記載されているプロジェクトは、JJM に健康科学の制服サービス大学からの資金によって支えられました。著者のプライベートなものは、意見またはアサーション記載する解釈として公式または反射防衛省、健康科学の制服サービス大学や米国の他の機関の見解ではないです。政府は。
WGV すべての実験を行いデータを分析JJM 設計し、試験を監督ニシコククジラ、JJM 紙を書いた。

ここで説明されたプロトコルを示すために使用する血清サンプルは評価・実験動物ケアの認定会で収容されたローカルの状態に従っての世話と連邦の方針であったアカゲザルから得られました。国際 (AAALAC)-施設を認定します。すべての動物実験したレビューし、機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され共有プロトコル組織のサンプルが買収されました。
1 日 1
注: 次の BSL 2 実験室での培養に使用される滅菌流バイオのキャビネットで説明すべての手順に従います。
<ol><li>室温で血清サンプルを解凍し、各血清試料 100 μ L を生殖不能の管に転送します。水浴または温度調整可能な thermomixer で 56 ° C で 30 分間熱を不活性化します。冷たい RPMI 10 (10% 牛胎児血清を RPMI) を使用して縮尺を 1:1 に至る血清サンプルの 10 倍のシリアル希薄を作る。</li>
	<li>滅菌 96 ウェル V 底プレートの各ウェルに 10 μ L の血清を希釈したサンプルを転送します。だけと、血清サンプルと RPMI 10 のみ RVPs と血清サンプルなしなし制御井戸、RPMI-10 RVPs との 2 つのセットが含まれます。各血清サンプルとトリプリケートで RPMI 10 コントロールを設定します。</li>
	<li>-80 ° C の冷凍庫と雪解けからデング熱 1、2、3、4 の RVPs を削除するそれらを 37 ° C の水浴。すぐに氷の融解の RVPs に転送します。各血清サンプルの約 170 μ L RVPs を取得 (各血清希釈用 RVPs x 3 井戸の 10 μ L (1:1、1:10, 1: 100, 1:1, 000) ごとに RVP を RPMI 10 RVPs x 3 井戸の 10 μ L は井戸を制御するだけと)。</li>
	<li>各血清サンプルを含む 96 ウェル V 底板のもと RVPs (血清ない) コントロール井戸を RPMI 10 に RVPs の 10 μ L をピペットします。RVPs RPMI 10 だけに (ない血清サンプルとない RVP) 井戸を追加しないでください。上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。10 μ l 添加冷 (ない血清サンプルとない RVP) 制御井戸のみ各冷たい RPMI 10 に RVPs の代わりに RPMI 10。</li>
	<li>96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO2の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。96 ウェル V 底プレートを培養すると、一方バイオ セーフティの 70% のエタノールでキャビネットの表面をきれいにし、15 分間紫外線を実行します。</li>
	<li>インキュベーターから K562 細胞の完全に合流 T75 フラスコを削除、5 mL の滅菌ピペットを使用してセルをミックスし、セルの 5 mL を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。 注: K562 細胞を RPMI 10 で維持し、1 x 106/mL で継代します。</li>
	<li>滅菌 15 mL の円錐管から 10 μ L のセルを削除することによって細胞の数を数えるし、10 μ L tryphan ブルー ミックスします。15 mL コニカル チューブ内のセルの合計数を決定するための診断を使用してセルをカウントします。</li>
	<li>10 分間 〜 1,200 x g で細胞と円錐形の 15 mL を遠心、上清をデカント、暖かい RPMI - 10 メディア (2.66 × 106セル/mL) の 80,000 のセル/30 μ L の濃度で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>インキュベーター (ステップ 1.6) から 96 ウェル V 底板を削除、96 ウェル V 底プレートの各ウェルに K562 細胞の 30 μ L を転送し、上下にピペッティングして徹底的にミックス 5-10 回。96 ウェル V 底プレートをインキュベーターに転送し、プレートを 5% CO2の存在下で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>1 時間インキュベート後 5 分のインキュベーターと 〜 1,200 × g で遠心分離から 96 ウェル V 底プレートを削除します。遠心分離の後に、10% の漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって井戸からメディアをデカントします。</li>
	<li>暖かい RPMI 10 125 μ L でそれらを再各ウェルの細胞を洗い、ピペット、徹底的に混ぜて、10% 漂白剤を含むコンテナーにプレートを逆さま回すことによって ~ 1,200 x g で 5 分間デカント メディアでプレートを遠心します。この洗浄ステップを 2 回繰り返します。</li>
	<li>洗浄後、それぞれに RPMI 10、上下をピペットで移しなさい、ミックス暖かいの 100 μ L を追加し、5% CO2の存在下で 37 ° C で 48 h 用プレートを孵化させなさい。</li>
</ol>2 日目 3
<ol><li>細胞とメディア/ウェル インキュベーターから 100 μ L を含む 96 ウェル V 底板を削除し、バイオ セーフティ キャビネットに移動します。ミックス、マルチ チャンネル ピペットを使用してそれぞれの内容もセルを転送し、96 ウェル U 底面にメディア プレート済みラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブ。</li>
	<li>1% の 100 μ L で 96 ウェル V 底プレートの各ウェルを洗浄パラホルムアルデヒド (PFA) リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) そして最終をもたらすステップ 2.1 から 96 ウェル U 底プレートまたはラベル付き 5 mL ポリプロピレン チューブにそれぞれの井戸に転送 × 1濃度 0.5 %pfa/ウェルまたは管。マルチ チャンネル ピペットを使用して徹底的にミックス、カバー プレート、アルミ箔を 30 分セルを修正するためのインキュベーター内に座らせてください。</li>
	<li>準備流れの cytometer (例えば材料のテーブルを見なさい) 無染色の K562 細胞側と前方散乱と蛍光設定のキャリブレーションを実行することによって。必要なだけ蛍光チャネルは、GFP は、細胞から放出される唯一の蛍光 FL1、です。取得 ~ 30, 000-50,000 各サンプルからの細胞します。 メモ: 単一蛍光を読み取ることができる任意の流れの cytometer は、RVPs 感染細胞が GFP の存在のために緑の蛍光を放出するのみ、他の蛍光チャネルを必要としない、データの集録に使用できます。</li>
</ol>3. データ分析
<ol><li>
流れフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して流れの cytometer で取得したデータを分析 (材料の表を参照してください)。
	<ol>
<li>セット最初のゲートは対 FSC H (前方散乱-高さ) を単一細胞分析12から自動蛍光ダブレットを含めたり除外する FSC A (前方散乱-エリア) に基づいています。その後、SSC A に基づいて一重項ゲート セルをゲート (側方散乱-エリア) vs される破片を除外する FSC の。</li>
		<li>SSC A 対 FSC A ゲート細胞を分析する SSC の対に基づく GFP の表現 GFP A.GFP 陽性細胞の周りにゲートを設定することによって各希釈血清とコントロール サンプルの GFP 陽性細胞の割合を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>帳票の井戸の GFP 陽性細胞の割合の合計を 3 で除して各血清サンプルの希釈やコントロール井戸の GFP 陽性細胞の割合の平均値を決定します。</li>
	<li>RVPs (血清サンプルはない) コントロール井戸を RPMI 10 の GFP 陽性細胞の割合の平均値で割った各希釈血清サンプルで GFP 陽性細胞の割合の平均値を割ることによって感染の倍充実を計算します。</li>
	<li>希釈 (x 軸)、対倍強化 (y 軸) をグラフし、多重比較のためのテューキー事後テスト続いて ANOVA を使用して統計分析を実行します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+exposure+to+zika+virus+significantly+enhances+peak+dengue-2+viremia+in+rhesus+macaques.">Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques.</a> Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).</li><li>Stettler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity,+cross-reactivity,+and+function+of+antibodies+elicited+by+Zika+virus+infection.">Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection.</a> Science. 353 (6301), 823-826 (2016).</li><li>Mattia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dengue+reporter+virus+particles+for+measuring+neutralizing+antibodies+against+each+of+the+four+dengue+serotypes.">Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes.</a> PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).</li><li>Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclass+specificity+of+the+Fc+receptor+for+human+IgG+on+K562.">Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562.</a> Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).</li><li>Klein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+K562+cell+line,+derived+from+a+patient+with+chronic+myeloid+leukemia.">Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia.</a> Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).</li><li>Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+growth+in+human+monocytes+as+a+risk+factor+for+dengue+hemorrhagic+fever.">Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever.</a> Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).</li><li>Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgG+Fc+receptor+II+mediates+antibody-dependent+enhancement+of+dengue+virus+infection.">Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection.</a> J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).</li><li>Wang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+antibodies+to+dengue+enhanced+for+FcgammaRIIIA+binding+determine+disease+severity.">IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity.</a> Science. 355 (6323), 395-398 (2017).</li><li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans.">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li><li>Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus-induced+antibody+response+enhances+dengue+virus+serotype+2+replication+in+vitro.">Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro.</a> J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).</li><li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies.">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine+reactive+dyes:+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry.">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+Cell+responses+during+secondary+dengue+virus+infection+are+dominated+by+highly+cross-reactive,+memory-derived+plasmablasts.">B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts.</a> J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).</li><li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus.">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

DENV や ZIKV などの発現は、両方の構造および非構造タンパク質13,14お互いと交差反応する抗体を生成する相同性の重要な証拠を共有します。これらの交差反応性抗体応答を高めるために示されている感染症の両方との in vitro異種血清または他関連発現1,2。クロスの感染を高める可能性のある病気を管理するため、ワクチンの開発に重大な意味があります。
基づく従来の培養の試金は血清の存在下で感染ライブ DENV と感染している非感受性細胞を使用します。感染症の強化は、標準的なプラクの試金11を使用して上清中のウイルスの量を定量化することで測定されます。この試金は 2 つのセルラインのウイルスの培養を必要とし、実行に大幅に長い期間が必要です。さらに、いないすべての DENV 血清型プラーク同様に、これらの試金に複雑さの別のレベルを追加します。
他のアッセイは、DENV 蛍光に分類された抗体を用いた細胞内染色を用いてセルラインの伝染を測定し、フローサイトメトリー9,10,14の流れによるプラークの試金のプロトコルを変更しました。基づくプラークと比べて感染のレベルを決定するために必要な時間を短縮このアッセイそこが一貫して動作するようにこれらのアッセイに必要な最適化ステップ数。細胞内のプロトコルを汚すは、固定し、細胞の構造の違いが細胞内染色続いて必要とよく滴定された DENV 特異的抗体血清型を判定することが明らかに時間がかかる。また、これらの試金はハイスループット フォーマットに簡単に従順ではない、測定内変動の高レベルに苦しみます。
上記説明アッセイとは対照的基づく DENV RVPs 試金は簡単にセットアップ、感染ウイルスを使用しない、血清の感染を高める可能性を測定するため容易に使用することができます高スループットに。また、この試金は労働集約的他のアッセイでは、現在の ADE の試金のプロトコル上の大きな利点を提供する 2-3 日以内完了することができます。原稿に記載されている分析検討 DENV-1、2 の感染を強化する ZIKV 感染血清の容量も 3 と 4 の血清型アッセイは実験の両方から血清を調べるに容易に適応することができから得られる臨床サンプルフラビ ウイルス感染症の他の細胞株と黄熱病ウイルス (YFV)、日本脳炎ウイルス (JEEV)、西ナイル ウイルス (WNV) RVPs がある場合など。ただし、背景を汚すことがなく細胞の最適な染色を許可する RVP、細胞/ウェル数と孵化の持続期間の量を滴定によって分析を最適化するために重要です。
滴定は、RVPs (たとえば、2.5 μ L、5 μ L、7.5 μ、10 μ、20 μ L 等)の可変ボリュームとターゲット セル (たとえば、80,000 K562 細胞またはテストされている細胞株) の定義された数の孵化によって実行する必要があります。定義されたセル数と得られた抗体を使用して、可変期間 (たとえば、24 時間、48 時間にわたってプロトコルで説明されているようにそれらをインキュベート、孵化の持続期間を定めることが各 RVPs の正しい力価を取得した後、 72 h 等)。
DENV 1:10 の希釈血清抗体による感染を検出する 10 倍希釈する必要があることを示唆しているすべて 4 血清型による感染の ADE を見ました。その一方で、他の研究は血清中の抗体の濃度が可能性が高すぎると体外ADE を検出する低希釈を必要とするを示す低い希釈で強化を報告しています。ADE 右血清サンプル中の抗体濃度に依存している、ほとんどのサンプルは原液血清よりも低い希釈で ADE を表示する可能性があります。
結論としては、この原稿で説明されたプロトコルは単純かつ簡単に導入、簡単に分析することができます高品質のデータを生成するためのスケール アップ高スループット スクリーニング期間短期間でサンプルの数が多いを有効にすることができ、解釈されます。

感染症の抗体依存強化 (ADE) は、ウイルスの血清型による部分的に交差反応性抗体がウイルス、高められたウイルスの複製とウイルス血症につながる他の血清型の取り込みを強化するというプロセスです。ADE は、広く 4 つの主要な血清型が流行しているデング熱ウイルス (DENV) 感染症に記載されています。患者のサブセット、ADE はデング出血熱 (DHF) に関連付けられています。ジカ ウイルス (ZIKV) の感染誘導 DENV ADE体外を引き起こし、DENV生体内でウイルス血症1の強化に貢献した DENV 交差反応性抗体の有意に高い値であることが最近分かった,2抗体依存強化試金、関連ウイルスの二次感染を強化とフラビ ウイルス感染症の発症機序に貴重な洞察力を提供し、通知に対する抗体の能力を評価する貴重なツール、。ワクチンの開発。
説明アッセイは、ここが感染症に通常許容 K562 細胞と一緒に DENV RVPs を使用します。RVPs が構造的にそのまま複製無能 DENV ウイルス粒子レプリケーション3の単一のラウンドの後に表示されるサブ ゲノム緑色蛍光タンパク質 (GFP) レプリコンをエンコードします。など、RVPs に感染している細胞は緑色の蛍光を発する、フローサイトメトリーや顕微鏡を使用して容易に検出することができます。この試金で使用される RVPs は、商業ソースから得られました。あってもいい、しかし、他のウイルスに対して生成され、本稿に記載されている試金で使用されます。一方、K562 細胞、抗体の Fc 領域に結合し、サブ中和抗体4、5の濃度の存在下で感染 FcγIII 受容体発現の白血病細胞株であります。
ADE の試金は体外ADE のメカニズムを記述する重症のデング熱の危険因子を調査し、研究で広く使用されている6,7,8。ここで説明した ADE アッセイ迅速かつ簡単に使える RVPs を使用して生体外で感染を強化し、フローサイトメトリー、現在、使用していずれかを必要とする他の試金と比較してプラーク形成による血清の容量を決定するにはVero 細胞や抗体の汚損の単位 (pfu) 感染細胞6,7,8,9,10、11、どちらも時間がかかり、労働集中的です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="794">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">DENV 1-4 RVP</td>
			<td style="width:139px;">Integral Molecular</td>
			<td style="width:119px;">RVP-501</td>
			<td style="width:323px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">K562 cells</td>
			<td style="width:139px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">RPMI</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">FBS</td>
			<td style="width:139px;">GE lifesceinces</td>
			<td style="width:119px;">SH 30910.03</td>
			<td>10% FBS in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">1670049</td>
			<td>100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HEPES</td>
			<td style="width:139px;">Cellegro</td>
			<td style="width:119px;">25-060-Cl</td>
			<td>0.025M in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7145</td>
			<td>1x in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:139px;">Cellegro</td>
			<td style="width:119px;">25-000-Cl</td>
			<td>1mM in RPMI-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25005CI&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sterile V-bottom plates</td>
			<td style="width:139px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">333-8001-01V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">60819-728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Non-sterile U-bottom plates</td>
			<td style="width:139px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">Ref 353910</td>
			<td>A high throughput alternative to FACS tubes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">5mL, sterile, serological pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P7127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200uL sterile pipette tips</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3020 CPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20uL sterile pipette tips</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">50-200uL multichannel pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3975-8-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">5-50uL multichannel pipette</td>
			<td style="width:139px;">Denville</td>
			<td style="width:119px;">P3975-9-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20% formadehyde</td>
			<td style="width:139px;">Tousimis</td>
			<td style="width:119px;">&#160;#1008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Water Bath</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">TSCOL35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">thermomixer</td>
			<td style="width:139px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000387</td>
			<td>An alternative to a waterbath for heat inactivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Liquid Bleach</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9724348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Flowjo 9.8</td>
			<td style="width:139px;">TreeStar, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACSDiva 6.1.2</td>
			<td style="width:139px;">Becton Dikinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">BD LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:139px;">Becton Dikinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:215px;">Liquid Bleach</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9724348</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple flow cytometry based assay to determine in vitro antibody dependent enhancement of dengue virus using zika virus convalescent serum

感染症の抗体依存強化は、デング熱ウイルスの病因の主要な役割を果たすことに示されています。許容されない細胞の感染を強化する抗体や血清の容量を測定する伝統的なアッセイは、感染を定量化するプラクの試金に続いてメディアにウイルスの出力を使用してに頼ってきました。最近では、これらの試金は細胞を蛍光標識抗体を用いたデング ウイルス (DENV) 感染症を検討しています。これらの両方のアプローチには、これらの技術の広範な使用を制限する制限があります。ここでは、粒子を用いたデング ウイルス記者ウイルス (RVPs) 緑色蛍光蛋白質及び DENV 感染アカゲザルから得られた血清を用いた抗体依存強化 (ADE) を調べる K562 細胞を表す単純の in vitroアッセイについて述べるニホンザル ジカ (ZIKV) 感染後 16 週間。この手法は信頼性が高く、セルの最小の操作が含まれます、ライブ レプリケーション有能なウイルスの使用を含まない、フローサイトメトリーを用いた定量的な読み出しを取得する高スループット形式で実行することができます。さらに、このアッセイは、黄熱病ウイルス (YFV) 日本脳炎ウイルス (JEEV)、西ナイル ウイルス (WNV) など RVPs の利用など他のフラビ ウイルス感染症の抗体依存強化 (ADE) を調べる簡単に適合できます。アッセイのセットアップのしやすさ、データを分析し、結果の解釈になりますほとんどの実験室の設定に

4 リーサス macaques、マカク属 ZIKV 感染後収集した 16 週間をされ、その潜在的な DENV 1 を強化するテストの血清、K562 細胞における感染の 2、3、4。動物では、感染後 7 日で検出限界以下であったレベルに低下した感染後 3 日目に 〜 105枚 ZIKV RNA/mL プラズマの x 1 のピーク血を持っていた。16 週間感染後の血漿中ウイルス血症が見つかりませんでした。RVP アッセイを行ったし、収集したデータを解析していた上記のプロトコルで説明するようします。
GFP 陽性細胞を識別するために使用されるゲートの戦略は、図 1のとおりです。初期のゲートが除外されるダブレットと FSC A 対 FSC H. に基づいて単一のセルのみを含めるに設定されました次のプロットは、単一セルの門からセルのみを示しています、ゲートがあった描画に基づいて SSC A 対 FSC のされる破片を除外します。ゲートこれら細胞が SSC の対に基づく第 3 のプロットに表示されます FL1 の GFP 陽性細胞を識別します。RVPs 感染細胞が GFP を表現し、GFP 陽性細胞の割合がこれらの細胞の周りのゲートの設定によって決定されました。GFP 陽性細胞の約 12.2% はない GFP 陽性細胞がコントロールのサンプルと比較して、ZIKV 感染血清サンプルで検出されます。このゲートの戦略はアッセイに含まれている各血清希釈とコントロール サンプルの後が続きます。
各サンプルの希釈およびコントロールのサンプル (図 1) 上記 GFP 陽性細胞の割合を測定しました。DENV 1 RVPs を用いた代表的な動物からのデータは、図 2のとおりです。ない血清サンプル 0.253 %gfp 陽性細胞を持っていたと比較して GFP 陽性細胞の割合が縮尺希釈で 0.022%、0.735% で 1: 100、1:10 で 12.8% 2.58% 原液のサンプル。サンプルの抗体濃度の減少により血清を希釈と GFP 陽性細胞の割合が変わります。
1:10 と比較していずれかの希釈原液サンプルやその他の希釈で GFP 陽性細胞率の劇的な増加を見ました感染によるウイルスの取り込みを高めるため最適な抗体濃度に関連付けられています、縮尺、1: 100 希釈抗体の感染の ADE を誘発するのに十分ではなかったことの低レベルがあったに対し、原液のサンプルが抗体の高い濃度を持っていたことを示唆しています。抗体濃度が著しく高い場合、血清の希釈を追加は、ADE が明らかになる希釈を決定するために含まれてになります。血清を調べた、1:10 の希釈で ADE を観察します。その一方で、ADE は、血清中の抗体濃度が非常に高い場合も低い希釈で観察します。
次に、血清・ コントロールなしの帳票の井戸の GFP 陽性細胞の割合の平均値と各希釈用帳票の井戸の GFP 陽性細胞の平均の割合で割って感染による倍を計算しました。動態 ade のに対して DENV-1、2、3 と 4 の血清型グラフ (図 3) x 軸 y 軸および血清の希釈に倍強化によって定められました。血清が 16 週間後感染症でかなり収集できるデータを示して強化 DENV 1 による K562 細胞、1:10 の希釈で 2、3、4 血清型の感染です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57371/57371fig1.jpg"> 図 1: フローサイトメトリーによる取得と分析のための戦略をゲーティングします。DENV RVPs 感染 K562 細胞流れの cytometer を用いて解析した GFP を表現します。(A)血清コントロールと(B) 16 週のポスト ZIKV 感染ない血清。セルされたによる前方散乱領域 (FSC A) vs 前方散乱高さ (FSH H) 後のダブレットを除外する側散布 (SSC-A) の対をゲート最初 FSC の破片を除外します。SSC A 対 FSC A ゲート細胞はあった SSC A 対 GFP A (緑の蛍光蛋白質-エリア) に基づく、ゲート。黒の四角形と楕円を表す、門と門の上の数字は、そのゲートの中に落ちる細胞の割合。FACS プロット間黒の矢印は、使用されているゲートのシーケンスを示しています。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57371/57371fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57371/57371fig2.jpg"> 図 2: 周波数 DENV RVP + の細胞を示す代表的なドット プロットします。DENV 1 RVPs に感染していた K562 細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定されました。16 週間後感染症で代表的なアカゲザルから収集した血清は DENV 1 RVPs 原液または、1:10、1: 100、および縮尺希薄で孵化され、ないコントロール血清と比較しています。各血清濃度で GFP 陽性細胞の割合が表示されます。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57371/57371fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57371/57371fig3.jpg"> 図 3: デング熱-1、2 の大幅な強化 3 と 4 の感染は 1:10 で観測された血清の希釈します。X 軸と y 軸に (ない血清サンプル コントロール) を基準にして倍強化にプロットの血清希釈 4 DENV 血清型のデング感染症の抗体依存強化調べた。4 ZIKV 免疫アカゲザルから 16 週間後に感染症は、この試金で使用された血清で収集。誤差範囲を表す標準誤差、* p を表す < 0.05。<a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57371/57371fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

デング熱ウイルス記者ウイルス粒子を用いたジカ ウイルス回復期血清による抗体依存による感染症を測定するためのシンプルで簡単なプロトコルについて述べる。

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

a-simple-flow-cytometry-based-assay-to-determine-vitro-antibody

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

8.7K ビュー.  Uniformed Services University. デング熱ウイルス記者ウイルス粒子を用いたジカ ウイルス回復期血清による抗体依存による感染症を測定するためのシンプルで簡単なプロトコルについて述べる。

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Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

免疫・感染学

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術<em&gt;インビトロ</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

ジカ特定診断エピトープの探索

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデングウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法