovrebbe avere una banda di peso molecolare superiore (circa 11 kb) rispetto a solo il plasmide digerito, indicando che la legatura ha avuto successo ( Figura 2b ).</li><li> Impostare T7 in vitro reazione di trascrizione. <ol><li> Combinare 10 μL di 2x ARCA / NTP Mix, 2 μL di miscela polimerasi T7 RNA e 8 μL di reazione di legatura purificata per un volume finale di 20 μL. NOTA: L&#39;ARCA incluso nel mix è un analogo di protezione che è incorporato esclusivamente nell&#39;orientamento corretto. Gli analoghi di protezione standard possono determinare solo il ~ 50% delle trascrizioni con un tappo nell&#39;orientamento corretto. </li><li> Incubare per 4 ore a 37 ° C. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA tramite uno spettrofotometro UV. Facoltativamente, eseguire un gel agarosante denaturante per confermare la lunghezza del trascritto RNA. </li></ol></li></ol> 4. Salvataggio del virus infettivo mediante elettroporazione <ol><li> Giorni prima dell&#39;elettropazione, preparare 1 pallone T182 di cellule Vero (tra T150 e T182 è accettabile, coltivato in DMEM + 10% siero fetale fetale (FBS)) per struttura da recuperare. Includi 1 T182 come un controllo di transforzione falsa. CeDeve essere utilizzato a confluenza del 70-80%. </li><li> Quando le cellule sono pronte, posizionare 12 mL / reazione di DMEM + 15% FBS + 10 mM HEPES in un bagno d&#39;acqua riscaldato a 37 ° C. </li><li> Staccare le cellule mediante trypsinizzazione con un protocollo standard e recuperare le cellule nel supporto con il 10% di FBS per inattivare la tripsina; Centrifugare le cellule a 150 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Le cellule di lavaggio in soluzione salina fosfato-tampone 1x (PBS), celle di pelleto a 150 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ripetere due volte questo passaggio per un totale di tre lavaggi. </li><li> Resuspendere le cellule in 200 μL di RPMI 1640 + 10 mM HEPES (sterile) per # campioni. Trasferire 200 μL di sospensione cellulare in un tubo sterile. Le cellule devono essere di ~ 0,5 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 20 μL di acqua (controllare la negazione negativa) o 20 μL di RNA (preferibilmente 5-10 μg) prodotta nel passaggio 3.4 ad ogni set di cellule. Mescolare delicatamente facendo scorrere il tubo e trasferire il contenuto del tubo in una cuvetta di elettroporazione di divario di 2 mm. </li><li> Impostare un elettrOporatore a 170 V LV, omega (resistenza) a 0 e 950 μF (circa 625 V / cm e 20 ms di tempo per altre macchine). Impostare la resistenza all&#39;impostazione più bassa disponibile, 0 o ∞ se disponibile. </li><li> Impulsi una volta e subito aggiungere 600 μL di DMEM +15% FBS +10 mM HEPES che è stato riscaldato nel passaggio 4.2. Sciacquare bene all&#39;interno della cuvetta per rimuovere tutte le celle. Aggiungere le cellule a un pallone di coltura tissutale T75 contenente 10 ml di supporto pre-riscaldato. Rimuovere i supporti aggiuntivi dalla cuvetta utilizzando il contagocce incluso nella cuvetta. Fare attenzione a mantenere la sterilità. </li><li> Tappo di turbolenza per mescolare i supporti e le cellule e collocare in incubatore a 37 ° C. </li><li> Controllare il giorno successivo per la vitalità delle cellule e farlo ogni giorno fino a quando il 50-75% della morte cellulare viene osservata. La morte cellulare viene osservata confrontando il controllo di elettroporazione. NOTA: L&#39;effetto citopatico ZIKV (CPE) è abbastanza pronunciato nelle cellule Vero, provocando cellule arrotondate che si staccano e galleggiano nel mezzo di coltura. abbiamoHa osservato una gamma di 8-10 giorni come ideale per la raccolta. </li><li> Raccogliere il supernatante in un tubo conico e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari a&gt; 3.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il supernatante chiarificato in un nuovo tubo e completare con una concentrazione finale del 20% di FBS (da 100% di azione). Inoltre, aggiungere HEPES sterile ad una concentrazione finale di 10 mM come agente tampone per preservare l&#39;infettività del virus mentre è congelato (da uno stelo sterile di 1 M). </li><li> Mescolare il virus mediante vortexing e l&#39;aliquota in flaconcini a vite. Conservare a -80 ° C per un utilizzo futuro. </li></ol> 5. Titolazione del virus recuperato <ol><li> Seguire il numero appropriato di piastre da 6 o 12 pozzetti di cellule Vero il giorno prima della titolazione. </li><li> Rimuovere il virus dal congelatore e fare serie di diluizioni 10 volte in DMEM + 2% FBS in tubi o piatti a 96 pozzetti. NOTA: Il titolo atteso da cloni recuperati è compreso tra 1 x 10 6 e 5 x 10 7 PFU / mL. </li><li> Aggiungi 200 oR 400 μL di ciascuna diluizione in duplice copertura a un pozzetto di una piastra da 12 o 6 pozzetti, rispettivamente. </li><li> Posizionare le piastre in incubatore a 37 ° C e scendere ogni 15 minuti per un periodo di adsorbimento di ~ 1-1,5 h. </li><li> Rimuovere l&#39;inoculo virale e aggiungere 1 ml di overlay di DMEM-Tragacanth a 12 pozzetti o 2 mL (6 pozzetti) ad ogni pozzetto. NOTA: è possibile utilizzare agarosio, agar, metilcellulosa o altri supporti di sovrapposizione qui. </li><li> Incubare le cellule in incubatore a 37 ° C per 5 giorni. Il tempo per una corretta formazione delle placche varia a seconda della sovrapposizione utilizzata. </li><li> Per fissare le celle, rimuovere le piastre dall&#39;incubatore e coprire decantamente in disinfettante. </li><li> Aggiungere un sufficiente 20% di etanolo / 0,1% di violetta di cristallo (CV) ad ogni pozzetto per coprire e turbare per mescolare. NOTA: Molti altri fissativi esistono e possono essere usati qui. Inoltre, se si utilizza una sovrapposizione di agarosio o di agar, è possibile utilizzare una seconda sovrapposizione in combinazione con il rosso neutro per visualizzare le placche senza fissaggio. L&#39;etanolo del 20% ha dimostrato di essereEfficace nell&#39;inattivazione dei virus avviluppati negli studi precedenti; Non utilizzare questa quantità per i virus non avvolti in quanto non saranno inattivati 19 . </li><li> Incubare le piastre per 30-60 minuti a temperatura ambiente (in un armadio di sicurezza di classe II); Scartare CV (secondo le normative locali) e lavare le piastre con acqua di rubinetto. </li><li> Lasciare le piastre per asciugare e contare manualmente le placche. NOTA: il riferimento 20 può essere utilizzato come riferimento aggiuntivo per eseguire test di placca. </li></ol>

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+amplifiable+multicopy+DNA+cloning+vehicles+derived+from+the+P15A+cryptic+miniplasmid.">Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid.</a> J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone.">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. 91 (1), (2017).</li><li>Roberts, P. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+inactivation+by+protein+denaturants+used+in+affinity+chromatography.">Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography.</a> Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).</li><li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+concentration+determination+through+plaque+assays:+using+traditional+and+novel+overlay+systems.">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> J Vis Exp. (93), e52065 (2014).</li><li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Characterization+of+Recombinant+Virus+Generated+from+a+New+World+Zika+Virus+Infectious+Clone.">Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone.</a> J Virol. , (2016).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drift+during+Systemic+Arbovirus+Infection+of+Mosquito+Vectors+Leads+to+Decreased+Relative+Fitness+during+Host+Switching.">Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse model and in mosquitoes. 
Due to the presence of cryptic bacterial promoters in flavivirus genomes3, full-length flavivirus clones are difficult to work with, commonly resulting in mutations, insertions, deletions or rearrangements in plasmids. We sought to alleviate these concerns by separating the ZIKV genome into two plasmids, disrupting the toxic sequences that are present in the viral NS1 gene. This resulted in a more stable system that is also amenable to incorporating changes. Using this clone system, we have introduced several point mutations in the ZIKV genome and inserted foreign sequences in the 3' UTR (data not shown). This system also provides an ideal starting point for studying genetic determinants of pathogenesis, construction of vaccine candidates and development of reporter viruses. Additionally, the clone-derived virus has proven to be an important tool for studying virus evolution22.
The methods described here can also be applied to new two-plasmid clone systems for other ZIKV strains or other flaviviruses, with some modifications. An important consideration for creating new virus clone systems using this approach is identifying a naturally occurring restriction enzyme site in the viral genome near the envelope-NS1 gene junction. If a suitable site cannot be found, then it is possible to generate one artificially via PCRmutagenesis. Alternatively, we have successfully rescued infectious virus by using Gibson assembly, if overlapping segments can be generated via restriction digestion (data not shown). Furthermore, it is necessary to include either a restriction enzyme cleavage site or a ribozyme sequence immediately downstream of the viral genome to ensure an authentic 3'UTR. 
By using a two-plasmid approach, we found that a stable and relatively straightforward cDNA clone system for ZIKV could be developed. The infectious virus recovered from the clone possessed wild-type characteristics in vitro and in vivo. Additionally, this approach can be adapted for any flavivirus, facilitating reverse genetics approaches for other relevant viruses.

Il virus Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) è un flavivirus dalle zanzare che è arrivato in Brasile nel 2013-14 ed è stato successivamente associato ad un massiccio focolaio di malattia febbrile che si è diffuso in tutte le Americhe 1 . Inoltre, ZIKV è stato collegato a gravi conseguenze della malattia, come la sindrome di Guillain-Barré negli adulti e la microcefalia nei feti e nei neonati 2 . Poco noto su ZIKV prima della sua diffusione rapida nell&#39;emisfero occidentale. Ciò comprendeva la mancanza di strumenti molecolari, ostacolando così la ricerca meccanicistica. Gli strumenti molecolari per i virus, come i cloni infetti cDNA, facilitano il vaccino e lo sviluppo terapeutico antivirale e consentono la valutazione dei fattori genetici virali correlati alla patogenesi virale differenziale, alla risposta immunitaria e all&#39;evoluzione virale. I cloni infettivi di Flavivirus sono noti per essere altamente instabili nei batteri dovuti alla crI promotori prokaryotici yptici presenti nei loro genomi 3 . Sono stati utilizzati diversi approcci per migliorare questo problema; Incluso l&#39;inserimento di ripetizioni tandem a monte delle sequenze virali 4 , la mutazione di sequenze 5 di promoter prokaryotiche presunte, suddividendo il genoma in plasmidi multipli 6 , vettori di numeri a bassa copia (compresi i cromosomi artificiali batterici) 7 , 8 e l&#39;inserimento di introni nel genoma virale 9 . Un sistema a tutta lunghezza senza modifiche è stato descritto per ZIKV; Tuttavia, questo clone sembrava essere attenuato nella coltura cellulare e nei topi 10 . Altri gruppi hanno introdotto gli introni nel genoma ZIKV, consentendo la distruzione di sequenze instabili nei batteri che possono essere splicate in cellule di mammiferi in vitro per la produzione di virus infettivo 11, 12 . Inoltre, un sistema basato su PCR intitolato Infectious-Subgenomic-Amplicons è stato usato con successo per salvare il prototipo MR766 ceppo di ZIKV 13 . L&#39;approccio qui descritto non richiede sequenze straniere, ma disturba il genoma nella regione di elevata instabilità usando plasmidi multipli, precedentemente impiegati con successo con la febbre gialla 6 , i dengue 14 , 15 e i virus del West Nile 16 . Inoltre, l&#39;aggiunta della sequenza ribozima di epatite D alle terminazioni genomiche virali facilita la creazione di un&#39;autentica 3 &#39;estremità senza la necessità di aggiungere un sito di linearizzazione. Inoltre, entrambi i plasmidi sono costruiti in un vettore di numero di copie basse (pACYC177, ~ 15 copie per cellula) per mitigare ogni tossicità residua 17 . Il virus recuperato mostra un profilo di crescita comparabile aVirus parenterale in curve di crescita in vitro in 8 linee cellulari comprendenti una varietà di tipi di cellule derivanti da entrambi i mammiferi e dagli insetti e ha mostrato identici profili patogeni nei topi e nelle infezioni, diffusione e velocità di trasmissione nelle zanzare 18 . Qui abbiamo un protocollo che descrive come coltivare i plasmidi infetti del clone, generare in vitro l&#39; RNA virale a piena lunghezza (il genoma virale) e recuperare il virus infettivo nella coltura cellulare. In primo luogo, descriviamo la propagazione di plasmidi in batteri o amplificazione senza batteri usando l&#39;amplificazione del cerchio di rotolamento (RCA). Successivamente, mostriamo come i due plasmidi vengono digeriti e successivamente legati insieme per generare virus a piena lunghezza. Infine, descriviamo la produzione di RNA trascritto e la sua successiva elettroporazione in cellule Vero, seguita da una titolazione del virus recuperato ( Figura 1 ). L&#39;approccio descritto è rapido, permettendo perR recupero di scorte di virus infettive in 1-2 settimane.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NEB Stable CompetentE. coli</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>C3040H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3138S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3131S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApaLI</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R0507S</td>
			<td>10,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3136S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HindIII-HF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>R3104S</td>
			<td>20,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra TempliPhi 100 Amplification Kit</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>25640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740609.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0371S</td>
			<td>1,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>10,000 units/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>400,000units/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 ARCA mRNA Kit</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2065S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECM 630 High Throughput Electroporation System</td>
			<td>BTX</td>
			<td>45-0423</td>
			<td>Other machines are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Miller)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3147</td>
			<td>Can be homemade as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0918</td>
			<td>Can be homemade as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Tubes</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>60818-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T182 flasks</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlas Biologicals</td>
			<td>FP-0500-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tragacanth Powder</td>
			<td>MP Bio</td>
			<td>MP 104792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Violet</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0528-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Denatured</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1156-1LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well plate</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing Oligos</td>
			<td>IDT</td>
			<td>see table 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Qubit 3.0</td>
			<td>other methods are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>other methods are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit RNA HS Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32852</td>
			<td>other methods are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Biosafety Cabinet</td>
			<td>Varies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is necessary for live-virus work.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue and characterization of recombinant virus from a new world zika virus infectious clone

I cloni infetti cDNA consentono la manipolazione genetica di un virus, facilitando così il lavoro sui vaccini, la patogenesi, la replicazione, la trasmissione e l&#39;evoluzione virale. Qui descriviamo la costruzione di un clone infettivo per il virus Zika (ZIKV), che attualmente sta causando uno scoppio esplosivo nelle Americhe. Per evitare la tossicità per i batteri che è comunemente osservato con i plasmidi derivati ​​da flavivirus, abbiamo generato un sistema a due plasmidi che separa il genoma al gene NS1 ed è più stabile di quelli a piena lunghezza che non possono essere recuperati con successo senza mutazioni. Dopo la digestione e la legatura per unire i due frammenti, l&#39;RNA virale a piena lunghezza può essere generato mediante trascrizione in vitro con T7 RNA polimerasi. Dopo l&#39;elettroporazione di RNA trascritto nelle cellule, è stato recuperato il virus che ha mostrato simili cinetica di crescita in vitro e fenotipi di virulenza e infezione in vivo nei topi e nelle zanzare rispettivamente.

Il protocollo qui descritto consente di recuperare il virus Zika derivato dal clone infettivo. La manipolazione del sistema clone infettiva a due plasmidi è semplice quando viene eseguita con cura, rispetto alle versioni a piena lunghezza che sono altamente instabili (dati non mostrati). Dopo la digestione e la legatura dei due pezzi distinti, il RNA ricoperto viene prodotto usando la trascrizione in vitro con la T7 polimerasi, che viene poi elettroporato in cellule Vero ( Figura 1 ). La corretta sequenza del plasmide può essere monitorata utilizzando la digestione di restrizione come proxy seguendo il miniprep ( Figura 2a ) e attraverso il sequenziamento di Sanger dopo una produzione su larga scala di DNA con RCA o maxiprep. Dopo la conferma dei cloni sequenziando, il recupero del virus infettivo richiede solo la digestione, la legatura, la trascrizione in vitro e, infine, l&#39;elettroporazione. Questi passaggi possono essere eseguiti in un giorno. Corretto digeLa stione e la legatura possono essere monitorate mediante elettroforesi a base di agarosio ( figura 2b ), consentendo la risoluzione dei problemi, se necessario. Come mostrato nella Figura 3 , il virus derivato dal clone infetto si replica a livelli simili come l&#39;isolamento parentale in vitro in più linee cellulari, suggerendo che il virus recuperato dal cDNA replica similmente all&#39;isolato primario. Inoltre, non sono state osservate differenze significative tra il virus derivato dal clone e l&#39;isolamento parentale nei tassi di sopravvivenza nei topi o nei tassi di infezione, diffusione e trasmissione nelle zanzare Aedes aegypti ( Figura 4 ). <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55857/55857fig1.jpg" /> Figura 1: Flusso di lavoro di salvataggio ZIKV da un clone cDNA a due plasmidi.Il genoma del ceppo ZIKV PRVABC59 è stato clonato in pezzi separati da due pezzi in un pacigeno plasmidico pACYC177. I due plasmidi sono stati poi digeriti e ligati con ligasi del DNA di T4. L&#39;RNA infetto da cappello è stato quindi prodotto mediante transcrizione in vitro seguita da elettroporazione in cellule Vero. (Figura adattata dal riferimento 21 ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55857/55857fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55857/55857fig2.jpg" /> Figura 2: Elettroforesi per monitorare la digestione e la legatura del clone cDNA. ( A ) La digestione iniziale di restrizione dei plasmidi derivati ​​da miniprep per valutare la stabilità genetica. ( B ) Esempi di prodotti di digestione e di legatura durante il recupero del virus infettivo dal sistema di clone a due plasmide. <a<html> Href = &quot;https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55857/55857fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55857/55857fig3.jpg" /> Figura 3: Cinetica di crescita in vitro del virus derivato dal clone. La cinetica di crescita del tipo selvatico PRVABC59 e del virus derivato del clone infettivo sull&#39;uomo (SH-SY5Y, Jar e NTERA2 cI.D1), la zanzara (C6 / 36, Aag2) e le linee cellulari primarie non umane (Vero) sono state valutate mediante un test di placca. N = 3 Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media. (Figura adattata dal riferimento 21 ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55857/55857fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 55857fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: Caratterizzazione in vivo del virus derivato dal clone nei topi e nelle zanzare. ( A ) i topi maschi e femmine di 4 settimane di interferone alfa, beta e gamma, AG129, sono stati inoculati per via intraperitoneale con 1.000 PFU di PRVABC59 o il virus derivato dal clone e monitorati nel tempo per la sopravvivenza (n = 11). Le zanzare Aedes aegypti sono state somministrate una farfalla infettiva contenente ZIKV e sezionata 14 giorni dopo. ( B ) I test di placca sono stati utilizzati per valutare corpi di zanzara (infezione), gambe (disseminazione) o secrezioni salivari (trasmissione) per il virus infettivo. Le tariffe sono presentate come percentuale delle zanzare totali che sono state testate (Figura adattata dal riferimento 21 ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55857/55857fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Questo protocollo descrive il recupero del virus infettivo da Zika da un clone infetto cDNA a due plasmide.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

rescue-characterization-recombinant-virus-from-new-world-zika-virus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Views.  Colorado State University.  Questo protocollo descrive il recupero del virus infettivo da Zika da un clone infetto cDNA a due plasmide. 

Video: Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizzazione virus Dengue attraverso Alexa Fluor Etichettatura

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in vivo are considered to be of the monocyte lineage2. Certain strains of MVV can replicate in other cell types, however3,4. The green fluorescent protein is a commonly used marker for studying lentiviruses in living cells. We have inserted the egfp gene into the gene for dUTPase of MVV. The dUTPase gene is well conserved in most lentivirus strains of sheep and goats and has been shown to be important in replication of CAEV5. However, dUTPase has been shown to be dispensable for replication of the molecular clone of MVV used in this study both in vitro and in vivo6. MVV replication is strictly confined to cells of sheep or goat origin. We use a primary cell line from the choroid plexus of sheep (SCP cells) for transfection and propagation of the virus7. The fluorescent MVV is fully infectious and EGFP expression is stable over at least 6 passages8. There is good correlation between measurements of TCID50 and EGFP. This virus should therefore be useful for rapid detection of infected cells in studies of cell tropism and pathogenicity in vitro and in vivo8.

We describe a molecular clone of maedi-visna virus that expresses GFP and is fully infectious. Replication of this virus can be detected by using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Di moltiplicazione e di Rilevamento di un clone infettive molecolare di Maedi-Visna Virus che esprime la proteina fluorescente verde

Maedi-visna virus (MVV) is a lentivirus of sheep, causing slowly progressive interstitial pneumonia and encephalitis1. The primary target cells of MVV in ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

Virus di Zika specifico diagnostico dell'epitopo Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Quantificazione di esaltazione anticorpo-dipendente del Virus in cellule umane primarie Zika

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...