We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dal Comitato Northwestern University istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC). 1. modelli murini <ol><li> Utilizzare 8-12 settimane di età topi nella formazione esercizio. Per rilevare l&#39;autofagia esercitato indotta in vivo, utilizzare il topi transgenici GFP-LC3 (C57BL / 6 di fondo) per studi di imaging e C57BL / 6 topi per le analisi biochimiche. </li></ol> 2. L&#39;autofagia indotta da esercizio <ol><li> Messa a punto Treadmill - esercizio forzata <ol><li> Acclimatarsi e formare i topi in un 10 ° in salita tapis roulant aperto per 2 giorni. Il giorno 1, esercitare i topi per 5 min a 8 m / min, e il giorno 2, esercitare i topi per 5 min a 8 m / min seguito da un altro 5 min a 10 m / min 10. Incoraggiare i topi per eseguire delicatamente gomitata mano. </li><li> Il giorno 3 °, lasciare che i topi sottoposti a un singolo attacco di corsa per 90 minuti a 10 ° in salita tapis roulant, starting alla velocità di 10 m / min. Dopo 40 min, aumentare la velocità treadmill ad una velocità di 1 m / min ogni 10 min per un totale di 30 min, e quindi aumentare la velocità alla velocità di 1 m / min ogni 5 min fino a raggiungere 17 m / min, per un totale di 90 minuti di tempo di esercizio e 1.070 metri di corsa a distanza. </li><li> Impostare lo stimolo elettrico ad una gamma bassa intensità (1,2 Hz), e incoraggiare i topi a correre per evitare scosse piede ripetuto. </li><li> Per la raccolta dei tessuti, eutanasia i topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale immediatamente dopo l&#39;esercizio. Altri metodi approvati eutanasia possono anche essere utilizzati, come CO2 o iniezione IP di altri anestetici. Il livello di autofagia non sembra essere influenzata da metodi di eutanasia. </li></ol></li><li> Messa a punto della ruota Running - esercizio volontario <ol><li> Posizionare una rotella del mouse-esecuzione (11,4 cm) all&#39;interno di una gabbia con un mouse a singolo alloggiati. </li><li> Verificare la capacità corrente con una contachilometri bicicletta.Impostare il parametro della ruota [distanza (in mm) per ogni rotazione completa della ruota] a 358 (11.4 * π). Misurare la distanza in esecuzione dopo 24 ore. </li><li> Lasciate il mouse correre volontariamente per 2 settimane con la ruota in esecuzione. Per la raccolta dei tessuti, sacrificare il mouse al mattino dopo il periodo di esecuzione. </li></ol></li></ol> 3. L&#39;autofagia Flux valutazione <ol><li> Per misurare il flusso autofagica in condizioni di riposo e di esercizio, trattare i topi con la clorochina inibitore autofagia per tre giorni e confrontarle con topi trattati con PBS. <ol><li> Sciogliere clorochina in PBS (5 mg / ml), e iniettare clorochina in topi per via intraperitoneale alla dose di 50 mg / kg / giorno per tre giorni consecutivi. Sacrificio topi e raccogliere i tessuti 3 ore dopo l&#39;ultima iniezione. </li><li> Per i topi esercitati, li pretrattare con clorochina per due giorni consecutivi alla dose di 50 mg / kg / giorno. Il terzo giorno, iniettare i topi con la stessa concentrazione di clorochina, e dopo90 min li fanno correre sul tapis roulant per altri 90 min. </li><li> Euthanize topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale. Raccogliere tessuti immediatamente dopo l&#39;esecuzione, in modo che il tempo totale di incubazione della clorochina è la stessa di controllo (a riposo) topi (3 ore). NOTA: In alternativa, utilizzare una singola iniezione di clorochina per determinare il flusso autofagia nei tessuti di topo. </li></ol></li></ol> 4. Tessuto Raccolta e Fixation <ol><li> Prima della raccolta dei tessuti preparare tampone fosfato salino (PBS) e fresca 4% paraformaldeide (PFA, attenzione: dispositivi di protezione individuale richiesto) in PBS a un pH finale di 7,4. Conservare entrambe le soluzioni a 4 ° C. </li><li> Riempire 30 ml siringa con 15 - 20 ml di PFA 4% (per i topi GFP-LC3). Collegare la siringa con un ago G 20 del catetere. </li><li> Dopo l&#39;esercizio, eutanasia i topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Posto l&#39;animale su una superficie di lavoro pulita sul suo back. Tagliare e aprire la cavità toracica tagliando il diaframma per esporre il cuore. </li><li> Effettuare una piccola incisione sul fegato per lasciare il sangue uscire, e iniettare un totale di 15 ml 4% PFA lentamente nel ventricolo destro del cuore attraverso il catetere, fino al polmone e fegato girare completamente pallido. Profumato il mouse immediatamente dopo la sessione di esercizio, utilizzando una pompa a siringa con una portata costante di 90 ml / h. </li><li> Dopo la perfusione, rimuovere l&#39;ago e raccogliere i tessuti di interesse (ad esempio, del cervello 11 e muscolo scheletrico). Per muscolo scheletrico, sezionare vasto laterale. Brevemente, tirare la pelle della gamba all&#39;indietro per esporre i muscoli, localizzare il quadricipite femorale 12 e sezionare vasto laterale, che è il muscolo esterno collegato alla parte superiore dell&#39;osso femorale. </li><li> Per ulteriori fissazione e disidratazione, posizionare i tessuti di topi GFP-LC3 in 4% PFA per 24 ore a 4 ° C, e poi trasferirli al 15%saccarosio-PBS a 4 ° C durante la notte o fino a quando i tessuti sono stabiliti, e quindi al 30% di saccarosio-PBS a 4 ° C durante la notte o per più lunghi periodi. Conservare i campioni al buio per quanto possibile in quanto possono essere sensibili a luce intensa. </li><li> Per l&#39;analisi Western Blot scatto congelare i tessuti da C57BL / 6 topi direttamente in azoto liquido, e conservare a -80 ° C. </li></ol> 5. Analisi Imaging di GFP-LC3 Puncta <ol><li> processo Tissue <ol><li> Pre-trattare i tessuti (precedentemente fissate in PFA e conservati nel 30% di saccarosio) nel mezzo di inclusione come &quot;ottimali di taglio composto temperatura&quot; (OCT) per pochi minuti in una piccola capsula di Petri etichettati. </li><li> Trasferire il tessuto in una cryomold l&#39;etichetta che contiene abbastanza fresco di Office per coprire il tessuto. Orient superficie sezionamento verso il fondo della cryomold (sezione per il muscolo vasto laterale e sezione sagittale per la emi-cervello). Evitare la formazione di bolle. </li><li> freÈze campioni ponendo il cryomold per pochi minuti in un dispositivo di raffreddamento di schiuma coperto riempito con ghiaccio secco, fino PTOM diventa bianco. Avvolgere singoli campioni in fogli etichettati, chiuderli in un sacchetto di plastica, e conservarli a -80 ° C durante la notte o più a lungo. </li><li> Utilizzare un criostato per tagliare le sezioni di esempio con uno spessore di 10 micron, e montare le sezioni sulle slitte. Conservare i vetrini a -20 ° C, e sempre tenere i vetrini al riparo dalla luce, quando possibile. </li></ol></li><li> preparazione del vetrino <ol><li> Estrarre i vetrini dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente. Coprire la sezione di tessuto con una goccia di mezzo di montaggio con DAPI. Collocare un vetrino di dimensioni adeguate in cima ed evitare la formazione di bolle. </li><li> Utilizzare smalto per sigillare i bordi del vetrino, consentire smalto si asciughi al buio a temperatura ambiente, e quindi memorizzare le diapositive in un contenitore a tenuta di luce a 4 ° C, o procedere con l&#39;imaging cattura di GFP-LC3 puncta. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; La quantificazione di GFP - LC3 puncta al microscopio a fluorescenza <ol><li> Eseguire epifluorescenza, catturando le immagini nella stessa condizione (esposizione e le impostazioni) per tutti i campioni. Per GFP, utilizzare una lunghezza d&#39;onda di emissione di 525 nm; per DAPI, usare 490 nm. Acquisire almeno dieci immagini al campione utilizzando un obiettivo 60X per vasto laterale e la regione della corteccia frontale del cervello. </li><li> Quantificare il numero di GFP-LC3 puncta in una zona di tessuto di 2.500 micron 2 in ogni immagine per l&#39;analisi statistica, accecato per gruppi sperimentali. Calcolare il numero medio di 10 immagini di ogni campione, utilizzando la funzione di misura automatica di &quot;conteggio degli oggetti&quot;. Impostazioni per il muscolo vasto laterale sono: Soglia L = 10, H = 200; 2X liscia; 1X pulito, e le impostazioni per la corteccia frontale del cervello sono: Soglia L = 11, H = 200; 2X liscia; 1X pulito. </li></ol></li></ol> 6. occidentale Analisi Blot su autofagia Marcatori <ol><li> &lt;strong&gt; processo Tissue <ol><li> Preparare il tampone di lisi: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi (appena aggiunto). </li><li> Rimuovere il tessuto di C57BL 6 topi / da -80 ° C di stoccaggio. Tagliare il tessuto muscolare in piccoli pezzi con una lama di rasoio prima il seguente processo. Aggiungere 800 ml (per emi-cervello) o 500 ml (per vasto laterale) di tampone di lisi freddo al campione. Omogeneizzare il campione a 4 ° C con un omogeneizzatore ad una velocità media. </li><li> Completamente lisare la miscela omogeneizzata per altri 30 minuti per 1 ora a 4 ° C con rotazione. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C, scartare il pellet, e raccogliere il surnatante in una nuova provetta. </li></ol></li><li> analisi autofagia <ol><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​di lisati di tessuto utilizzando il kit di test BCA Protein in base alle specifiche del costruttore. Normalizzare ogni campionealla stessa concentrazione. </li><li> Unire il campione con il tampone 2x Laemmli in un rapporto 1: 1, far bollire a 95 ° C per 5 - 10 minuti, e procedere con l&#39;analisi Western Blot su autofagia marcatori 13, 14, come ad esempio P62 (anticorpo anti-P62, diluizione 1: 500) e LC3 (anticorpo anti-LC3, diluizione 1: 500). Lessare i campioni immediatamente dopo l&#39;aggiunta del tampone, come più incubazione in ghiaccio può generare più bande degradate LC3. </li><li> Quantificare P62 e LC3 bande di analisi densitometria utilizzando ImageJ, e normalizzare il valore al corrispondente banda di actina. </li></ol></li></ol>

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	<li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker.">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).</li><li>Tracy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BNIP3+is+an+RB/E2F+target+gene+required+for+hypoxia-induced+autophagy.">BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy.</a> Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).</li><li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+renovation+of+cells+and+tissues.">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li><li>Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+physiology+and+pathology+of+the+central+nervous+system.">Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system.</a> Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).</li><li>Rocchi, A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+of+autophagy+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders.</a> Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).</li><li>Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autophagy+in+cancer.">Role of autophagy in cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+BCL2-regulated+autophagy+is+required+for+muscle+glucose+homeostasis.">Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis.</a> Nature. 481, 511-515 (2012).</li><li>He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+induces+autophagy+in+peripheral+tissues+and+in+the+brain.">Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain.</a> Autophagy. 8, 4 (2012).</li><li>Kuramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+activation+by+novel+inducers+prevents+BECN2-mediated+drug+tolerance+to+cannabinoids.">Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids.</a> Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).</li><li>Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Treadmill+Fatigue+Test:+A+Simple,+High-throughput+Assay+of+Fatigue-like+Behavior+for+the+Mouse.">The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse.</a> JoVE. , (2016).</li><li>Navone, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+and+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells.">Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells.</a> Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12+Monitoring+Autophagic+Degradation+of+p62/SQSTM1.">Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1.</a> Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+(3rd+edition).">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12, 1-222 (2016).</li><li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+the+Pathogenesis+of+Disease.">Autophagy in the Pathogenesis of Disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li><li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion.">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+rapamycin+treatment+has+differential+effects+on+metabolism+in+mice.">Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice.</a> Cell Metab. 17, 456-462 (2013).</li><li>Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+functions+of+mTOR+inhibition.">Immunoregulatory functions of mTOR inhibition.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).</li><li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin-mediated+lifespan+increase+in+mice+is+dose+and+sex+dependent+and+metabolically+distinct+from+dietary+restriction.">Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction.</a> Aging Cell. 13, 10 (2014).</li><li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+exercise+stimulates+autophagy+in+normal+skeletal+muscles+but+is+detrimental+for+collagen+VI-deficient+muscles.">Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles.</a> Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).</li><li>Lira, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+exercise+training-induced+skeletal+muscle+adaptation+and+improvement+of+physical+performance.">Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).</li><li>Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+not+required+to+sustain+exercise+and+PRKAA1/AMPK+activity+but+is+important+to+prevent+mitochondrial+damage+during+physical+activity.">Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity.</a> Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).</li><li>Kregel, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resource+book+for+the+design+of+animal+exercise+protocols.">Resource book for the design of animal exercise protocols.</a> American Physiological Society. , 152 (2006).</li><li>Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstrain+variation+in+murine+aerobic+capacity.">Interstrain variation in murine aerobic capacity.</a> Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).</li><li>Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximal+metabolic+rates+during+voluntary+exercise,+forced+exercise,+and+cold+exposure+in+house+mice+selectively+bred+for+high+wheel-running.">Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running.</a> The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).</li><li>Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sprint+exercise+on+oxidative+stress+in+skeletal+muscle+and+liver.">Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver.</a> European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).</li><li>Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high-intensity+intermittent+swimming+on+glucose+transport+in+rat+epitrochlearis+muscle.">Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle.</a> J Appl Physiol. 84, 4 (1998).</li><li>Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+submaximal+oxygen+consumption+during+treadmill+running+in+mice.">Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice.</a> Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Autofagia è un processo catabolico che fornisce energia e riduce citotossicità dalla degradazione lisosomiale di anticitoplasma o organelli danneggiati. Studiare l&#39;autofagia è importante capire la regolazione dell&#39;omeostasi cellulare e meccanismi di risposta allo stress. Nuovi modelli e metodologie stanno emergendo nel campo della ricerca 15, per studiare come alterata autofagia contribuisce a numerosi processi patologici 16, 17. Privazione di nutrienti (inedia) e induzione farmacologica sono comunemente usati approcci per indurre autofagia in vitro e in vivo. Questi metodi, in particolare per i modelli animali, possono mostrare effetti negativi che possono influenzare i risultati complessivi. Ad esempio, dal momento che richiede almeno 48 ore di fame per indurre un livello rilevabile dell&#39;autofagia, gli animali non possono avere l&#39;energia necessaria per l&#39;attività motoria regolare,colpisce il risultato di molti studi comportamentali successivi. Eppure induttori farmacologici possono anche portare ad effetti collaterali a causa della loro mancanza di specificità al percorso autofagia. Il principale rapamicina autofagia induttore e suoi derivati sopprimere l&#39;attività di mTOR e causano disfunzioni metaboliche e immunosoppressione 18, 19, 20, che dovrebbe essere preso in considerazione nel progetto sperimentale per il trattamento a lungo termine. Così, abbiamo lavorato sui modi più fisiologico e robusti per l&#39;attivazione dell&#39;autofagia in modelli animali. Esercizio Recentemente noi ed altri hanno identificato come un efficace, sicuro autofagia induttore velocemente e in vivo 7, 8, 9. Entrambi esercizio costretto da tapis roulant e esercizio volontario eseguendo ruota sono stati utilizzati per analizzare gli effetti dell&#39;esercizio fisico sulla autofagia unctivation, con variazioni di durata e di intensità di esercizio 21, 22. Ad esempio, un&#39;ora di treadmill in esecuzione (Avvio a velocità di 10 m / min fino ad un massimo di 40 m / min) induce abbondante lipidation LC3 nel muscolo scheletrico 21, e la ruota volontaria a lungo termine in esecuzione per 3 mesi o 4 - 5 settimane aumenta anche basali autofagia e aumenta l&#39;espressione delle proteine autofagia nel muscolo scheletrico 21, 22. Qui abbiamo descritto e confrontato i due metodi (tapis roulant e ruota in esecuzione) di esercitare i topi, e presentato ottimizzato i protocolli più brevi ad alta efficienza in induzione autofagia. Ogni approccio ha i suoi pro e contro. Un singolo attacco di 90 minuti di esercizio fisico forzata sul tapis roulant è sufficiente per indurre l&#39;autofagia nel muscolo scheletrico e nel cervello. Abbiamo fatto un corso a tempo di tapis roulant esercizio 7, e ha scoperto che il Esercicondizioni SE qui descritte inducono il livello massimo di autofagia nel topo muscoli scheletrici, che viene convalidato anche da altri 23. In queste condizioni, i topi sottoposti a esercizio aerobico; come riportato in precedenza, l&#39;esercizio aerobico è indotta eseguendo prolungato con un graduale incremento velocità su un tapis roulant 24, 25, 26, mentre la condizione anaerobica si ottiene una breve durata di esercizio ad alta intensità, che aumenta la massa muscolare, ma non necessariamente aumentare esercizio la resistenza 27, 28. Inoltre, la velocità di funzionamento riportata qui in questo protocollo è correlata positivamente con capacità di consumo di ossigeno, con metodi indiretti per valutare la capacità aerobica 29. Pertanto, l&#39;esercizio aerobico su un tapis roulant è un modo veloce ed efficace per indurre l&#39;autofagia. Tuttavia, FORCEd in esecuzione in uno spazio chiuso può esercitare stress per topi. Così, per evitare di dare ulteriore stress per gli animali, usiamo dito trilli o nappe di filo come un metodo per mantenere i topi correre, anziché il built-in di scosse elettriche. Rispetto al treadmill, l&#39;uso di ruota portante ha molti vantaggi. E &#39;meno stressante, non necessita di tempo di osservazione dei ricercatori, ed è comodo per studiare gli effetti a lungo termine di attivazione autofagia. Eppure esercizio su una ruota in esecuzione è volontaria e genera quindi la variabilità in termini di esecuzione di distanza e velocità tra i diversi topi o lo stesso mouse su diversi giorni. Pertanto, è necessario eseguire topi su una ruota per un lungo periodo di tempo (ad esempio, diverse settimane) per ridurre al minimo la variabilità individuale. È importante sottolineare che l&#39;approccio richiede anche utilizzando un odometro notte per verificare che il mouse è effettivamente in esecuzione. Abbiamo misurato la distanza media di funzionamento di wild-type C57BL 6 topi / per un periodo di 2 settimane, e abbiamo trovato che corrono Approxinell&#39;intervallo 1 km / notte all&#39;inizio della formazione (giorno 1) e può funzionare fino a 8 - 10 km / notte al giorno 14. Nel complesso, la ruota portante è un metodo efficace per stimolare l&#39;autofagia nella maggior parte degli organi, anche se, è più difficile catturare accumulo dell&#39;autofagosoma nel muscolo scheletrico rispetto all&#39;utilizzo del tapis roulant. La ragione è che il muscolo scheletrico ha un elevato flusso autophagic e un tasso di degradazione rapida autofagosoma, che richiede la raccolta immediata del tessuto dopo l&#39;esecuzione per rilevare l&#39;induzione autofagia mediante misurazione puncta GFP-LC3. In entrambi i protocolli, rapida perfusione PFA e la fissazione dei tessuti dopo l&#39;eutanasia degli animali è un passaggio fondamentale della procedura di preservare le strutture autofagosoma che altrimenti si degrada facilmente durante la dissezione. Questo protocollo viene illustrato come utilizzare l&#39;esercizio aerobico per stimolare l&#39;autofagia nei tessuti di topo, tra cervello e muscoli scheletrici. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi della via autophagy in manutenzione di funzione del tessuto, come la manutenzione mitocondriale 23, e per studiare gli effetti a lungo termine di induzione autofagia sulla regolazione del comportamento e della salute dei modelli di malattie degli animali, come ad esempio potenziando gli effetti analgesici dei cannabinoidi 9. Entrambi i metodi di tapis roulant e ruota in esecuzione inducono un buon livello di autofagia; ma è importante prendere in considerazione le loro differenze al momento di scegliere l&#39;approccio migliore per soddisfare le diverse obiettivi di ricerca.

Autofagia è un percorso di degradazione evolutivamente conservato, che viene indotta in risposta a varie condizioni di stress come la fame e ipossia 1, 2. Durante l&#39;autofagia, vescicole a doppia membrana, chiamato autofagosomi, incorporano componenti subcellulari inutili o danneggiati e trasportarli nei lisosomi per la degradazione 3. Autofagia basale è essenziale per la funzione cellulare e lo sviluppo dell&#39;organismo, e alterata autofagia basale è implicato in molti disturbi, tra cui neurodegenerazione, tumorigenesi e diabete di tipo 2 4, 5, 6. Il più noto autofagia induttore fisiologico è fame. Tuttavia, ha due limitazioni principali. In primo luogo, la fame richiede un lungo periodo di indurre l&#39;autofagia in modo efficace negli animali, ad esempio, 48 ore di restrizione alimentare nei topinella maggior parte degli organi. In secondo luogo, la fame induce a malapena autofagia cervello, a causa di un apporto di sostanze nutritive relativamente stabile nel cervello. In realtà, è anche difficile da rilevare induzione autofagia dagli induttori di piccole molecole, come molti farmaci non possono passare la barriera emato-encefalica. Così, per analizzare meglio la funzione di attivazione dell&#39;autofagia nella patogenesi della malattia, abbiamo recentemente scoperto che l&#39;esercizio fisico è più potente metodo fisiologico per indurre autofagia in un breve periodo di tempo 7, 8, 9. Rispetto fame, autofagia è effettivamente indotta da tapis roulant in esecuzione veloce come 30 min. Pertanto, l&#39;esercizio fisico è un approccio fisiologico comodo e potente per studiare il meccanismo di autofagia nel mediare benefici per la salute e la prevenzione delle malattie. Ci sono diversi marcatori proteici per la rilevazione di attività autofagia, tra cui LC3 e P62. LC3 (associata ai microtubuli proteina 1A / 1B-luce cHain 3) è una proteina citoplasmatica (LC3-formo) che viene coniugato con PE (fosfatidiletanolamina) su induzione autofagia. LC3 PE-lipidated (modulo LC3-II) viene reclutato su membrane autophagosomal e può essere utilizzato per visualizzare autophagosomes quando etichettati con GFP. La sua traslocazione dal citosol puntata strutture di autophagosomes al microscopio è un&#39;indicazione di induzione autofagia. p62 è un recettore di carico per supporti autofagia (come proteine ​​ubiquitinazione), ed è incorporato autophagosomes pure. Poiché la proteina è degradata in lisosomi insieme autophagosomes, i suoi livelli possono essere usati per misurare il flusso autofagia. Qui mostriamo come utilizzare questi marcatori di quantificare l&#39;autofagia in diversi tessuti di topo indotte da esercizio aerobico, compreso l&#39;esercizio forzato (tapis roulant) e esercizio volontario (in esecuzione ruote). Le stesse procedure possono essere applicate anche alla misurazione in vivo dell&#39;autofagia dopo il trattamento di altri induttori.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Treadmill</td>
			<td style="width:204px;">Columbus Instruments</td>
			<td style="width:195px;">150-RM Exer 3/6</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mouse running wheel</td>
			<td style="width:204px;">Super Pet</td>
			<td style="width:195px;">100079365</td>
			<td>diameter 11.4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Odometer</td>
			<td style="width:204px;">Bell</td>
			<td style="width:195px;">DASHBOARD 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:204px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:195px;">KDS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:204px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">Model: inverted microscope ECLIPSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cryostat</td>
			<td style="width:204px;">Leica</td>
			<td style="width:195px;">CM 1850UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:204px;">IKA</td>
			<td style="width:195px;">003737001 / Model: T10 Basic S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Chloroquine</td>
			<td style="width:204px;">CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td>
			<td style="width:195px;">14194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Parafolmaldehye</td>
			<td style="width:204px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:195px;">P6148</td>
			<td>Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mounting media</td>
			<td style="width:204px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:195px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">p62 antibody</td>
			<td style="width:204px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:195px;">610833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:204px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:195px;">NB100-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:204px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:195px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">NIH</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activating autophagy by aerobic exercise in mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Questo protocollo descrive due diversi metodi per indurre l&#39;autofagia nei tessuti di topo di esercizio aerobico: un totale di 90 minuti di esercizio fisico forzato su un tapis roulant a più corsie preceduto da due giorni di acclimatazione; o due settimane di esercizio volontario su una ruota in esecuzione usato dai topi alloggiati individualmente. In ogni protocollo di esercizio, siamo in grado di misurare il flusso autofagia da microscopia a fluorescenza e l&#39;analisi Western Blot in vari organi. Abbiamo usato una linea di topo transgenico che esprimono GFP-LC3 etichettato come un sistema reporter per monitorare l&#39;autofagia con l&#39;esercizio 1. Al momento di induzione autofagia, LC3 trasloca dal citoplasma al autofagosoma in strutture puntiformi. Dopo il sezionamento, la formazione di GFP-LC3 puncta può essere direttamente visualizzato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 1A). In alternativa, strutture dell&#39;autofagosoma possono anche essere immunoistochimica da un anticorpo LC3 perimaging. O 90 minuti di esercizio treadmill o 2 settimane di corsa volontaria aumentato il numero di GFP-LC3 puncta sia muscolo scheletrico (vasto laterale) e nella corteccia cerebrale, rispetto alla condizione di riposo (Figura 1B). Va notato che la regione corteccia frontale è stato regione importante nel cervello dove autofagia è chiaramente indotta da entrambi i metodi finora. Esercizio anche indotto la conversione di LC3 dalla forma citosolica (LC3-I) alla forma lipidi coniugato (LC3-II), che può essere rilevato mediante analisi western blot (Figura 1C). incremento Esercizio indotta autophagosomes (rappresentate da LC3-II e GFP-LC3 puncta) è dovuto ad un flusso autophagic elevata, piuttosto che un blocco nella degradazione autofagosoma, valutata mediante l&#39;uso di inibitori di degradazione lisosomiale, come bafilomicina A1 o clorochina . Qui abbiamo misurato il degrado del autofagica p62 recettore carico come un exampio. Esercizio (90 min di treadmill) ha causato una maggiore degradazione di p62 nel muscolo scheletrico rispetto alla condizione di riposo, che è stato salvato da iniezione con clorochina prima dell&#39;esercizio (Figura 2). I risultati simili si osservano anche con l&#39;esercizio fisico volontario eseguendo ruote. Così, l&#39;esercizio aerobico con tapis roulant o in esecuzione ruote induce l&#39;autofagia in vivo, misurato dal livello di stato stazionario di LC3 e la degradazione di p62. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig1.jpg" /> Figura 1. Esercizio aerobico Induce autofagia in mouse tessuti. Immagini rappresentative (A) e la quantificazione (B) di GFP-LC3 puncta nel muscolo scheletrico (vasto laterale) e il cervello (corteccia frontale) di GFP-LC3 topi transgenici sotto la condizione di controllo (a riposo), dopo 90 minuti di esercizio fisico forzato (tapis roulant ) o dopo 2 settimane di esercizio volontario (ruota). Risultatos rappresentano media ± SEM di 10 immagini al mouse. N = 5 topi. I seguenti lunghezze d&#39;onda di emissione sono stati utilizzati: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) la rilevazione Western Blot di LC3 nel muscolo scheletrico (vasto laterale) da topi riposato e esercitate (dal tapis roulant). dati di quantificazione rappresentano il livello di LC3-II normalizzata actina (sinistra) e il rapporto di LC3-II LC3-I (a destra). N = 3 topi. Statistica sta confrontando ogni valore al campione di controllo. I risultati rappresentano media ± sem *, P &lt;0.05; **, P &lt;0,01; ***, P &lt;0.001, t-test. barra della scala, 25 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55099/55099fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;esercizio fisico aumenta autofagia Flux in mouse muscolo scheletrico. (A) Western blotrilevamento di p62 nel vasto laterale di topi riposato e esercitato in presenza o assenza degli inibitori lisosomiali clorochina. (B) (Sinistra) analisi Quantificazione di p62 normalizzata per fascia di actina. (Destro) Il flusso p62 è determinata sottraendo il valore densitometrica normalizzato di p62 PBS trattati da quella di p62 clorochina-trattata. I risultati rappresentano media ± SEM n = 3 topi. *, P &lt;0,05, t-test. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55099/55099fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l&#39;esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l&#39;autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi.

Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  Northwestern University.  attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l'esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l'autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi. 

Video: Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Block Microcosmi per decomposizione controllata tessuti vegetali da Funghi aerobica

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Ricerca

Biologia

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Determinare il contributo dei sistemi di energia durante l&#39;allenamento

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Micropuntura dello spazio di Bowman in topi nei paraggi 2 Photon microscopia

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...