Diese Arbeit wurde gefördert von National Science Foundation gewährt IOS-1256565 und IOS-1557638 an AWS. Wir danken Patricia Wittkopp und drei anonymen Rezensenten für ihre hilfreiche Kommentare zu einer früheren Version dieses Artikels.

1. Probenmontage HINWEIS: Tote Fliegen in 70% Ethanol in Wasser vor der Bildgebung. <ol><li> Gießen Sie 10 ml 1,25% Agar in kochendem Wasser in einer 60 mm x 15 mm Petrischale aufgelöst und lassen Sie es einstellen. </li><li> Unter einem Sektionsmikroskop verwenden Sie ein Paar Feinpinzetten, um eine ~ 20 mm ong, 2 mm breite, 1 mm tiefe Rille in der Oberfläche des Gels zu machen. Mit feinen Zangen, eingebettet die ventrale Seite einer erwachsenen Fliege in die Nut, wobei die dorsale Seite der Fliege über das Gel vorspringt. HINWEIS: Die Lockerheit des Gels ermöglicht eine einfache Neupositionierung ohne Beschädigung der Probe. Die gleiche Rille kann für mehrere Exemplare verwendet werden, obwohl es schmutzig, aufgebrochen und unbrauchbar mit der Zeit wird. Der Benutzer kann dann eine weitere Nut in demselben Gel machen. Jede Platte kann verwendet werden, um ~ 200 Fliegen abzubilden. </li><li> Die Probe in 70% igem Ethanol vollständig in Wasser abdecken, um Lichtreflexionen aus der wachsartigen Nagelhaut zu reduzieren und die Flügelschäden zu verhindernProbekörpermanipulation. </li></ol> 2. Mikroskop-Setup HINWEIS: Die Bilder werden unter Verwendung eines Sektionsbereichs, einer Durchlichtbasis, einer Digitalkamera und einer Schwanenhals-Kaltlichtquelle, die an einem Computer angeschlossen sind, der eine Bilderfassungssteuerungssoftware ausführt, aufgenommen. Software-Anweisungen sind spezifisch für Micro-Manager v1.4.20 44 , die eine Open-Source-Software ist, die ImageJ 45 enthält . <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, Digitalkamera, Doppel-Schwanenhals Kaltlichtquelle und Computer. </li><li> Führen Sie die Bildaufnahme-Software aus, um ein Micro-Manager-Fenster und ein ImageJ-Fenster zu öffnen. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf &quot;Image&quot;&gt; &quot;Type&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot;, um alle Bilder als 8-Bit zu setzen. Klicken Sie im Mikro-Manager-Fenster auf &quot;live&quot;, um ein Fenster &quot;Snap / Live&quot; zu öffnen, das eine Echtzeitvorschau von der Kamera zeigt. <ol><li> Maximieren Sie die Größe des &quot;Snap / Live&quot; -Fensters, wenn neCessary Wählen Sie im Pulldown-Menü &quot;Display-Modus&quot; im Register &quot;Kontrast&quot; des Micro-Manager-Fensters &quot;Graustufen&quot;. </li></ol></li><li> Schalten Sie die kalte Lichtquelle auf ihre maximale Intensität ein und positionieren Sie die Spitzen jedes Schwanenhalses auf ca. 120 mm von der Bühne, eine auf der linken und eine auf der rechten Seite. HINWEIS: Die Benutzer können auch einen ringförmigen Illuminator verwenden, obwohl dies einen Ring von reflektiertem Licht um den Fliegenabdomen erzeugen kann. </li><li> Manuelles Setzen der Mikroskopvergrößerung auf 60X, so dass das Gesichtsfeld eine Fläche von etwa 3 mm Durchmesser auf der Bühne einfängt. </li><li> Legen Sie ein 2 mm Bühnenmikrometer auf die Bühne (Umschalten des Hintergrundes auf Weiß, wenn nötig). Beim Betrachten der Live-Vorschau konzentrieren Sie sich auf den Bühnenmikrometer und passen die Belichtung im Micro-Manager-Fenster an, indem Sie die Belichtungszeit in ms im Feld &quot;Exposure&quot; eingeben. </li><li> Um die Kamera räumlich zu kalibrieren, wählen Sie das Werkzeug &quot;Gerade&quot; in tEr ImageJ Fenster und zeichne eine Linie die Länge der Bühnenmikrometer. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf &quot;Analysieren&quot;&gt; &quot;Set Scale&quot;, um das Fenster &quot;Set Scale&quot; zu öffnen, geben Sie die Länge des Mikrometers in μm in das Feld &quot;Bekannte Distanz&quot; ein und geben Sie &quot;μm&quot; in die &quot;Längeneinheit&quot; Box. <ol><li> Beachten Sie, dass das Fenster &quot;Set Scale&quot; dann die Skala in &quot;Pixel / μm&quot; anzeigt. Notieren Sie sich die Skala und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Klicken Sie im Fenster &quot;Snap / Live&quot; auf &quot;Stop&quot; und dann &quot;Snap&quot;, um ein Bild des Bühnenmikrometers zu erfassen. </li><li> Speichern Sie das Bild als 8-Bit-Graustufen-TIFF, um die Möglichkeit zu gewährleisten, die Bilder bei Bedarf räumlich zu kalibrieren. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf &quot;Datei&quot;&gt; &quot;Speichern unter&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; Geben Sie an, wo die Datei im Dateibrowser gespeichert werden soll, benennen Sie die Datei und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Schalte die Bühne schwarz und platzEine Petrischale, die eine Fliege in Agar (Schritte 1.1-1.2) auf der Bühne montiert hat. </li><li> Schauen Sie durch das Mikroskop und positionieren Sie die Fliege, um sicherzustellen, dass die dorsale Mittellinie gerade ist, um das Pigmentmuster am besten zu sehen. Bewegen Sie alle Flügel und Anhänge, um sicherzustellen, dass der Blick auf den Bauch ist ungehindert. Wenn die pigmentierte Nagelhaut (a2-a5) nicht sichtbar ist, quetschen Sie den Bauch seitlich, bis er ist (obwohl der Abdomen der Fliegen in 70% Ethanol in Wasser gespannt ist, so dass dies normalerweise nicht notwendig ist). HINWEIS: Bei der Positionierung der Fliege muss der Benutzer eine niedrigere Vergrößerung (20X) verwenden. Die Vergrößerung muss auf 60X zurückgesetzt werden, bevor Sie fortfahren. </li><li> Manuell auf den dorsalen Abdomen der Fliege fokussieren Manuell die Spitzen der Lichtquelle einstellen, um die Schatten und die Reflexion auf dem Rückenabfall zu minimieren. </li><li> Beim Betrachten der Live-Vorschau auf dem Computerbildschirm und mit dem Pixelwert-Histogramm auf der Registerkarte &quot;Kontrast&quot; des Micro-Manager-Fensters,Stellen Sie die Belichtung wie in Schritt 2.4 beschrieben ein, um den Bereich der Pixelwerte des Vorschaubildes zu maximieren. </li><li> Entfernen Sie die Fliege und Petrischale und ersetzen Sie sie mit einer LED (spektrale Ausgabe von 430-660 nm), die an einen Spannungsmesser angeschlossen ist, der im Sichtfeld an der gleichen Position wie die Fliege zentriert ist. Verwenden Sie die LED und den Spannungsmesser als Lichtzähler 46 und notieren Sie die Spannung, die durch das auf die LED auftreffende Licht (~ 125 mV) erzeugt wird. HINWEIS: Der LED- und Spannungsmesser wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Lichtwerte über mehrere Bildgebungssitzungen in einem einzigen Experiment konstant sind. </li><li> Für die Dauer des Experiments darf die Position oder Intensität der Lichtquelle, die Vergrößerung des Mikroskops oder die Belichtung der Kamera nicht weiter verändert werden. </li></ol> 3. Probenbildgebung <ol><li> Legen Sie eine Petrischale mit einer Fliege in Agar (Schritte 1.1-1.3) auf dem schwarzen Mikroskopstadium montieren. Stellen Sie die Position der Fliege so ein, dass die dritte und vierteH Abdominalsegmente sind sichtbar und die dorsale Mittellinie ist gerade, wie in Schritt 2.9 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung bei 60x ist, bevor Sie fortfahren. </li><li> Manuell fokussieren Sie das Mikroskop so, dass die dritte und vierte dorsale Bauch-Tergite im Fokus sind. Verwenden Sie die Bildaufnahme-Software, um ein Bild als 8-Bit-Graustufen-TIFF zu erfassen, wie in Schritt 2.6 beschrieben. HINWEIS: Das Bild kann farbig aufgenommen und anschließend zur Analyse in Graustufen umgewandelt werden. </li><li> Speichern Sie das Bild als &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;, wie in Schritt 2.7 beschrieben. HINWEIS: Hier ist [SESH] konstant, [000] ist die Sitzungsnummer und ist variabel, muss aber drei Ziffern lang sein und [sampleID] ist was auch immer der Benutzer wünscht, obwohl er keine zusätzlichen Unterstrichzeichen (_) enthalten muss Muss eine konstante Länge haben. [SampleID] sollte Details der Faktoren enthalten, die bei der Analyse der Pigmentierungsdaten ( z. B. Temperatur oder Abstammung) verwendet werden, die durch ein unverwechselbares Nicht-Alphabeti getrennt sindCal-Charakter, wie ein Bindestrich (-). Dies ermöglicht es, diese Faktoren einfach aus [sampleID] unter Verwendung von standardisierter statistischer Software zu analysieren. </li><li> Entfernen Sie die Petrischale von der Bühne und ersetzen Sie die Fliege mit dem nächsten Exemplar. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.3, bis alle Exemplare abgebildet wurden, ohne die Beleuchtungsstärke, die Vergrößerung oder die Belichtung weiter einzustellen. </li></ol> 4. Imaging über mehrere Sessions <ol><li> Wenn Bilder über mehrere Sitzungen aufgenommen werden müssen, pflegen Sie die Lichtintensität, die Belichtung und die Vergrößerung über die Sitzungen. Prüfen Sie zu Beginn jeder Sitzung die räumliche Kalibrierung der Kamera (Schritt 2.4) und die Lichtintensität auf der Bühne (gemessen am LED / Spannungsmesser, Schritt 2.12). </li><li> Erfassen und Speichern eines Bildes des Bühnenmikrometers (Schritte 2.5-2.7), um die Möglichkeit zu gewährleisten, die Bilder bei Bedarf räumlich zu kalibrieren. </li><li> Verwenden Sie mindestens 15 Kontrollproben und geben Sie sie nach dem Zufallsprinzip in jeder Sitzung nach allo vorW für die Erkennung und Beseitigung von Session-Effekten. Stellen Sie sicher, dass doppelte Kontrollproben zwischen den Sitzungen die gleiche [sampleID] aber unterschiedliche [SESH000] haben. ANMERKUNG: Die Kontrollproben sind Fliegen, die gesammelt, gespeichert und identisch an experimentelle Exemplare angebracht werden, aber über Sessions neu abgebildet werden. Die genaue Anzahl der Kontrollproben hängt vom experimentellen Setup des Benutzers ab. Weitere Details finden Sie in der Diskussion. </li></ol> 5. Bildanalyse HINWEIS: Die Bildanalyse wird in ImageJ 45 durchgeführt und verwendet das Makro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot;, das als Ergänzungsdatei zur Verfügung gestellt wird. <ol><li> Platzieren Sie alle zu analysierenden Bilder im selben Ordner. </li><li> Starten Sie ImageJ und führen Sie das Makro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; durch Klicken auf &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Run&quot;, &quot;Auswählen von&quot; Pigmentation.ijm &quot;im Dateibrowser und klicken Sie auf&quot;öffnen.&quot; HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte befinden sich im Makro. Jeder Schritt ist ein einzelner Makrobefehl. </li><li> Beachten Sie, dass ein Dialogfeld &quot;Action Required&quot; geöffnet wird, unter Angabe von &quot;Wählen Sie den Ordner, in dem Bilder gespeichert sind&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; und verwenden Sie den Dateibrowser, um den Ordner auszuwählen, der die Bilder enthält, und klicken Sie dann auf &quot;Auswählen&quot;. </li><li> Beachten Sie, dass ein Dialogfeld &quot;Action Required&quot; geöffnet wird, indem Sie &quot;Wählen Sie den Ordner, in dem die Daten gespeichert werden sollen&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; und wählen Sie mit dem Dateibrowser den gewünschten Ordner zum Speichern der Pigmentprofile aus. Klicken Sie auf &quot;wählen&quot;. </li><li> Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet und &quot;Wie viele Zeichen in Ihrer Beispiel-ID?&quot; Geben Sie im Eingabefeld Eingabe die Anzahl der Zeichen in [SampleID] ein, wie in Schritt 3.3 angegeben, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Beachten Sie, dass ein Dialogfenster geöffnet wird und fragt: &quot;Wie weit ist dein ROI?&quot; Geben Sie im Eingabefeld Eingabe die Pixelbreite des anterior-Posteriorer Streifen, entlang dem das Pigmentierungsprofil zu lesen ist (grünes Rechteck, Abbildung 1G , Abbildung 2A und 2A &#39;). OK klicken;&quot; Die Voreinstellung ist 20 Pixel. ANMERKUNG: Das Pigmentprofil wird über einen Streifensäge und nicht durch eine Linie gelesen, um Lärm durch Haare und Borsten zu reduzieren. Die Breite dieses Streifens hängt von der Auflösung des Bildes ab, aber es sollte ~ 1 / 20th der Breite des Bauches in Pixeln sein. </li><li> Beachten Sie, dass das Makro das Bild der ersten Fliege öffnet und ein Dialogfenster fragt, ob die aktuelle Fliege zu messen ist (klicken Sie auf &quot;Ja&quot;), um zur nächsten Fliege zu gelangen (klicken Sie auf &quot;Nein&quot;) oder um das zu verlassen Makro (klicken Sie auf &quot;Abbrechen&quot;). </li><li> Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet, unter Angabe von &quot;Definieren Sie die Mittellinie des dorsalen Abdomens, von ANTERIOR bis POSTERIOR&quot;. Das Werkzeug &quot;Gerade Linie&quot; wird bereits ausgewählt. Zeichne eine Linie von vorne nach hintenUm die Mittellinie des dorsalen Bauches zu definieren. OK klicken;&quot; Siehe Abbildung 2A und 2A &#39;, gelbe Linie. HINWEIS: Dies wird verwendet, um das Bild neu auszurichten, so dass die dorsale Mittellinie horizontal über dem Bildschirm liegt, mit dem vorderen auf der linken Seite, wodurch die nachfolgenden Schritte erleichtert werden. </li><li> Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet, unter Angabe von &quot;Definieren Sie die POSTERIOR-Kante von Tergite 4 direkt hinter dem Pigmentband.&quot; Das Werkzeug &quot;Gerade Linie&quot; wird bereits ausgewählt. Zeichnen Sie eine Linie von der hinteren Mittellinienkante zur rechten Seitenkante, so dass die Mitte der Linie (markiert durch ein weißes Quadrat) gerade nach hinten zum hinteren Rand des Pigmentbandes (Nagelhaut a5) sitzt. OK klicken;&quot;. Siehe Abbildung 2A und 2A &#39;, Magenta-Linie. HINWEIS: Das R- Skript erkennt automatisch die hintere Kante des Pigmentbandes aus dem Pigmentprofil. </li><li> Beachten Sie, dass ein DialogKasten öffnet sich und sagt: &quot;Definiere die ANTERIOR Kante von Tergite 4 an der vorderen Kante der pigmentierten Nagelhaut (a2).&quot; Das Werkzeug &quot;Gerade Linie&quot; wird bereits ausgewählt. Zeichnen Sie eine Linie von der vorderen Mittellinie zur rechten Seitenkante, so dass die Mitte der Linie (markiert durch ein weißes Quadrat) am vorderen Rand der pigmentierten Nagelhaut (Nagelhaut a2) sitzt. OK klicken;&quot;. Siehe Abbildung 2A und 2A &#39; , Cyan-Linie. HINWEIS: Das R- Skript definiert diesen Punkt als die vordere Kante der pigmentierten Nagelhaut der Tergite. Auf dem Bild zeigt das Makro den interessierenden Bereich (ROI) an, entlang dem das Pigmentierungsprofil gelesen wird (grünes Rechteck, Fig. 2A und 2A &#39;, vergrößert in Fig. 2B und 2B &#39;). Das Makro öffnet auch ein zweites Fenster mit dem Pigmentprofil für den ROI ( Figur<html> E 2C und 2C &#39;), wobei die x-Achse die Position ist, ausgedrückt als Anzahl der Pixel von der hinteren Kante des Profils, und die y-Achse ist der durchschnittliche Pixelwert an jeder Position. </li><li> Sehen Sie sich die Plots des Pigmentierungsprofils an, das vom Makro geöffnet wird. Wenn nötig, klicken Sie im Profilfenster auf &quot;Live&quot;, um die Position des ROI so einzustellen, dass es keine Strukturen ( zB Borsten) enthält, die das Pigmentprofil beeinflussen würden. Sobald das Profil zufrieden stellend ist, klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.8-5.11 für Tergite 3. HINWEIS: Das Makro exportiert dann die Pigmentierungsprofile als zwei CSV-Dateien, die jeweils &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot; genannt werden, wobei [SESH000_samplename] der Bildname ist und [TX] entweder T3 oder T4 für die dritte und vierte Tergite ist. </li><li> Beachten Sie, dass das Makro das nächste Bild öffnet. Wiederholen Sie die Schritte 5.7-5.13, bis alle Bilder analysiert wurden. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Datenvorverarbeitung, Analyse und Sitzungskorrektur HINWEIS: Alle Datenanalyse wird in R 47 durchgeführt und verwendet das Skript &quot;Analyse von Pigmentation.R&quot;. Unten, &quot;L ...&quot; gibt an, welche Zeile (n) des Skripts für jeden Teil der Analyse laufen soll. Weitere Informationen darüber , wie die Analyse durchgeführt wird, finden Sie in den ergänzenden Informationen. <ol><li> Bearbeiten Sie das R- Skript, um das Arbeitsverzeichnis (L6) einzustellen und den Dateipfad in den Ordner zu definieren, der die .csv-Profile enthält (L11). </li><li> Führen Sie L13-15 aus, um eine Liste der im Profilordner gespeicherten Pigmentierungsprofile zu erzeugen. </li><li> Laden und führen Sie die Funktionen &quot;Leser&quot; und &quot;addPrimaryKey&quot; (L17-41), um die Profile in einem einzelnen Datenrahmen zu lesen. </li><li> Bearbeiten Sie das Skript bei L43, um die räumliche Kalibrierung der Bilder in μm / Pixel anzugeben, wie in Schritt 2.5 bestimmt. </li><li> Laden und führen Sie die &quot;adjusTionen &quot;-Funktion (L46-58), um die Profilposition (x-Achse, Abbildung 2C und 2C &#39;) von Pixeln von-posterior-edge-of-ROI zu μm-von-anterior-edge-of-ROI und dem zu konvertieren Profilwert (y-Achse, Bild 2C und 2C &#39;) vom Pixelwert (0 = schwarz, 255 = weiß) zum Pigmentierungswert (0 = kein Pigment, 255 = maximales Pigment). </li><li> Laden Sie die Funktion &quot;spline.der.er&quot; (L60-71), um die kubische Spline der Pigmentierungsprofile und ihre ersten und zweiten Ableitungen zu erzeugen ( Abbildung 2D - 2F und 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Laden Sie die &quot;coord&quot; und &quot;assmbly.coord&quot; -Funktionen (L74-163), um zuerst die Position der hinteren (T 3 ) und anterior (T 2 ) Kanten des Pigmentbandes zu extrahieren (Abbildung 2D und 2D &#39;(T1, Fig. 2D und 2D &#39;) und dann die maximalen (P max ) und minimalen (P min ) Pigmentierungswerte, die bei T 3 bzw. T 1 aufgenommen wurden, extrahieren. HINWEIS: Die vordere Kante der a2-Nagelhaut wurde bereits in Schritt 5.9 definiert. </li><li> Optional: Laden und starten Sie die Funktion &quot;chek&quot; (L165-175), um zu prüfen, ob die &quot;Coord&quot; -Funktion die Positionen T 1-3 für ein zufällig ausgewähltes Pigmentprofil korrekt identifiziert. </li><li> Laden Sie die Index- und Metrikfunktionen (L178-193), um eine Datentabelle mit den Überschriften &quot;Session&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (eine Verkettung von Sample und Tergite), &quot;P max &quot;, zu erzeugen. &quot;P min &quot;, &quot;W- Band &quot; (Breite des Pigmentbandes, = T3 - T 2 ) und &quot;W tergit &quot; (Breite des pigmentierten cUticles a2-a5, = T 3 ). </li><li> Laden und starten Sie die Funktion &quot;Korrektur&quot; (L196-234), um eine Datentabelle zu erzeugen, die P max und P min für irgendwelche Störungsfaktoren korrigiert, die durch Session-Effekte entstehen. Verwenden Sie die durchschnittliche Erhöhung (oder Abnahme) in P max oder P min von den Kontrollproben, die über die zeitlich benachbarten Sitzungen neu abgebildet wurden. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Methodik ermöglicht die präzise, ​​schnelle und wiederholbare Erfassung von Pigmentierungsdaten in quantitativer Form, die für mehrere nachgeschaltete Analysen geeignet ist. Die Methode wurde verwendet, um Daten über die Wirkung der Temperatur auf die Bauchpigmentierung in einer isogenen Linie von Fliegen zu erwerben. Allerdings könnte die Methodik in Forward-Genetics-Studien verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die den Pigmentierungsunterschieden zwischen Individuen, Populationen oder Spezies zugrunde liegen, oder reverse-genetische Studien, um die Effekte spezifischer Gene auf Pigmentierungsmuster zu untersuchen. Obwohl, wie oben diskutiert, gab es unzählige Studien, die die Entwicklung und Evolution von D. melanogaster Pigmentierung erforscht haben, die Präzision, mit der diese Methode Pigmentierungsdaten in quantitativer Form einfängt, ermöglicht leistungsfähigere statistische Ansätze. Dies wiederum ermöglicht es Forschern, weniger Proben bei der Analyse von Pigmentierungsmustern zu verwenden, oder erlaubt ihnen, subtiler zu klärenAspekte der Pigmentierung. Darüber hinaus erfordert dieses Verfahren keine Sezierung der Fliege, so dass die Probe anschließend für zusätzliche Analysen wie morphologische Messungen oder Genotypisierung verwendet werden kann. In der Tat könnte die Methodik möglicherweise auf anästhesierte Fliegen verwendet werden, die dann selektiv auf der Grundlage ihrer Pigmentierungseigenschaften gezüchtet werden könnten. Ein potentielles Problem bei der Messung der Pigmentierung durch die Bildanalyse ist, dass die Pigmentierungswerte die Belichtungs- und Lichtverhältnisse widerspiegeln können, unter denen ein Bild aufgenommen wurde, anstatt die Pigmentierung selbst. Bei der Verwendung von festen Beleuchtungsniveaus, Lichtpositionen, Vergrößerung und Belichtung hilft, diese Probleme zu lindern, ist es wahrscheinlich, dass es immer noch notwendig ist, mehrere Wiederholungssteuerbilder in jeder Sitzung zu nehmen, um die Session-Effekte vollständig zu kontrollieren. Diese Methode umfasst die Re-Imaging von fünfzehn Kontrollproben jeder Sitzung und unter Verwendung der Änderungen zwischen den Sitzungen in P maX und P min zur Erkennung und Beseitigung von Session-Effekten. Allerdings hängt die genaue Anzahl von Kontrollproben, die neu abgebildet werden sollen, von der bildgebenden Hardware und der verwendeten Software ab, dem Aspekt der Pigmentierung, die für den Benutzer von Interesse ist, und wie variabel es zwischen Behandlungen ist und wie viele Bilder in jedem aufgenommen werden Session. Die Durchführung eines Vorversuchs, bei dem die gleichen Exemplare über fünf Sitzungen neu abgebildet werden, ermöglicht es dem Benutzer, die Varianz aufgrund von Session-Effekten, der Varianz aufgrund der Probenidentität und der Restvarianz zu berechnen (was eine Schätzung des Messfehlers nach der Korrektur ist Für Sitzungseffekte) ( Tabelle 1 ). Diese Werte können dann verwendet werden, um zu schätzen, wie viele Steuerbilder in jeder Sitzung aufgenommen werden müssen, um Session-Effekte zu erkennen und zu steuern. Ein einfaches R- Skript wurde geschrieben und verwendet Daten aus einem solchen Vorversuch, um Pigmentierungsmaßnahmen über Sessions zu simulieren. Es kann benutzt werdenUm zu überprüfen, ob die Anzahl der Steuerbilder pro Sitzung ausreicht, um die Sitzungseffekte zu entfernen. Dieses Skript wird als Ergänzungsdatei bereitgestellt. Wenn die Benutzer besorgt sind, dass es in den Sitzungen Störungsfaktoren gibt, können sie auch die gleiche Probe während der gesamten Sitzung mehrfach wiederherstellen, wie in John et al., 2016 41 beschrieben. In diesem Fall muss [sampleID] für die einzelne Kontrollprobe jedes Mal geändert werden, wenn es innerhalb einer Sitzung neu abgebildet wird ( z. B. control1, control2, control3 usw. ); Andernfalls ersetzt die Imaging-Software das vorherige Bild durch das neue Bild mit dem gleichen Namen. Die Korrekturfunktion stützt ihre Korrektur auf doppelte Bilder mit der gleichen [sampleID] zwischen zeitlich benachbarten Sitzungen und korrigiert, ob die gleiche Probe mehrmals innerhalb und zwischen den Sitzungen neu abgebildet wird oder ob derselbe Satz von Kontrollproben zwischen den Sitzungen abgebildet wird. Unabhängig davon, wie thE Kontrollbilder werden genommen, Sitzungen sollten als Blöcke behandelt werden, und wenn möglich sollten Benutzer ein randomisiertes Blockdesign verwenden, so dass alle Session-Effekte, die nach der Korrektur verbleiben, statistisch gesteuert werden können. Andernfalls sollten die Exemplare zufällig den Sitzungen zugeordnet werden, damit die Session-Effekte nicht mit experimentellen Faktoren verwechselt werden. Das Protokoll beruht auf der Erzeugung eines Pigmentierungsprofils, das die Veränderung der Pigmentierung über jedem Tergit darstellt. Ein Problem bei der Erstellung dieses Profils sind die dunklen Haare, die die Bauch-Nagelhaut bedecken, die unweigerlich von einer anterior-posterioren Linie, die die Tergite kreuzt, halbiert werden. Das Protokoll reduziert das Rauschen, das von diesen Haaren erzeugt wird, indem man das Pigmentierungsprofil über ein Band von Nagelhaut gemittelt hat. Trotzdem können Benutzer die Breite des ROI auf 1 Pixel in Schritt 5.6 einstellen, wenn sie Profile erstellen möchten, die auf einer dünnen Linie von Nagelhaut basieren. Außerdem können die Benutzer t analysierenDas gleiche Bild mehrmals, das Ändern der lateralen Position des Pigmentierungsprofils, um Änderungen in der Breite des Pigmentbandes innerhalb eines Segments zu erfassen. In diesem Fall müssen die Benutzer jedoch das gleiche Bild mehrmals kopieren und jeder Kopie einen eindeutigen Namen geben, bevor sie Schritt 5.1 ausführt, da das ImageJ-Makro Profile mit demselben Namen überschreibt. Eine zweite wichtige Betrachtung bei der Erzeugung des Pigmentierungsprofils ist der Glättungsparameter des kubischen Splines, der innerhalb der Spline.der.er-Funktion (L63) in der Analyse des Pigmentations- R- Skripts definiert ist. Der entsprechende Glättungsparameter hängt vom Bildaufbau und der Auflösung ab. Eine Überglättung eines Profils kann zu einem Verlust der Eigenschaften des Spline-Profils führen, das verwendet wird, um die Koordinaten von T &amp; sub1 ; , T &amp; sub2 ; und T &amp; sub3 ; zu berechnen ( Fig. 2D und 2D &#39;). Umgekehrt erhöht die Unterglättung dieRauschen des Profils und damit die Genauigkeit der Koordinaten-Extraktionen. Die Chek- Funktion erzeugt eine grafische Zusammenfassung des Splines und seiner Ableitungen und kann als visuelles Cue verwendet werden, um einen geeigneten Glättungsparameter zu wählen. Die hier beschriebene Methodik konzentriert sich auf die Erfassung von Daten über die Pigmentierung der dritten und vierten Bauch-Tergite bei weiblichen und männlichen D. melanogaster . Allerdings zeigen die repräsentativen Ergebnisse, dass es auch verwendet werden kann, um die Pigmentierung der fünften und sechsten Bauchsegmente von Frauen zu messen. Darüber hinaus kann die Methodik Unterschiede im Phänotyp nachweisen, die durch Mutanten von Genen verursacht werden, die die Pigmentierung beeinflussen. Die ImageJ-Makro- und R- Skripte können leicht modifiziert werden, um die Pigmentierung in den Abdomen unterschiedlicher D. melanogaster- Spezies oder sogar Pigmentierung anderer Körperteile in anderen Taxa zu messen, vorausgesetzt, dass das Pigmentmuster stereotyp ist. Schließlich ist die MethodikKönnte auch angepasst werden, um Aspekte der Pigmentierung Farbe zu messen, indem sie Bilder in RGB erfassen und jeden Kanal separat analysieren. Im Allgemeinen ist diese Methodik Teil des auftauchenden Feldes der Phänomen 51 , 52 . Das Ziel der Phänomene ist es, große multidimensionale phänotypische Datensätze zu generieren und zu analysieren, um die genetischen und umweltbedingten Interaktionen besser zu verstehen, die den Phänotyp beeinflussen, einschließlich Krankheit und wie sich diese Wechselwirkungen entwickeln, um biologische Vielfalt zu erzeugen. Für die Phänomene, um ihr Potenzial zu erfüllen, müssen jedoch Methoden zur Erfassung von phänotypischen Daten einfach und leicht an verschiedene Phänotypen angepasst werden, ebenso wie frei verfügbar. Durch die Verwendung von Open-Source-Software zur Analyse von Bildern, die mit Standardausrüstung aufgenommen wurden, hilft diese Methode, dieses Ziel zu erreichen.

Die Pigmentierung zeigt eine enorme phänotypische Variation zwischen Arten, Populationen und Individuen und sogar innerhalb von Individuen während der Ontogenese 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Obwohl es in einer Vielzahl von Tieren unzählige Pigmenttests gibt, ist die Pigmentierung am besten in Drosophila melanogaster untersucht worden , wo die volle Kraft der Molekulargenetik verwendet wurde, um die Entwicklungs- und physiologischen Mechanismen zu erforschen, die die Pigmentierung regulieren und wie sich diese Mechanismen entwickeln 1 , 6 Es ist viel über die Gene bekannt, die die biochemische Synthese von Pigmenten in D. melanogaster 7 , 8 und den Genen, die das zeitliche und räumliche di kontrollieren, regulierenVerteilung dieser Biosynthese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Darüber hinaus hat die genetische Kartierung die genetischen Loci identifiziert, die intra- und interspezifischen Unterschiede in der Pigmentierung in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 liegen . Auch die Beziehungen zwischen Pigmentierung und pleiotropen Merkmalen wie Verhalten 18 , 19 und Immunität 19 , 20 wurden ebenso erforscht wie die adaptive Bedeutung der Pigmentierungsmuster 15 , 21 , 22 . Als solches ist die Pigmentierung in D. melanogaster als eine mächtige und dennoch einfache m aufgetauchtOdel für die Entwicklung und Entwicklung von komplexen Phänotypen. Pigmentierung im erwachsenen D. melanogaster zeichnet sich durch deutliche Melanisierungsmuster über den Körper, besonders an den Flügeln und dem dorsalen Thorax und Bauch. Es ist die Pigmentierung jeder cuticular Platte (tergite) auf dem dorsalen Abdomen, jedoch, die die meisten Forschung Aufmerksamkeit erhalten hat. Es gibt eine beträchtliche Variation in dieser Pigmentierung (Abbildung 1A- F ), weil sowohl genetische 17 , 23 und Umwelt 24 , 25 Faktoren. Die Nagelhaut eines abdominalen Tergits besteht aus vorderen und hinteren Entwicklungsfächern (Abbildung 1G ), die jeweils je nach Pigmentierung und Ornamentierung weiter unterteilt werden können. Das vordere Fach umfasst sechs NagelhautTypen (a1-a6), und das hintere Kompartiment enthält drei (p1-p3) (Abbildung 1G ). Von diesen werden die p1, p2 und a1 Nagelhaut typischerweise unter dem Tergit in ungedehnten Abdomen gefaltet, so dass sie verborgen sind. Die zuverlässig sichtbare Nagelhaut zeichnet sich durch eine Bande von schwerer Pigmentierung aus, die hier als &quot;Pigmentband&quot; bezeichnet wird und aus Nagelhauttypen a4 (haarig mit mäßigen Borsten) und a5 (behaart mit großen Borsten) mit dem hinteren Rand des Bandes besteht Intensiver pigmentiert als die vordere Kante (Abbildung 1G ). Anterior zu dieser Band ist eine Region von leicht pigmentierten behaarten Nagelhaut, die Borsten nach hinten (a3) ​​aber nicht anteriorly (a2) hat. Eine Variation der Pigmentierung zwischen Fliegen wird sowohl in der Intensität der Pigmentierung als auch in der Breite des Pigmentbandes beobachtet. Im Allgemeinen ist die Variation am stärksten in den hintersten Segmenten (Bauchsegmente 5, 6 und 7) und ist in den anterioren Segmenten niedriger (abdominal seGionen 3 und 4) 24 . Darüber hinaus gibt es einen sexuellen Dimorphismus in D. melanogaster Pigmentierung, wobei Männer im Allgemeinen vollständig pigmentierte fünfte und sechste Bauch-Tergite (Abbildung 4C ) haben. In den meisten Untersuchungen der Bauchpigmentierung in D. melanogaster wurde die Pigmentierung als kategorisches oder ordinales Merkmal behandelt, wobei das Muster qualitativ 27 , 28 , 29 oder halbquantitativ auf einer Skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 gemessen wurde , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Diese Methoden leiden unweigerlich an einem Mangel an Präzision, und weil sie sich auf die subjektive Bewertung der Pigmentierung verlassen, ist es schwierig, die Daten über Studien zu vergleichen. Mehrere Autoren haben die räumlichen Dimensionen der Pigmentierung 38 , 39 , die Intensität der Pigmentierung eines bestimmten Häutchen Typ 23 , 25 , 39 , 40 oder die durchschnittliche Intensität der Pigmentierung über die Bauch-Tergit als Ganzes 41 , 42 , 43 quantifiziert. Dennoch messen diese Quantifizierungsmethoden nicht sowohl die Intensität als auch die räumliche Verteilung der Bauchpigmentierung gleichzeitig und erfassen daher nicht die Nuancen, wie sich die Pigmentierung über den Abd unterscheidetOminal tergite Weiterhin erfordern mehrere dieser Quantifizierungsverfahren 38 , 41 , 42 , 43 die Dissektion und Montage der Bauchhöhle. Dies ist sowohl zeitaufwändig als auch zerstört die Probe, so dass es für weitere morphologische Analysen nicht verfügbar ist. Als das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung der Bauchpigmentierung vertieft, werden anspruchsvollere Werkzeuge zur schnellen und präzisen Messung sowohl der räumlichen Verteilung als auch der Intensität der Pigmentierung erforderlich sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die digitale Bildanalyse zu nutzen, um eine replizierbare und präzisere Messung der Bauchpigmentierung in D. melanogaster zu erhalten . Die Methodik umfasst drei Stufen. Zuerst wird die erwachsene Fliege zerstörungsfrei montiert und ein digitales Bild des dorsalen Bauches genommen. Zweitens, mit einem ImageJ-Makro, der BenutzerDefiniert einen anterior-posterioren Streifen von Pixeln, der sich von der vorderen Seite der a2-Nagelhaut bis zum hinteren der a5-Nagelhaut (grüner Kasten, Abbildung 1G ) auf dem dritten und vierten Bauchsegment erstreckt. Der mittlere Pixelwert über die Breite dieses Streifens wird dann entlang seiner langen Achse extrahiert, wodurch ein Profil erzeugt wird, das die räumliche Verteilung und die Intensität der Pigmentierung einfängt, wenn es sich von der vorderen zur hinteren des Tergits ändert. Drittens wird ein R-Skript verwendet, um das Pigmentprofil mathematisch mit einem kubischen Spline zu beschreiben. Das R-Skript verwendet dann das Spline und seine erste und zweite Ableitung, um die Breite der a2-a5-Nagelhaut, die Breite des Pigmentbandes und die maximale und minimale Pigmentierung zu extrahieren. Die Methode quantifiziert daher sowohl die räumlichen Eigenschaften als auch die Tiefe der Bauchpigmentierung. Diese Methodik quantifiziert die Pigmentierung der dritten und vierten Bauch-Tergite,Die im Fokus zahlreicher früherer Studien 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 waren , entweder ausschließlich oder in Kombination mit mehr posterioren Tergiten. Obwohl weniger variabel als die fünfte und sechste Bauch-Tergite, die dritte und vierte Tergite sind nicht vollständig pigmentiert bei Männern, so dass dieses Protokoll kann sowohl für Männer und Frauen angewendet werden. Dennoch kann, wie hier gezeigt, das Protokoll verwendet werden, um die Pigmentierung in der fünften und sechsten Bauch-Tergite bei Frauen zu messen. Darüber hinaus sollten kleinere Modifikationen der Skripte, die verwendet werden, um die Eigenschaften des Pigmentierungsprofils zu extrahieren, das Verfahren zur Quantifizierung der Variation der Pigmentierung in einer Vielzahl von anderen verwendenOrganismen

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Biology Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Cold Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Control Software</td>
			<td>Micro-Manager v1.3.20</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>R 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDWE-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 75 Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Klarman Rulings, Inc.</td>
			<td>KR-867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

Pigmentierung ist ein morphologisch einfaches, aber sehr variables Merkmal, das oft anpassungsfähige Bedeutung hat. Es hat vielmehr als Modell für das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung von morphologischen Phänotypen gedient. Die Bauchpigmentierung in Drosophila melanogaster war besonders nützlich, so dass Forscher die Locus identifizieren können, die inter- und intraspezifischen Variationen in der Morphologie zugrunde liegen. Bisher wurde jedoch die D. melanogaster- Bauchpigmentierung weitgehend qualitativ durch Scoring statt quantitativ untersucht, was die Formen der statistischen Analyse begrenzt, die auf Pigmentationsdaten angewendet werden können. Diese Arbeit beschreibt eine neue Methodik, die die Quantifizierung verschiedener Aspekte des Bauchpigmentierungsmusters des erwachsenen D. melanogaster ermöglicht . Das Protokoll umfasst Probenmontage, Bildaufnahme, Datenextraktion und Analyse. Die gesamte Software, die für die Bildaufnahme und Analyse verwendet wird, verfügt über MakrosGeschrieben für Open-Source-Bildanalyse. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, Pigmentierungsmerkmale präzise zu messen, wobei eine Methodik verwendet wird, die über verschiedene Abbildungssysteme hoch reproduzierbar ist. Während die Technik verwendet wurde, um die Variation in den tergischen Pigmentierungsmustern des erwachsenen D. melanogaster zu messen , ist die Methodik flexibel und breit auf Pigmentierungsmuster in unzähligen verschiedenen Organismen anwendbar.

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Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

8.9K Aufrufe.  Lake Forest College.  Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung. 

Serie: Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ Labeling der mitochondrialen DNA - Replikation in Drosophila Adult Ovarien von EdU Anfärben

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Forschung

Genetik

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel have been described. However, a method to measure the amount of additional animal activity induced through the exercise treatment has been lacking. The Rotating Exercise Quantification System (REQS) fills this need, providing a measure of animal activity for animals experiencing rotational exercise. This protocol details how to use the REQS to assess animal activity during rotational exercise and illustrates the type of data that can be generated. Here, we demonstrate how the REQS is used to measure sex- and strain-specific differences in exercise induced activity. The REQS can also be used to evaluate the impact of various other experimental parameters such as age, diet, or population size on exercise induced activity. In addition, it can be used to compare the efficacy of different exercise training protocols. Importantly, it provides an opportunity to standardize exercise treatments between strains, allowing the researcher to achieve equal amounts of activity between groups if needed. Thus, the REQS is a notable new resource for exercise biologists working with the Drosophila model system and complements existing exercise systems.

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

The Rotating Exercise Quantification System (REQS) can induce exercise in Drosophila melanogaster through rotation while simultaneously measuring the amount of activity performed by the animals. Here, we present a point-by-point protocol detailing how to measure activity levels of animals experiencing rotational exercise treatments using the REQS.

Übung Messhöhen in Drosophila Melanogaster mit der rotierenden Bewegung Quantifizierung System (Anforderung)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

TreadWheel: Intervall Trainingsprotokoll sanft induzierte Bewegung in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small numbers of cells. Utilizing this technology to study development in the Drosophila visual system, which boasts a wealth of cell type-specific genetic tools, provides a powerful approach for addressing the molecular basis of development with precise cellular resolution. For such an approach to be feasible, it is crucial to have the capacity to reliably and efficiently purify cells present at low abundance within the brain. Here, we present a method that allows efficient purification of single cell clones in genetic mosaic experiments. With this protocol, we consistently achieve a high cellular yield after purification using fluorescence activated cell sorting (FACS) (~25% of all labeled cells), and successfully performed transcriptomics analyses on single cell clones generated through mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM). This protocol is ideal for applying transcriptomic and genomic analyses to specific cell types in the visual system, across different stages of development and in the context of different genetic manipulations.

Here, we present a cell dissociation protocol for efficiently isolating cells present at low abundance within the Drosophila visual system through fluorescence activated cell sorting (FACS).

Reinigung des Low-reichlich Zellen im visuellen System von Drosophila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic screening using chemical mutagens is a useful strategy for mapping mutant phenotypes to genes among Drosophila and other model organisms that share conserved cellular pathways with humans. If the mutated gene of interest is not lethal in early developmental stages of flies, a climbing assay can be conducted to screen for phenotypic indicators of decreased brain functioning, such as low climbing rates. Subsequently, secondary histological analysis of brain tissue can be performed in order to verify the neuroprotective function of the gene by scoring neurodegeneration phenotypes. Gene mapping strategies include meiotic and deficiency mapping that rely on these same assays can be followed by DNA sequencing to identify possible nucleotide changes in the gene of interest.

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

We present a protocol using a forward genetic approach to screen for mutants exhibiting neurodegeneration in Drosophila melanogaster. It incorporates a climbing assay, histology analysis, gene mapping and DNA sequencing to ultimately identify novel genes related to the process of neuroprotection.

In Vivo Forward Genetic Screen zur Identifizierung neuartiger neuroprotektive gene in Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, the mechanisms underlying TAD formation and boundaries are still under investigation. The application of the in-nucleus Hi-C method described here helped to dissect the function of architectural protein (AP)-binding sites at TAD boundaries isolating the Notch gene. Genetic modification of domain boundaries that cause loss of APs results in TAD fusion, transcriptional defects, and long-range topological alterations. These results provided evidence demonstrating the contribution of genetic elements to domain boundary formation and gene expression control in Drosophila. Here, the in-nucleus Hi-C method has been described in detail, which provides important checkpoints to assess the quality of the experiment along with the protocol. Also shown are the required numbers of sequencing reads and valid Hi-C pairs to analyze genomic interactions at different genomic scales. CRISPR/Cas9-mediated genetic editing of regulatory elements and high-resolution profiling of genomic interactions using this in-nucleus Hi-C protocol could be a powerful combination for the investigation of the structural function of genetic elements.

The genome is organized in the nuclear space into different structures that can be revealed through chromosome conformation capture technologies. The in-nucleus Hi-C method provides a genome-wide collection of chromatin interactions in Drosophila cell lines, which generates contact maps that can be explored at megabase resolution at restriction fragment level.

In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...