Gli autori ringraziano MICINN (PTA programma di sostegno Montserrat Porta de la Riva), AGAUR (Phd Fellowship a Laura Fontrodona), Instituto de Salud Carlos III (Miguel Servet programma di sostegno Julián Cerón), e Marie Curie IRG, ISCIII e IDIBELL per il finanziamento il laboratorio.

1. Protocollo A: Worms coltura per Bleaching 11 Popolazioni di C. elegans può essere ottenuto coltivando loro o in terreni liquidi o su supporti solidi in piastre. Di solito sono cresciuti su un solido NGM (Media crescita nematodi) e alimentate con E. coli, che si aggiungono alle piastre sia vivo o morto (ucciso da UV 12, dal calore o dal freddo 13 14). La procedura più comune utilizza dal vivo OP50 E. coli, che è carente nella sintesi di uracile e non possono proliferare in uno strato spesso che oscurerebbe i vermi. <ol><li> Mescolare 3 g di NaCl, 17 g di agar e 2,5 g di peptone e aggiungere 975 ml di H 2 O. Autoclave per 50 min. </li><li> Raffreddare il pallone a 55 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1 M CaCl 2, 1 ml di 5 mg / ml in etanolo colesterolo, 1 ml di 1 M MgSO 4 e 25 ml di 1 M KPO 4 tampone (tutti ma colesterolo precedentemente autoclavabilendr). </li><li> Utilizzando procedure sterili erogare la soluzione NGM in piastre di Petri; riempire piastre fino a 2/3 del loro volume. </li><li> Una volta asciutto, è opportuno lasciare le piastre a temperatura ambiente per 2-3 giorni prima dell&#39;uso per la rilevazione di contaminanti. Preparare una striscia di OP50 E. coli provenienti da uno stock di glicerolo (OP50 possono essere ottenute presso il Caenorhabditis Genetics Center). </li><li> Scegliere una singola colonia e crescere in LB notte a 37 ° C con agitazione. </li><li> Consentire eccesso di evaporazione dalle piastre rimuovendo il coperchio nel flusso laminare e aggiungere OP50 al centro delle piastre con una pipetta Pasteur sterile. </li><li> Lasciare che il E. OP50 prato coli di crescere durante la notte a temperatura ambiente oa 37 ° C per 8 ore. </li><li> Aggiungere la quantità desiderata di vermi alle piastre (se incubate a 37 ° C le piastre devono essere raffreddati a temperatura ambiente prima dell&#39;uso). </li></ol> TIPS: <ul><li> La colata della stessa quantità di mezzile piastre con una pipetta o un erogatore pompa assicura lo stesso volume di agar alle piastre e facilita lo spostamento della piastra, senza necessità di reindirizzare il stereomicroscopio. </li><li> Piastre (sia semi e non seminata con batteri) può essere utilizzato diverse settimane dopo preparata se conservata in un contenitore a temperatura ambiente o 4 ° C. </li><li> Evitare placcatura i batteri al bordo della piastra. Se il prato estende fino ai bordi della piastra dei vermi può strisciare i lati, asciugare e muoiono. </li><li> Worms vivono più a lungo se i batteri seminati sulle piastre sono già morti 15. </li></ul> 2. Protocollo B: Il trattamento con soluzione di ipoclorito alcalino (&quot;bleaching&quot;) 11 La tecnica sbiancante viene utilizzato per sincronizzare C. culture elegans nella prima fase larvale (L1). Il principio del metodo risiede nel fatto che i vermi sono sensibili alla candeggina mentre il guscio dell&#39;uovo e proteggembryos da esso. Dopo il trattamento con soluzione di ipoclorito alcalino, gli embrioni vengono incubati in mezzi liquidi senza cibo, che permette la schiusa, ma impedisce l&#39;ulteriore sviluppo. <ol><li> Lasciare vermi a crescere fino a stadio adulto. </li><li> Recupera adulti gravide a provette da 15 ml lavando piatti con tampone M9. </li><li> Vermi pellet mediante centrifugazione per 2 minuti a 400xg (~ 1500 rpm in una centrifuga da tavolo standard) a temperatura ambiente il surnatante. </li><li> Eseguire lavaggi 1-3 finché il buffer appare chiaro di batteri. </li><li> Aggiungere la soluzione desiderata sbianca (Tabella I) e agitare per alcuni minuti (distruzione del tessuto adulto devono essere monitorati sotto il microscopio da dissezione e la reazione ferma quando le tracce di adulti sono ancora visibili, che richiede in genere tra 3 e 9 minuti a seconda delle diverse questioni, come il volume del verme pellet, menzionato nella discussione) (Fig. 3). </li><li> Fermare la reazione aggiungendo M9 buffer per riempire il tubo. </li><li> Rapidamente centrifugare (poiché il trattamento può essere ancora attivo) per 1 minuto a 400 xg ed eliminare il surnatante. </li><li> Lavare a pellet altre tre volte riempiendo la provetta con il tampone M9. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone M9 al pellet, o mettere le uova a piastre NGM non teste di serie, e incubare alla temperatura desiderata con leggera agitazione. Aerazione adeguata dovrebbe essere fornita (Fig. 4). </li></ol> TIPS: <ul><li> Ci sono diverse soluzioni sbiancanti, scegliere quello che funziona meglio nelle vostre mani (Tabella 1, fig. 1). </li><li> Uova già previste sulle piastre possono essere recuperati dalla demolizione la superficie del agar con un materiale morbido, come un pezzo di una pellicola a raggi X. </li><li> Troppi resti di animali adulti, può compromettere la sincronizzazione poiché costituiscono un approvvigionamento di cibo per le larve di recente tratteggiato. </li><li> L&#39;aumento delle temperature un po &#39;accelerare lo sviluppo, che è scomodo if qualsiasi verme salta sincronizzazione perché la differenza di sviluppo tra vermi sincronizzate e sincronizzati sarà maggiore a temperature più elevate. </li><li> Soluzione di sbianca deve essere effettuata appena prima della sua utilizzazione. Inoltre, candeggina perde potenza dopo che è stato aperto per un po &#39;, in parte a causa della sua fotosensibilità. Si consiglia di aliquota ogni bottiglia nuovo in otri ambra piccoli per evitare la perdita e ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. </li></ul> 3. Protocollo C: Placcatura Worm <ol><li> Attendere tra 12 e 24 ore (tempo per completare sviluppo embrionale dipende dalla temperatura) è stata eseguita dopo sbiancamento e recuperare vermi mediante centrifugazione (2 minuti a 400 xg). </li><li> Gettare il surnatante, worm seme sulle tavole che sono necessarie e lasciare asciugare il liquido restante. </li><li> Posizionare le piastre alla temperatura richiesta. </li></ol> TIPS: <ul><li> Larve L1 in M9 tampone può essere mantenuto a 15 ° C a dondolo almeno per una settimana wiThout alterazioni evidenti. </li><li> fare attenzione nel calcolo i vermi si seme perché troppi può esaurire il cibo più velocemente del previsto e rovinare il vostro esperimento. Circa 500 L1 può raggiungere l&#39;età adulta in una piastra 55 mm, senza rimanere a corto di cibo. </li></ul> 4. Protocollo D: C. elegans osservazione D.1 Nomarski osservazione Interferenza differenziale microscopia ottica di contrasto è una tecnica di microscopia di illuminazione utilizzati per migliorare il contrasto non colorati in campioni trasparenti. Il Nomarski parola si riferisce al prisma utilizzato, il nome del suo inventore. Osservando gli animali vivi, siamo in grado di esaminare la fisiologia dell&#39;animale con le alterazioni soli derivati ​​da immobilizzazione. Inoltre, poiché non viene aggiunto fissativo, marcatori fluorescenti possono essere osservato in vivo. Questo fatto e la possibilità di marcatori fluorescenti fusione ad un gene di interesse perché sia ​​possibile seguire processi which la proteina di studio possono essere coinvolti. Utilizzando la tecnica descritta in questo protocollo, non solo i vermi vivi può essere osservato, ma possono anche essere recuperato e piastrate nuovamente. Agar preparazione pad (appena prima dell&#39;uso): <ol><li> Preparare agarosio 2% in acqua e si fondono. Mantenere fuso a 65 ° C. </li><li> Posizionare due vetrini con un pezzo di nastro su di essi su entrambi i lati di un terzo, vetrino pulito. </li><li> Usando una pipetta Pasteur luogo una goccia di agar sulla superficie pulita. </li><li> Coprire il agar con un altro vetrino pulito collocato su tre slitte perpendicolarmente. </li><li> Premere tal modo, l&#39;agar goccia è appiattita allo spessore dei distanziali a nastro. </li><li> Una volta che l&#39;agar si solidifica, estrarre delicatamente i vetrini nastrate e separare le due rimanenti diapositive facendo scorrere uno rispetto all&#39;altro. </li></ol> Montaggio animali vivi <ol start="7"><li> Porre una goccia (10 ul) di levamisole 1mm o di sodio azide 10-30 mm su tha centro del pad. </li><li> Di trasferire gli animali in calo con un pick worm. </li><li> Posizionare delicatamente il coprioggetto sugli animali e fissarlo su entrambi i lati con un po &#39;smalto o silicone. </li></ol> TIPS: <ul><li> Mantenere aliquote di agarosio 2% a 4 ° C. </li><li> Agarosio fuso può essere mantenuta a 65 ° C per almeno un giorno. </li><li> Nota: Levamisole è un agonista del recettore nicotinico che provoca la paralisi spastica dei muscoli 16. </li><li> Siate cauti, sodio azide è estremamente tossico! </li></ul> D.2 Etanolo fissazione e colorazione DAPI Il protocollo qui descritto rappresenta un modo veloce di tintura vermi con DAPI, tuttavia a causa della dissecation del worm alcune strutture possono presentare qualche alterazione. Ci sono molti altri metodi per fissare i vermi precedenti colorazione DAPI come la fissazione con la soluzione di Carnoy o formaldeide che meglio preservare l&#39;integrità del worm 17. Etanolo di fissaggio (modificato da 18) <ol><li> Inserire ~ 10 pl di tampone M9 (o acqua) su un vetrino da microscopio. </li><li> Utilizzando un worm scegliere attentamente trasferire 10-25 vermi alla goccia. </li><li> Utilizzando carta da filtro o di una micro-pipetta rimuovere il tampone M9 il più possibile, senza rimuovere i vermi o lasciarli asciugare. </li><li> Aggiungi ~ 10 pl del 90% di etanolo e lasciare asciugare. </li><li> Ripetere il punto 4 una o due volte. </li></ol> 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) colorazione <ol start="6"><li> Mescolare DAPI con i mezzi di montaggio desiderata ad una concentrazione finale di 2 ng / pl. </li><li> Una volta che l&#39;etanolo è completamente evaporato, si aggiungono 7 microlitri della DAPI: montaggio miscela media. </li><li> Posizionare un vetrino e fissarlo su entrambi i lati con un po &#39;smalto o silicone. I vetrini sarà pronto per l&#39;osservazione circa 5 minuti dopo l&#39;aggiunta di DAPI. </li></ol> TIPS: <ul><li> Il montaggio media contiene glicerolo, quindi una piccola quantità è sufficiente a coprire l&#39;intera preparazione. </li><li> Esiste una vasta gamma di supporti di montaggio commerciali (Fluoromount o prolungare, per esempio), la loro qualità e il prezzo dipenderà da quanto tempo si desidera memorizzare il vostro campione. </li><li> Attenzione, DAPI è un noto agente mutageno che si lega fortemente ad AT regioni ricche di DNA. </li></ul> Ricette Nematode Medio Crescita (NGM) 1,7% (w / v) Agar 50 mM NaCl 0,25% (w / v) Peptone 1 mM CaCl 2 5 pg / ml Colesterolo 25 mM KPO 4 1 mM MgSO 4 M9 tampone 22mm KH 2 PO 4 42 mM Na 2 HPO 4 86 mM NaCl 1 mM MgSO 4 Soluzioni di sbianca testato <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td> Ricetta # 1 </td><td> Ricetta # 2 </td><td> Ricetta # 3 </td><td> Ricetta # 4 </td><td> Ricetta # 5 </td></tr><tr><td> acqua (ml) </td><td> 2,75 </td><td> 3,5 </td><td> 0,5 </td><td> 0,5 </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> idrossido di sodio (ml) </td><td> 1,25 (1M) </td><td> 0,5 (5M) </td><td> 2,5 (1M) </td><td> 2,5 (2M) </td><td> 2,5 (1M) </td></tr><tr><td> ipoclorito di sodio ~~~V 4% (ml) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> totale (ml) </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr></tbody></table> Tabella I. ricette diverse soluzioni sbiancanti testato per questo articolo. Ricette # 3 e # 4 sono 2x, e devono essere aggiunti allo stesso volume di M9. Ricette per # 1, # 2 e # 5 sono stati riportati in precedenza 2, 11, 19. Le concentrazioni finali: # 1 NaOH 0.25M, NaOCl ~~~V 0,8%<html> , # 2 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0,8%, # 3 NaOH 0.625M, NaOCl ~ 1%, # 4 NaOH 1 M, NaOCl ~ 1,6%, # 5 NaOH 0.5M, NaOCl ~ 0,8%. 5. Rappresentativi risultati <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Confronto tra cinque diverse soluzioni sbiancanti in due tempi diversi di incubazione. Vermi N2 lavato due volte con M9 sono stati divisi in cinque provette da 15 ml coniche contenenti ciascuna soluzione sbiancante. I tubi sono stati agitati vigorosamente e 1 ml trasferito in una nuova provetta con M9 per arrestare la reazione dopo il tempo specificato. Dopo lo sbiancamento vermi procedura sono stati incubati con 1 ml di M9 a 20 ° C per 24 ore. In ogni caso, inferiore a foto è stata scattata subito dopo il candeggio, figura in alto dopo 24 ore. _upload/4019/4019fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. Temperatura di soluzione di sbianca influenza l&#39;efficacia del trattamento. Volumi uguali di vermi N2 sono stati sbiancata con la stessa soluzione sbianca sia precedentemente raffreddata su ghiaccio per 20 minuti e mantenuta a 25 ° C per lo stesso tempo. Le due colonne sulla sinistra mostrano le immagini subito dopo lo sbiancamento. Dopo trattamento vermi sono state incubate in provette da 15 ml coniche con 1 ml di M9 a 20 ° C per 24 ore. Colonne sulle immagini sul display di destra 24 ore dopo. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Il rapporto verme pellet: tempo di incubazione ipoclorito alcalino influenza l&#39;efficacia del trattamento microlitri 50, 100, 250 e 500 della vite senza fine pellet sono stati incubati con 2 ml di soluzione di sbianca # 3 per 3 minuti, 6 e 9.. L1, gli embrioni nati morti e resti di frammenti adulti sono stati quantificati dopo incubazione a 20 ° C per 2<html> 4 ore in 15 ml provette coniche con 1 ml di tampone M9. Circa tre confluenti 55 mm con piastre di vermi adulti sono necessari per ottenere un 100 pl verme pellet. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La corretta aerazione è necessario per la schiusa e la sopravvivenza di C. embrioni elegans. pellet A 100 pl di vermi N2 sono stati sbiancata per 6 minuti e incubate in provette da 15 ml coniche con 1 ml, 5 o 10, come specificato, di M9 a 20 ° C per 24 ore. La parte superiore della figura mostra le immagini delle culture dopo 24 ore, ove le frecce indicano che le uova si schiudono non. Nella parte inferiore, vi è un grafico che illustra la quantità di larve (grigio chiaro) ed embrioni morti (grigio scuro) 48 ore dopo lo sbiancamento alle condizioni indicate. tp_upload/4019/4019fig5.jpg &quot;alt =&quot; Figura 5 &quot;/&gt; Figura 5. Ciclo di vita di C. elegans. uno. Durata approssimativa dei vermi nelle diverse fasi. Ore necessarie per raggiungere ogni fase in funzione della temperatura (modificato da 20). B. Nomarski (in alto) e DAPI (in basso) le immagini di vermi diversi nelle fasi di sviluppo indicati. Caratteristiche più significative di ogni fase vengono ingranditi L1: freccia indica i precursori della gonade somatica e linea germinale precoce L4: freccia nera (Nomarski) indica la vulva di sviluppo; frecce bianche (DAPI) indicano i due bracci Mid-gonadici... tardo L4: freccia indica la vulva sviluppando la cosiddetta fase di albero di Natale adulti giovani:. freccia nera indica un embrione all&#39;interno dell&#39;utero, Arrowhead punti al spermateca, freccia bianca indica un ovocita Gravid adulto:. Arrowhead (DAPI) sottolinea embrioni fecondati. Arrow in DAPI immagine indica spermateca. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Morfologia Vulva a L3, L4 e stadi adulti. Nella fase L3 solo un piccolo lume dove viene formata la vulva può essere osservato. A L4, questo lume espande formando il cosiddetto &quot;albero di Natale&quot;. Nell&#39;adulto la vulva è già chiuso. Le linee gialle indicano la posizione della vulva in queste tre fasi. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Colorazione DAPI a L3, L4 precoce, stadi più avanzati L4 e adulti. A L3, linea germinale è allungata. A L4, gonadi armi presenti a forma di U morfologia. Al fine-L4 spermatozoi stadio può essere osservato nella parte distale della gonade. Giovani Adulti presenti ovociti. La linea germinale Adult presenta ovociti ed embrioni. Le linee gialle delimitano linee germinali a thle e diverse fasi indicate. <img src="/files/ftp_upload/4019/4019fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. C. sviluppo elegans a 15 e 25 ° C. I vermi N2 erano sbiancata, incubate per una notte in M9 e agitazione a 15 ° C, trasferito a piatti e coltivate i tempi indicati alle temperature indicate.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Nematode sincronizzazione Varie soluzioni sono state descritte sbianca. Abbiamo provato cinque diverse ricette (Tabella I) e, nelle nostre mani, non hanno mostrato differenze significative nella sincronizzazione delle popolazioni a vite senza fine (Fig. 1). Tuttavia, i nostri esperimenti ha dimostrato che parametri quali la temperatura (Fig. 2), la soluzione rapporto di sbianca: volume di vermi (Fig. 3) e il volume di M9 con cui gli embrioni sono incubate per cova (Fig. 4) interessano la sopravvivenza dei vermi, è correlata ad una corretta aerazione della cultura. Nelle nostre condizioni di agitazione, mentre in un tubo 15 ml di un volume di 1 ml permette sopravvivenza di tutti i vermi, un volume di 5 ml è già troppo per consentire schiusa delle uova corretta e comparabile al volume massimo di 15 ml (non mostrato) . C. elegans per lo sviluppo Durante il suo sviluppo, <em&gt; C. elegans passa attraverso quattro stadi larvali (Fig. 5) prima dello stadio di adulto. La linea germinale è un buon indicatore dello stadio di sviluppo del C. elegans. Il modo più semplice caratteristica di C. elegans sviluppo che può essere osservato sotto ottica Nomarski è lo sviluppo della vulva, che inizia a formare in fase precoce L4. Dapprima, solo una piccola lume si osserva, che si espande in seguito alla cosiddetta &quot;albero di Natale&quot; forma, entro la metà-fine L4. Infine, alla fine del L4 della vulva chiude (Fig. 6). D&#39;altra parte, la colorazione DAPI permette l&#39;osservazione dello sviluppo della gonade. Dai quattro celle L1 al gonade cellule in divisione e allungamento in L2 e L3. A L3 le cellule punta distale può essere osservato, iniziando a migrare dorsalmente. Meiosi inizia anche alla fine del L3. A L4 cellule punta distale raggiungere la loro posizione definitiva e le cellule germinali si differenziano per lo sperma. Entro la fine del L4 produzione di sperma finisce e inizia la produzione degli ovociti. In adult embrioni vermi possono essere osservati nelle dell&#39;utero (Fig. 7). Lo sviluppo e la temperatura C. elegans si sviluppa ad un ritmo diverso a seconda della temperatura: mentre ci vogliono circa 90 ore dal momento in cui è prevista l&#39;uovo fino a quando il nuovo worm inizia a deporre le proprie uova a 15 ° C, 45 ore sono sufficienti, se coltivate a 25 ° C (Fig. 6). Lo studio del tasso differenziale di sviluppo a temperature diverse porta alla relativa flessibilità nella creazione di condizioni e l&#39;esecuzione di esperimenti. Inoltre, esso offre la possibilità non solo di controllare gli effetti di un particolare trattamento o alterazione (per esempio alleli sensibili alla temperatura), ma anche di stabilire le migliori condizioni in cui effettuare un particolare esperimento.

basic caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation

La ricerca sulla biologia molecolare e dello sviluppo del nematode Caenorhabditis elegans è iniziata nei primi anni settanta da Sydney Brenner e da allora è stato ampiamente utilizzato come organismo modello 1. C. elegans possiede attributi chiave come la semplicità, la trasparenza e il breve ciclo di vita che ne hanno fatto un adeguato sistema sperimentale per studi biologici di base per molti anni 2. Scoperte di questo nematode avere vaste implicazioni, perché molti processi cellulari e molecolari che controllano lo sviluppo degli animali sono soggetti ad evoluzione conservate 3. C. elegans ciclo di vita passa attraverso uno stadio embrionale e quattro stadi larvali prima che l&#39;animale raggiunge l&#39;età adulta. Lo sviluppo può prendere da 2 a 4 giorni a seconda della temperatura. In ciascuno dei diversi stadi tratti caratteristici possono essere osservati. La conoscenza della sua linea cellulare completo di 4,5 insieme al annotat profondaione del suo genoma trasformare questo nematode in un grande modello in campi diversi come la neurobiologia 6, l&#39;invecchiamento 7,8, biologia delle cellule staminali 9 e biologia linea germinale 10. Una caratteristica aggiuntiva che rende C. elegans un modello attraente per lavorare con la possibilità di ottenere popolazioni di vermi sincronizzati in una fase specifica attraverso un protocollo di relativamente facile. La facilità di manutenzione e di moltiplicazione questo nematode aggiunta alla possibilità di sincronizzazione fornire un potente strumento per ottenere grandi quantità di vermi, che possono essere utilizzati per una varietà di piccoli esperimenti o ad alta resa come schermi RNAi, microarrays, sequenziamento di massa, immunoblot o ibridazione in situ, tra gli altri. A causa della sua trasparenza, C. elegans strutture possono essere distinti sotto il microscopio usando microscopia interferenza differenziale contrasto, noto anche come micro Nomarskicopiare. L&#39;impiego di un legante DNA fluorescente, DAPI (4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo), per esempio, può portare alla identificazione specifica e la localizzazione delle singole celle, così come le strutture subcellulari / difetti ad essi associati.

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Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

La facilità di mantenere e diffondere il nematode<em&gt; C. elegans</em&gt; Ne fanno un organismo modello bello lavorare con. La possibilità di vermi sincronizzazione consente di lavorare con una quantità significativa di soggetti alla stessa fase di sviluppo, che facilita lo studio di un processo particolare in molti animali.

Di base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metodi: sincronizzazione e di osservazione

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

basic-caenorhabditis-elegans-methods-synchronization-and-observation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

46.1K Views.  Bellvitge Institute for Biomedical Research. La facilità di mantenere e diffondere il nematode C. elegans Ne fanno un organismo modello bello lavorare con. La possibilità di vermi sincronizzazione consente di lavorare con una quantità significativa di soggetti alla stessa fase di sviluppo, che facilita lo studio di un processo particolare in molti animali.

Video: Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Ricerca

Biologia

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro Attivazione di Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solida piastra a base di restrizioni alimentari, Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ease of growth and small size. This small size, though, has disallowed a number of technical approaches found in other model systems. For example, blood transfusions in mammalian systems and grafting techniques in plants enable asking questions of circulatory system composition and signaling. The circulatory system of the worm, the pseudocoelom, has until recently been impossible to assay directly. To answer questions of intercellular signaling and circulatory system composition C. elegans researchers have traditionally turned to genetic analysis, cell/tissue specific rescue, and mosaic analysis. These techniques provide a means to infer what is happening between cells, but are not universally applicable in identification and characterization of extracellular molecules. Here we present a newly developed technique to directly assay the pseudocoelomic fluid of C. elegans. The technique begins with either genetic or physical manipulation to increase the volume of extracellular fluid. Afterward the animals are subjected to a vampiric reverse microinjection technique using a microinjection rig that allows fine balance pressure control. After isolation of extracellular fluid, the collected fluid can be assayed by transfer into other animals or by molecular means. To demonstrate the effectiveness of this technique we present a detailed approach to assay a specific example of extracellular signaling molecules, long dsRNA during a systemic RNAi response. Although characterization of systemic RNAi is a proof of principle example, we see this technique as being adaptable to answer a variety of questions of circulatory system composition and signaling.

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

The model organism C. elegans uses pseudocoelomic fluid as a passive circulatory system. Direct assay of this fluid has not been previously possible. Here we present a novel technique to directly assay the extracellular space, and use systemic silencing signals during an RNAi response as a proof of principle example.

Isolamento del Vampiro di liquido extracellulare da<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Combinato di nucleotidi e proteina estrazioni in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificazione e analisi di Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...