Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation per IOS-1256565 e IOS-1557638 a AWS. Ringraziamo Patricia Wittkopp e tre anonimi recensori per i loro commenti utili su una versione precedente di questo articolo.

1. Montaggio del campione NOTA: Conservare le mosche morte in etanolo al 70% in acqua prima dell&#39;immagine. <ol><li> Versare 10 ml di agar 1,25% agar disciolto in acqua bollente in un piatto di Petri da 60 mm x 15 mm e lasciarlo impostare. </li><li> Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare una coppia di pinze a punta fine per fare una scanalatura di 20 mm, una scanalatura profonda di 2 mm di profondità da 1 mm sulla superficie del gel. Utilizzando pinze fine, incorporare il lato ventrale di un mosca adulto nella scanalatura, con il lato dorsale della mosca che proietta sopra il gel. NOTA: L&#39;allentamento del gel consente un semplice riposizionamento senza danneggiare il campione. La stessa scanalatura può essere usata per più esemplari, anche se diventa sporca, spezzata e inutilizzabile nel tempo. L&#39;utente può quindi eseguire un&#39;altra scanalatura nello stesso gel. Ogni piastra può essere usata per immagini ~ 200 mosche. </li><li> Completamente coprire il campione in etanolo al 70% in acqua per ridurre le riflessioni della luce dalla cuticola cerosa e per evitare danni alle ali duranteManipolazione dei campioni. </li></ol> 2. Impostazione del microscopio NOTA: Le immagini vengono acquisite utilizzando un campo di dissezione, una base di luce trasmessa, una fotocamera digitale e una fonte di luce fredda a gooseneck collegata ad un computer che esegue il software di acquisizione di immagini. Le istruzioni del software sono specifiche di Micro-Manager v1.4.20 44 , che è un software open source che incorpora ImageJ 45 . <ol><li> Accendere il microscopio, la fotocamera digitale, la fonte di luce fredda a doppio fascio e il computer. </li><li> Esegui il software di acquisizione delle immagini per aprire una finestra Micro-Manager e una finestra ImageJ. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;Image&quot;&gt; &quot;Type&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot; per impostare tutte le immagini come 8 bit. Fai clic su &quot;live&quot; nella finestra Micro-Manager per aprire una finestra &quot;Snap / Live&quot; che mostra un&#39;anteprima in tempo reale dalla fotocamera. <ol><li> Massimizza la dimensione della finestra &quot;Snap / Live&quot; se nesario. Selezionare &quot;Scala di grigi&quot; nel menu &quot;Modalità di visualizzazione&quot; a discesa nella scheda &quot;Contrasto&quot; della finestra Micro-Manager. </li></ol></li><li> Accendere la fonte di luce fredda fino alla sua massima intensità e posizionare le punte di ciascun collo a circa 120 mm dalla fase, una sulla sinistra e una sulla destra. NOTA: Gli utenti possono anche utilizzare un illuminatore anulare, anche se questo può generare un anello di luce riflessa attorno all&#39;addome mosca. </li><li> Impostare manualmente l&#39;ingrandimento del microscopio a 60x in modo che il campo visivo cattura una superficie di circa 3 mm sul palco. </li><li> Posizionare un micrometro di fase a 2 mm sul palco (passando lo sfondo a bianco, se necessario). Mentre guardi l&#39;anteprima dal vivo, concentrarsi sul micrometro di fase e regolare l&#39;esposizione nella finestra Micro-Manager immettendo il tempo di esposizione in ms nella casella &quot;Esposizione&quot;. </li><li> Per calibrare la fotocamera spazialmente, selezionare lo strumento &quot;linea retta&quot; in tLui ImageJ finestra e disegnare una linea la lunghezza del micrometro di fase. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;Analizza&quot;&gt; &quot;Imposta scala&quot; per aprire la finestra &quot;Imposta scala&quot;, inserire la lunghezza del micrometro in μm nella casella &quot;Distanza nota&quot; e immettere &quot;μm&quot; nell&#39;unità di &quot;lunghezza&quot; scatola. <ol><li> Vedere che la finestra &quot;Imposta scala&quot; visualizza la scala in &quot;pixel / μm&quot;. Prendi nota della scala e fai clic su &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Nella finestra &quot;Snap / Live&quot;, fare clic su &quot;Stop&quot; e poi su &quot;Snap&quot; per catturare un&#39;immagine del micrometro di fase. </li><li> Salvare l&#39;immagine come una TIFF in scala di grigi a 8 bit per garantire la possibilità di calibrare spazialmente le immagini, se necessario. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;File&quot;&gt; &quot;Salva con nome&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; Specificare dove salvare il file nel file browser, denominare il file e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Commutare il palco in nero e postoUn piatto di Petri che tiene una mosca montata in agar (punti 1.1-1.2) sul palco. </li><li> Guardate attraverso il microscopio e posizionate la mosca per assicurare che la linea mediana dorsale sia dritta per vedere meglio il pattern di pigmentazione. Spostare le ali e le appendici per assicurare che la vista dell&#39;addome non sia ostacolata. Se la cuticola pigmentata (a2-a5) non è visibile, estrarre lateralmente l&#39;addome fino a quando non è (anche se l&#39;addome delle mosche è conservato in etanolo al 70% in acqua, quindi questo non è di solito necessario). NOTA: quando si posiziona la mosca, potrebbe essere necessario utilizzare un ingrandimento inferiore (20X). L&#39;ingrandimento deve essere restituito a 60X prima di procedere. </li><li> Messa a fuoco manuale sull&#39;addome dorsale della mosca. Regolare manualmente le punte della sorgente luminosa per ridurre al minimo le ombre e la riflessione sull&#39;addome dorsale. </li><li> Guardando l&#39;anteprima dal vivo sullo schermo del computer e utilizzando l&#39;istogramma del valore di pixel nella scheda &quot;Contrasto&quot; della finestra Micro-Manager,Regolare l&#39;esposizione come descritto nel punto 2.4 per massimizzare l&#39;intervallo di valori dei pixel dell&#39;immagine di anteprima. </li><li> Rimuovere il piatto di mosca e Petri e sostituirli con un LED (uscita spettrale di 430-660 nm) collegato ad un contatore di tensione, centrato nel campo visivo nella stessa posizione del mosca. Utilizzare il misuratore di tensione e LED come misuratore di luce 46 e registrare la tensione generata dalla luce che colpisce il LED (~ 125 mV). NOTA: il LED e il contatore di tensione vengono utilizzati per garantire che i livelli di luce siano costanti in sessioni di imaging multiple in un singolo esperimento. </li><li> Per la durata dell&#39;esperimento, non modificare ulteriormente la posizione o l&#39;intensità della sorgente luminosa, l&#39;ingrandimento del microscopio o l&#39;esposizione della fotocamera. </li></ol> 3. Esemplare Imaging <ol><li> Posizionare un piatto di Petri in possesso di una mosca montata in agar (punti 1.1-1.3) sullo stadio del microscopio nero. Regolare la posizione del mosca in modo che il terzo e quattroH segmenti addominali sono visibili e la linea mediana dorsale è dritta, come descritto al passaggio 2.9. Assicurarsi che l&#39;ingrandimento sia a 60x prima di procedere. </li><li> Messa a fuoco manuale il microscopio in modo che il terzo e il quarto terzitomi addominali dorsali siano a fuoco. Utilizzare il software di acquisizione di immagini per acquisire un&#39;immagine come un TIFF in scala di grigi a 8 bit, come descritto nel passaggio 2.6. NOTA: L&#39;immagine può essere acquisita a colori e successivamente convertita in scala di grigi per l&#39;analisi. </li><li> Salvare l&#39;immagine come &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;, come descritto nel punto 2.7. NOTA: qui [SESH] è costante, [000] è il numero della sessione ed è variabile ma deve essere di tre cifre e [sampleID] è qualunque cosa desideri, anche se non deve contenere caratteri di sottolineatura (_) aggiuntivi Deve essere di lunghezza costante. [SampleID] dovrebbe includere dettagli sui fattori utilizzati nell&#39;analisi dei dati di pigmentazione ( ad esempio, temperatura o linea di origine), separati da un carattere non-alfabetiCarattere cal, come un trattino (-). Ciò consente a questi fattori di essere facilmente analizzati da [sampleID] usando un software statistico standard. </li><li> Rimuovere il piatto di Petri dal palco e sostituire la mosca con il prossimo campione. Ripetere i passaggi 3.1-3.3 finché tutti gli esemplari non sono stati riprodotti, senza aggiustare ulteriormente i livelli di illuminazione, l&#39;ingrandimento o l&#39;esposizione. </li></ol> 4. Imaging in diverse sessioni <ol><li> Se le immagini devono essere assunte in più sessioni, mantenere l&#39;intensità della luce, l&#39;esposizione e l&#39;ingrandimento in tutte le sessioni. All&#39;inizio di ogni sessione, controllare la calibrazione spaziale della fotocamera (punto 2.4) e l&#39;intensità della luce sul palco (misurata con il LED / tensione, punto 2.12). </li><li> Cattura e salva un&#39;immagine del micrometro di fase (passaggi 2.5-2.7) per garantire la possibilità di calibrare spazialmente le immagini, se necessario. </li><li> Utilizzare almeno 15 esemplari di controllo e riesaminarli in modo casuale in ogni sessione allo alloW per la rilevazione e l&#39;eliminazione degli effetti di sessione. Assicurarsi che i campioni di controllo duplicati tra le sessioni hanno lo stesso [sampleID] ma diversi [SESH000]. NOTA: i campioni di controllo sono le mosche raccolte, memorizzate e montate in modo identico a campioni sperimentali, ma vengono riprogettati in sessioni. Il numero preciso degli esemplari di controllo dipenderà dall&#39;installazione sperimentale dell&#39;utente. Vedere la discussione per ulteriori dettagli. </li></ol> 5. Analisi delle immagini NOTA: L&#39;analisi delle immagini è condotta in ImageJ 45 e utilizza la macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot;, fornita come file aggiuntivo. <ol><li> Posiziona tutte le immagini da analizzare nella stessa cartella. </li><li> Avviare ImageJ e eseguire la macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; facendo clic su &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Esegui&quot;, selezionando &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; nel browser del file e facendo clic su &quot;Aperto.&quot; NOTA: tutti i passaggi successivi sono all&#39;interno della macro. Ogni passo è un comando macro singolo. </li><li> Si noti che viene aperta una finestra di dialogo &quot;Action Required&quot; che indica &quot;Scegli la cartella in cui sono memorizzate le immagini&quot;. Fai clic su &quot;OK&quot; e utilizza il browser file per selezionare la cartella contenente le immagini e quindi fare clic su &quot;scegli&quot;. </li><li> Si noti che una finestra di dialogo &quot;Azione richiesta&quot; verrà aperta, indicando &quot;Scegli la cartella in cui si desidera memorizzare i dati&quot;. Fare clic su &quot;OK&quot; e utilizzare il browser file per selezionare la cartella desiderata per salvare i profili di pigmentazione. Fai clic su &quot;scegli&quot;. </li><li> Notare che verrà aperta una finestra di dialogo che chiede &quot;quanti caratteri nel tuo ID campione&quot;? Nella casella di immissione dati, immettere il numero di caratteri in [SampleID], come specificato al passaggio 3.3, e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Notare che verrà aperta una finestra di dialogo che chiede &quot;Quanto è largo il ROI?&quot; Nella casella di immissione dati, immettere la larghezza dei pixel dell&#39;anteriore-Striscia posteriore lungo la quale deve essere letto il profilo di pigmentazione (rettangolo verde, figura 1G , figura 2A e 2A &#39;). Fare clic su &quot;OK&quot;; Il valore predefinito è di 20 pixel. NOTA: Il profilo di pigmentazione viene letto attraverso una striscia di cuticola, piuttosto che una linea, per ridurre il rumore dovuto a peli e setole. La larghezza di questa striscia dipenderà dalla risoluzione dell&#39;immagine, ma dovrebbe essere ~ 1/20 della larghezza dell&#39;addome, in pixel. </li><li> Si noti che la macro apre l&#39;immagine del primo volo e una finestra di dialogo chiede se misurare la mosca corrente (fare clic su &quot;Sì&quot;) per passare alla prossima mosca (fare clic su &quot;No&quot;) oppure per uscire dalla finestra Macro (fare clic su &quot;Annulla&quot;). </li><li> Si noti che verrà aperta una finestra di dialogo che indica &quot;Definire la linea mediana dell&#39;addome dorsale, da ANTERIOR a POSTERIOR&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dall&#39;anteriore al posteriorePer definire la linea mediana dell&#39;addome dorsale. Fare clic su &quot;OK&quot;; Vedi figura 2A e 2A &#39;, linea gialla. NOTA: viene utilizzato per riorientare l&#39;immagine in modo che la linea mediana dorsale sia orizzontalmente sullo schermo, con l&#39;anteriore a sinistra, facendo più facilmente i passaggi successivi. </li><li> Si noti che verrà aperta una finestra di dialogo che indica &quot;Definire il bordo POSTERIOR di Tergite 4 appena dietro la fascia di pigmento&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dal bordo della mediana posteriore al bordo laterale destro, in modo tale che il centro della linea (contrassegnato da un quadrato bianco) sia posteriormente posizionato sul bordo posteriore della banda di pigmento (cuticola a5). Fai clic su &quot;OK&quot;; Vedere la Figura 2A e 2A &#39;, linea magenta. NOTA: lo script R rileverà automaticamente il bordo posteriore della fascia di pigmento dal profilo di pigmentazione. </li><li> Si noti una finestra di dialogoSi apre la scritta &quot;Definire il bordo ANTERIOR di Tergite 4 al bordo anteriore della cuticola pigmentata (a2)&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dal bordo mediano anteriore al bordo laterale destro, in modo che il centro della linea (contrassegnato da un quadrato bianco) si trovi sul bordo anteriore della cuticola pigmentata (cuticola a2). Fai clic su &quot;OK&quot;; Vedere la Figura 2A e 2A &#39; , linea ciano. NOTA: lo script R definirà questo punto come il bordo anteriore della cuticola pigmentata del tergito. Sull&#39;immagine, la macro mostrerà la regione di interesse (ROI) lungo la quale viene letto il profilo di pigmentazione (rettangolo verde, figura 2A e 2A &#39;, ingrandita nella figura 2B e 2B &#39;). La macro aprirà anche una seconda finestra che mostra il profilo di pigmentazione per il ROI ( fig<html> E 2C e 2C &#39;), dove l&#39;asse x è la posizione, espressa come numero di pixel dal bordo posteriore del profilo e l&#39;asse y è il valore medio di pixel in ogni posizione. </li><li> Visualizza le trame del profilo di pigmentazione che verrà aperta dalla macro. Se necessario, fare clic su &quot;Live&quot; nella finestra del profilo per regolare la posizione del ROI in modo che non includa strutture ( es. Setole) che influenzerebbero il profilo di pigmentazione. Una volta che il profilo è soddisfacente, fai clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Ripetere i passaggi 5.8-5.11 per Tergite 3. NOTA: La macro esporta i profili di pigmentazione come due file CSV, ognuno denominato &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot;, dove [SESH000_samplename] è il nome dell&#39;immagine e [TX] sia T3 o T4 per il terzo e il quarto tergit. </li><li> Notare che la macro apre l&#39;immagine successiva. Ripetere i passaggi 5.7-5.13 finché tutte le immagini sono state analizzate. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Preprocesso dei dati, analisi e correzione della sessione NOTA: Tutte le analisi dei dati sono condotte in R 47 e usano lo script &quot;Analisi di pigmento.R&quot; fornito. Di seguito, &quot;L ...&quot; indica quali linee di script da eseguire per ciascuna parte dell&#39;analisi. Vedere le informazioni supplementari per ulteriori dettagli sull&#39;esecuzione dell&#39;analisi. <ol><li> Modificare lo script R per impostare la directory di lavoro (L6) e definire il percorso di file nella cartella contenente i profili the.csv (L11). </li><li> Esegui L13-15 per generare un elenco dei profili di pigmentazione memorizzati nella cartella del profilo. </li><li> Caricare e gestire le funzioni &quot;reader&quot; e &quot;addPrimaryKey&quot; (L17-41) per leggere i profili in un singolo frame di dati. </li><li> Modificare lo script a L43 per specificare la calibrazione spaziale delle immagini in μm / pixel, come determinato nel passaggio 2.5. </li><li> Caricare e eseguire il &quot;regolazione&quot;(L46-58) per convertire la posizione del profilo (asse x, figura 2C e 2C &#39;) dai pixel-da-posteriore-edge-of-ROI a μm-from-front-edge-of-ROI e (0 = nero, 255 = bianco) al valore di pigmento (0 = nessun pigmento, 255 = pigmento massimo), il valore del profilo (asse y, figura 2C e 2C &#39;). </li><li> Caricare ed eseguire la funzione &quot;spline.der.er&quot; (L60-71) per generare la spline cubica dei profili di pigmentazione e dei suoi primi e secondi derivati ​​( Figura 2D -2F e 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Caricare ed eseguire le funzioni &quot;coord&quot; e &quot;assmbly.coord&quot; (L74-163), innanzitutto per estrarre la posizione dei bordi posteriori (T3) e anteriori (T 2 ) della fascia di pigmento ( figura 2D e 2D &#39;;) E il bordo posteriore della cuticola a2 (T1, Figura 2D e 2D &#39;) e quindi estrarre rispettivamente i valori di pigmentazione massima (P max ) e minima (P min ), assunti rispettivamente in T 3 e T 1 . NOTA: Il bordo anteriore della cuticola a2 è già stato definito nel passaggio 5.9. </li><li> Facoltativo: caricare ed eseguire la funzione &quot;chek&quot; (L165-175) per verificare se la funzione &quot;coordina&quot; identifica correttamente le posizioni T 1-3 per un profilo di pigmentazione selezionato a caso. </li><li> Caricare ed eseguire le funzioni di indice e metriche (L178-193) per generare una tabella dati con le intestazioni &quot;Session&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (una concatenazione di Sample e Tergite), &quot; Pmax &quot; &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot; (larghezza della fascia pigmentata, = T3 - T2) e &quot;W tergite &quot; (larghezza del pigmento cUticoli a2-a5, = T3). </li><li> Caricare e eseguire la funzione &quot;correzione&quot; (L196-234) per generare una tabella dati che corregge P max e P min per eventuali fattori di fastidio derivanti da effetti di sessione. Utilizzare l&#39;aumento medio (o diminuzione) di P max o P min dai campioni di controllo riprogettati in sessioni adiacenti temporanee. </li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questa metodologia consente l&#39;acquisizione precisa, rapida e ripetibile di dati di pigmentazione in una forma quantitativa adatta a più analisi a valle. Il metodo è stato utilizzato per acquisire dati sull&#39;effetto della temperatura sulla pigmentazione addominale in una linea isogenica di mosche. Tuttavia, la metodologia potrebbe essere utilizzata negli studi di avanzamento genetico per identificare i geni che stanno alla base delle differenze di pigmentazione tra individui, popolazioni o specie o studi reverse-genetici per esplorare gli effetti di geni specifici sui modelli di pigmentazione. Sebbene, come sopra discusso, ci sono stati innumerevoli studi che hanno esplorato lo sviluppo e l&#39;evoluzione della pigmentazione D. melanogaster, la precisione con cui questa metodologia raccoglie i dati di pigmentazione in forma quantitativa permette di approcci statistici più potenti. Ciò a sua volta consente ai ricercatori di utilizzare meno campioni quando analizza i modelli di pigmentazione, o permette loro di chiarire più sottiliAspetti della pigmentazione. Inoltre, questo metodo non richiede la dissezione della mosca, permettendo che il campione venga successivamente utilizzato per ulteriori analisi, come ad esempio misure morfologiche o genotipizzazioni. Infatti, la metodologia potrebbe essere potenzialmente utilizzata su mosche anestetizzate, che potevano essere selettivamente allevati sulla base delle loro caratteristiche di pigmentazione. Un potenziale problema con la misurazione della pigmentazione attraverso l&#39;analisi delle immagini è che i valori di pigmentazione possono riflettere l&#39;esposizione e le condizioni di illuminazione sotto cui è stata presa un&#39;immagine, piuttosto che il livello della pigmentazione stessa. Utilizzando livelli di illuminazione fissa, posizioni di luce, ingrandimento e esposizione contribuisce a alleviare questi problemi, è probabile che sarà ancora necessario eseguire diverse ripetizioni di controllo in ogni sessione per controllare completamente gli effetti della sessione. Questo metodo include la reimaging di 15 esemplari di controllo ogni sessione e l&#39;utilizzo delle modifiche tra le sessioni in P maX e P min per rilevare ed eliminare gli effetti di sessione. Tuttavia, il numero preciso di esemplari di controllo che dovrebbero essere rielaborati dipenderà dall&#39;hardware e dal software in uso, dall&#39;aspetto della pigmentazione di interesse per l&#39;utente e da quanto variabile tra i trattamenti e quante immagini siano prelevate in ciascuno sessione. L&#39;esecuzione di un esperimento preliminare in cui gli stessi esemplari vengono ripresi in cinque sessioni consentirà all&#39;utente di calcolare la varianza dovuta agli effetti di sessione, alla varianza dovuta all&#39;identità del campione e alla varianza residua (che è una stima dell&#39;errore di misurazione dopo la correzione Per gli effetti di sessione) ( Tabella 1 ). Questi valori possono quindi essere utilizzati per stimare quante immagini di controllo devono essere eseguite in ogni sessione per rilevare e controllare gli effetti della sessione. È stato scritto un semplice script R e utilizza dati da un simile esperimento preliminare per simulare misure di pigmentazione in sessioni. Può essere usatoPer verificare che il numero di immagini di controllo per sessione sia sufficiente per rimuovere gli effetti della sessione. Questo script è fornito come file aggiuntivo. Se gli utenti sono preoccupati che ci siano fattori di nuocenza all&#39;interno di sessioni, possono anche reimagiare lo stesso esemplare più volte durante la sessione, come descritto in John et al., 2016 41 . In questo caso, [sampleID] per il campione di controllo singolo deve essere modificato ogni volta che viene ripreso in una sessione ( ad esempio, control1, control2, control3, ecc. ); Altrimenti, il software di imaging sostituirà l&#39;immagine precedente con la nuova immagine dello stesso nome. La funzione di correzione basa la sua correzione su immagini duplicate con lo stesso [sampleID] tra sessioni temporaneamente adiacenti e correggerà se lo stesso esemplare viene ripetuto più volte all&#39;interno e tra le sessioni o se vengono ripresi gli stessi esempi di controllo tra le sessioni. Indipendentemente da come thLe immagini di controllo elettronico vengono prese, le sessioni devono essere trattate come blocchi e, laddove possibile, gli utenti dovrebbero impiegare un disegno di blocco casuale in modo che gli effetti di ogni sessione che rimangano dopo la correzione possano essere controllati statisticamente. In caso contrario, i campioni devono essere assegnati in modo casuale alle sessioni in modo che gli effetti di sessione non siano confusi con i fattori sperimentali. Il protocollo si basa sulla generazione di un profilo di pigmentazione che rappresenta la variazione della pigmentazione in ogni tergita. Un problema con la generazione di questo profilo sono i peli scuri che coprono la cuticola addominale, che sono invariabilmente bisettati da qualsiasi linea anteriore-posteriore che attraversa il tergito. Il protocollo riduce il rumore generato da questi peli prendendo il profilo di pigmentazione in media in una fascia di cuticola. Tuttavia, gli utenti possono impostare la larghezza del ROI a 1 pixel nel punto 5.6 se desiderano generare profili basati su una sottile linea di cuticola. Inoltre, gli utenti possono analizzare tHa la stessa immagine più volte, modificando la posizione laterale del profilo di pigmentazione per catturare le variazioni della larghezza della fascia di pigmento all&#39;interno di un segmento. In questo caso, tuttavia, gli utenti dovrebbero copiare la stessa immagine più volte e dare a ciascuna copia un nome univoco prima di eseguire il passaggio 5.1, poiché la macro ImageJ sovrascriverà i profili dello stesso nome. Una seconda considerazione importante quando si genera il profilo di pigmentazione è il parametro di lisciatura della spline cubica, definita nella funzione spline.der.er (L63) nello script di analisi di pigmento R. Il parametro di lisciatura appropriato dipende dalla configurazione e dalla risoluzione dell&#39;immagine. L&#39;over-smoothing di un profilo può provocare una perdita delle caratteristiche del profilo di spline utilizzato per calcolare le coordinate di T 1 , T 2 e T 3 ( Figura 2D e 2D &#39;). Al contrario, la sottovalutazione aumenta il valoreIl rumore del profilo e di conseguenza l&#39;accuratezza delle estrazioni di coordinate. La funzione chek produce un riepilogo grafico della spline e dei suoi derivati ​​e può essere utilizzato come indicatore visivo per scegliere un parametro adeguato di livellamento. La metodologia qui descritta si concentra sulla cattura di dati sulla pigmentazione del terzo e terzo tergi addominale in D. melanogaster femminile e maschile. Tuttavia, i risultati rappresentativi indicano che può essere utilizzato anche per misurare la pigmentazione del quinto e sesto segmento addominale delle femmine. Inoltre, la metodologia può rilevare le differenze di fenotipo causate da mutanti di geni che influenzano la pigmentazione. Gli macro ImageJ e gli script R possono essere facilmente modificati per misurare la pigmentazione negli abdesi di diverse specie di D. melanogaster o persino la pigmentazione di altre parti del corpo in altri taxa, purché il pattern di pigmentazione sia stereotipato. Infine, la metodologiaPotrebbe anche essere adattato per misurare aspetti del colore della pigmentazione catturando immagini in RGB e analizzando separatamente ciascun canale. In generale, questa metodologia fa parte del campo emergente dei fenomeni 51 , 52 . L&#39;obiettivo del fenomeno è quello di generare e analizzare grandi set di dati fenotipici multidimensionali per comprendere meglio le interazioni genetiche e ambientali che influenzano il fenotipo, compresa la malattia, e come queste interazioni si evolvono per generare la diversità biologica. Perché i fenomeni possano soddisfare il suo potenziale, le metodologie per l&#39;acquisizione di dati fenotipici devono essere semplici e facilmente adattati a diversi fenotipi, nonché liberamente disponibili. Utilizzando software open source per analizzare le immagini acquisite utilizzando apparecchiature standard, questa metodologia aiuta a raggiungere questo obiettivo.

La pigmentazione mostra enormi variazioni fenotipiche tra specie, popolazioni e individui, e anche all&#39;interno di individui durante l&#39;ontogenesi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Sebbene ci siano innumerevoli studi di pigmentazione in un&#39;ampia varietà di animali, la pigmentazione è stata forse meglio studiata in Drosophila melanogaster , dove è stato utilizzato il pieno potere della genetica molecolare per chiarire i meccanismi di sviluppo e fisiologici che regolano la pigmentazione e come questi meccanismi evolvono 1 , 6 . Molti sono noti sui geni che regolano la sintesi biochimica dei pigmenti in D. melanogaster 7 , 8 ei geni che controllano la temporale e la spazialità diStribuzione di questa biosintesi 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Inoltre, la mappatura genetica ha individuato i siti genetici che sottendono le differenze intra- e interspecifiche nella pigmentazione in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Sono stati esplorati anche i rapporti tra la pigmentazione e le caratteristiche pleiotropiche, come il comportamento 18 , 19 e l&#39;immunità 19 , 20 , così come il significato adattativo dei modelli di pigmentazione 15 , 21 , 22 . Come tale, la pigmentazione in D. melanogaster è emersa come un potente ma semplice mOdel per lo sviluppo e l&#39;evoluzione di fenotipi complessi. La pigmentazione nell&#39;adulto D. melanogaster è caratterizzata da pattern distinti di melanizzazione sul corpo, in particolare sulle ali e sul torace dorsale e sull&#39;addome. È la pigmentazione di ogni piastra cuticolare (tergita) sull&#39;addoma dorsale, tuttavia, che ha ricevuto la più attenzione. C&#39;è una notevole variabilità in questa pigmentazione ( Figura 1A- F ), a causa sia dei genetici 17 , 23 che quelli ambientali 24 , 25 fattori. La cuticola di un tergite addominale è costituita da compartimenti di sviluppo anteriori e posteriori ( Figura 1G ), ciascuno dei quali può essere ulteriormente suddiviso a seconda della pigmentazione e dell&#39;ornamento 26 . Il vano anteriore comprende sei cuticolaI tipi (a1-a6) e lo scomparto posteriore comprendono tre (p1-p3) ( Figura 1G ). Di queste, la cuticola p1, p2 e a1 sono tipicamente piegate sotto il tergite in abdomeni non stretti in modo che siano nascosti. La cuticola affidabile è caratterizzata da una banda di pigmentazione pesante, qui indicata come una &quot;banda di pigmento&quot;, composta da tipi di cuticola a4 (pelosa con setole moderate) e a5 (pelose con grandi setole), con il bordo posteriore della banda Più pigmentato del bordo anteriore ( Figura 1G ). Anteriore a questa fascia è una regione di cuticola pelosa leggermente pigmentata, che ha setole posteriormente (a3) ​​ma non anteriormente (a2). La variazione della pigmentazione tra le mosche è osservata sia nell&#39;intensità della pigmentazione che nella larghezza della fascia di pigmento. In generale, la variazione è più grande nei segmenti più posteriori (segmenti addominali 5, 6 e 7) ed è più bassa nei segmenti più anteriori (addome addominale3 e 4) 24 . Inoltre, c&#39;è un dimorfismo sessuale nella pigmentazione di D. melanogaster , con i maschi in genere hanno completamente pigmentati quinto e sesto tergi addominali ( Figura 4C ). Nella maggior parte degli studi di pigmentazione addominale in D. melanogaster , la pigmentazione è stata trattata come un tratto categorico o ordinale, con il modello misurato 27 , 28 , 29 o semi-quantitativamente su scala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Questi metodi inevitabilmente soffrono di una mancanza di precisione, e poiché si basano sulla valutazione soggettiva della pigmentazione, è difficile confrontare i dati tra gli studi. Alcuni autori hanno quantificato le dimensioni spaziali della pigmentazione 38 , 39 , l&#39;intensità della pigmentazione di un particolare tipo di cuticola 23 , 25 , 39 , 40 , o l&#39;intensità media della pigmentazione nel tergite addominale nel suo complesso 41 , 42 , 43 . Tuttavia, questi metodi di quantificazione non misurano sia l&#39;intensità e la distribuzione spaziale della pigmentazione addominale contemporaneamente e pertanto non catturano le sfumature di come la pigmentazione varia inTergita propria. Inoltre, molti di questi metodi di quantificazione 38 , 41 , 42 , 43 richiedono la dissezione e il montaggio della cuticola addominale. Ciò richiede tempo e distrugge il campione, rendendolo non disponibile per ulteriori analisi morfologiche. Poiché la comprensione dello sviluppo e dell&#39;evoluzione della pigmentazione addominale si approfondisce, saranno necessari strumenti più sofisticati per misurare rapidamente e con precisione sia la distribuzione spaziale che l&#39;intensità della pigmentazione. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare l&#39;analisi delle immagini digitali per ottenere una misura replicabile e più precisa della pigmentazione addominale in D. melanogaster . La metodologia comprende tre fasi. In primo luogo, la mosca adulta è montata in modo non distruttivo e viene presa un&#39;immagine digitale dell&#39;addome dorsale. In secondo luogo, utilizzando una macro ImageJ, l&#39;utenteDefinisce una striscia anteriore-posteriore di pixel che si estende dall&#39;anteriore della cuticola a2 alla parte posteriore della cuticola a5 (casella verde, figura 1G ) sia sul terzo che sul quarto segmento addominale. Il valore medio di pixel lungo la larghezza di questa striscia viene quindi estratto lungo il suo asse lungo, generando un profilo che cattura la distribuzione spaziale e l&#39;intensità della pigmentazione in quanto cambia dall&#39;anteriore alla posteriore del tergito. In terzo luogo, uno script R viene utilizzato per descrivere il profilo di pigmentazione matematicamente utilizzando una spline cubica. Lo script R poi utilizza la spline e il suo primo e secondo derivato per estrarre la larghezza della cuticola a2-a5, la larghezza della fascia di pigmento e i livelli massimi e minimi di pigmentazione. Il metodo quantifica quindi sia le caratteristiche spaziali che la profondità della pigmentazione addominale. Questa metodologia quantifica la pigmentazione del terzo e del quarto tergi addominale,Che sono stati al centro di numerosi studi precedenti 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , esclusivamente o in combinazione con più tergiti posteriori. Sebbene meno variabile rispetto al quinto e al sesto tergi addominale, i terzi e terzi non sono completamente pigmentati nei maschi, quindi questo protocollo può essere applicato sia ai maschi che alle femmine. Tuttavia, come indicato qui, il protocollo può essere utilizzato per misurare la pigmentazione nel quinto e sesto tergi addominale nelle femmine. Inoltre, piccole modifiche degli script utilizzati per estrarre le caratteristiche del profilo di pigmentazione dovrebbero permettere che il metodo venga utilizzato per quantificare la variazione della pigmentazione in un&#39;ampia varietà di altreorganismi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Biology Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Cold Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Control Software</td>
			<td>Micro-Manager v1.3.20</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>R 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDWE-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 75 Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Klarman Rulings, Inc.</td>
			<td>KR-867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

La pigmentazione è un tratto morfologicamente semplice ma altamente variabile che spesso ha un significato adattativo. Ha servito ampiamente come modello per comprendere lo sviluppo e l&#39;evoluzione dei fenotipi morfologici. La pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster è stata particolarmente utile, consentendo ai ricercatori di identificare i loci che sono alla base delle variazioni inter- e intraspecifiche della morfologia. Fino ad oggi, tuttavia, la pigmentazione addominale D. melanogaster è stata ampiamente analizzata qualitativamente, attraverso un punteggio piuttosto che quantitativo, che limita le forme di analisi statistica che possono essere applicate ai dati di pigmentazione. Questo lavoro descrive una nuova metodologia che consente la quantificazione di vari aspetti del pattern di pigmentazione addominale di D. melanogaster adulte . Il protocollo include il montaggio del campione, la cattura delle immagini, l&#39;estrazione dei dati e l&#39;analisi. Tutto il software utilizzato per le macro delle funzioni di acquisizione e analisi delle immaginiScritta per l&#39;analisi delle immagini open source. Il vantaggio di questo approccio è la capacità di misurare con precisione i tratti di pigmentazione utilizzando una metodologia altamente riproducibile in diversi sistemi di imaging. Mentre la tecnica è stata utilizzata per misurare la variazione nei modelli di pigmentazione della terna di D. melanogaster adulte , la metodologia è flessibile e si applica generalmente ai modelli di pigmentazione in innumerevoli organismi diversi.

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Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Questo lavoro presenta un metodo per quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster utilizzando l&#39;analisi di immagine digitale. Questo metodo semplifica le procedure tra l&#39;acquisizione di fenotipi e l&#39;analisi dei dati e include il montaggio del campione, l&#39;acquisizione di immagini, l&#39;estrazione del valore dei pixel e la misurazione del tratto.

Quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

8.9K Views.  Lake Forest College.  Questo lavoro presenta un metodo per quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster utilizzando l'analisi di immagine digitale. Questo metodo semplifica le procedure tra l'acquisizione di fenotipi e l'analisi dei dati e include il montaggio del campione, l'acquisizione di immagini, l'estrazione del valore dei pixel e la misurazione del tratto. 

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Ricerca

Genetica

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel have been described. However, a method to measure the amount of additional animal activity induced through the exercise treatment has been lacking. The Rotating Exercise Quantification System (REQS) fills this need, providing a measure of animal activity for animals experiencing rotational exercise. This protocol details how to use the REQS to assess animal activity during rotational exercise and illustrates the type of data that can be generated. Here, we demonstrate how the REQS is used to measure sex- and strain-specific differences in exercise induced activity. The REQS can also be used to evaluate the impact of various other experimental parameters such as age, diet, or population size on exercise induced activity. In addition, it can be used to compare the efficacy of different exercise training protocols. Importantly, it provides an opportunity to standardize exercise treatments between strains, allowing the researcher to achieve equal amounts of activity between groups if needed. Thus, the REQS is a notable new resource for exercise biologists working with the Drosophila model system and complements existing exercise systems.

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

The Rotating Exercise Quantification System (REQS) can induce exercise in Drosophila melanogaster through rotation while simultaneously measuring the amount of activity performed by the animals. Here, we present a point-by-point protocol detailing how to measure activity levels of animals experiencing rotational exercise treatments using the REQS.

Misurazione dei livelli di esercizio in Drosophila melanogaster utilizzando il sistema di quantificazione esercizio rotanti (Rich)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

Il TreadWheel: Protocollo di allenamento intervallo per delicatamente indotto da esercizio in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Purificazione di basso-abbondanti cellule nel sistema visivo della drosofila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In Vivo Avanti Schermo Genetico per Identificare Nuovi Geni Neuroprotettivi in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

In-Nucleus Hi-C nelle cellule di Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...