We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Northwestern (IACUC). 1. Los modelos de ratones <ol><li> Utilice los ratones 8-12 semanas de edad, en la práctica de ejercicio. Para detectar la autofagia inducida ejercido in vivo, utilizar los ratones transgénicos GFP-LC3 (C57BL / 6 antecedentes) para estudios de imagen y ratones C57BL / 6 para los análisis bioquímicos. </li></ol> 2. La autofagia inducida por el ejercicio <ol><li> Configuración cinta de correr - forzado ejercicio <ol><li> Aclimatarse y entrenar a los ratones en una cinta abierta hacia arriba 10 ° durante 2 días. En el día 1, ejercer los ratones durante 5 min a 8 m / min, y en el día 2, ejercer los ratones durante 5 min a 8 m / min seguido de otro 5 min a 10 m / min 10. Alentar a los ratones a correr por el codazo suave mano. </li><li> En el 3er día, dejar que los ratones sometidos a una única serie de correr durante 90 minutos en el 10 ° cinta de correr cuesta arriba, starting a la velocidad de 10 m / min. Después de 40 min, aumentar la velocidad de la cinta a una velocidad de 1 m / min cada 10 min durante un total de 30 min, y luego aumentar la velocidad a la velocidad de 1 m / min cada 5 min hasta que llega a 17 m / min, para un total de 90 minutos de tiempo de ejercicio y 1.070 metros de distancia de funcionamiento. </li><li> Ajuste el estímulo eléctrico a una gama de baja intensidad (1,2 Hz), y animar a los ratones a correr para evitar una descarga repetida pie. </li><li> Para la recogida de tejidos, la eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical inmediatamente después del ejercicio. Otros métodos de eutanasia aprobadas también se pueden utilizar, tal como CO2 o inyección IP de otros anestésicos. no parece ser afectada por el método de eutanasia El nivel de la autofagia. </li></ol></li><li> Configuración de rueda para correr - ejercicio voluntario <ol><li> Coloque una rueda del ratón-funcionamiento (11,4 cm de diámetro) dentro de una jaula con un alojados solo ratón. </li><li> Comprobar la capacidad de funcionamiento utilizando un odómetro de la bicicleta.Configurar el parámetro de la rueda [distancia (en mm) por la rotación completa de la rueda] en 358 (11,4 * π). Medir la distancia recorrida después de 24 horas. </li><li> Deje que el ratón funciona de manera voluntaria durante 2 semanas con la rueda de funcionamiento. Para la recogida de tejidos, sacrificar el ratón en la mañana después del período de rodaje. </li></ol></li></ol> 3. La autofagia Evaluación Flux <ol><li> Para medir el flujo de autofagia en condiciones de reposo y de ejercicio, el tratamiento de ratones con el inhibidor de la autofagia cloroquina durante tres días y compararlos con los ratones tratados con PBS. <ol><li> Disolver la cloroquina en PBS (5 mg / ml), e inyectar la cloroquina en ratones por vía intraperitoneal a la dosis de 50 mg / kg / día durante tres días consecutivos. Sacrificar los ratones y recoger tejidos de 3 horas después de la última inyección. </li><li> Para los ratones ejercidas, pretratar con cloroquina durante dos días consecutivos a una dosis de 50 mg / kg / día. En el tercer día, se inyecta a los ratones con la misma concentración de cloroquina, y después de90 min dejar correr en la cinta durante otros 90 min. </li><li> La eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical. Recoger los tejidos inmediatamente después de ejecutar, de manera que el tiempo total de incubación de la cloroquina es la misma que los ratones (en reposo) de control (3 h). NOTA: También puede utilizar una única inyección de cloroquina para determinar el flujo de la autofagia en tejidos de ratón. </li></ol></li></ol> 4. Tejido de cosecha y Fijación <ol><li> Antes de la cosecha de tejidos preparar una solución salina tamponada con fosfato (PBS) y fresco 4% de paraformaldehído (PFA, precaución: equipo de protección personal requerido) en PBS a un pH final de 7,4. Almacenar ambas soluciones a 4 ° C. </li><li> Llenar la jeringa de 30 ml con 15 - 20 ml de PFA al 4% (para los ratones GFP-LC3). Conectar la jeringa con una aguja de 20 G catéter. </li><li> Después del ejercicio, la eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical. </li><li> Colocar el animal sobre una superficie de trabajo limpia en su back. Cortar y abrir la cavidad torácica por el diafragma de corte para exponer el corazón. </li><li> Hacer una pequeña incisión en el hígado para permitir que la sangre salga, e inyectar un total de 15 ml 4% PFA lentamente hacia el ventrículo derecho del corazón a través del catéter, hasta que el pulmón y el hígado se vuelven completamente pálido. Perfundir el ratón inmediatamente después de la sesión de ejercicio, utilizando una bomba de jeringa con un caudal constante de 90 ml / hr. </li><li> Después de la perfusión, retire la aguja y recoger tejidos de interés (por ejemplo, el cerebro y el músculo esquelético 11). Para el músculo esquelético, diseccionar el músculo vasto lateral. En pocas palabras, tirar de la piel de la pierna hacia atrás para exponer los músculos, localizar los cuádriceps femoral 12, y diseccionar vasto externo, que es el músculo externo conectado a la parte superior del hueso del fémur. </li><li> Para mayor fijación y deshidratación, colocar los tejidos de ratones GFP-LC3 en PFA al 4% durante 24 horas a 4 ° C, y luego transferirlos a 15%sacarosa-PBS a 4 ° C durante la noche o hasta que los tejidos se han establecido y, a continuación, a 30% de sacarosa-PBS a 4 ° C durante la noche o para un almacenamiento más largo. Mantener las muestras en la oscuridad tanto como sea posible, ya que pueden ser sensibles a la luz intensa. </li><li> Para el análisis de transferencia de Western congelamiento rápido los tejidos de ratones C57BL / 6 ratones directamente en nitrógeno líquido, y almacenar a -80 ° C. </li></ol> 5. Análisis de Imágenes de GFP-LC3 puntos lagrimales <ol><li> proceso de tejido <ol><li> Pre-tratamiento de los tejidos (previamente fijadas en PFA y almacenados en sacarosa al 30%) en medio de inclusión como &quot;compuesto de la temperatura óptima de corte&quot; (OCT) durante unos minutos en una placa de Petri etiquetada pequeña. </li><li> Transferir el tejido en un criomolde marcado que contiene suficiente octubre fresca para cubrir el tejido. Oriente la superficie de seccionamiento hacia la parte inferior de la criomolde (sección transversal para el músculo vasto lateral y corte sagital de la hemi-cerebro). Evitar la formación de burbujas. </li><li> Freeze las muestras colocando el criomolde durante unos minutos en un enfriador de espuma cubierto con hielo seco, hasta la OCT se vuelve blanco. Envolver las muestras individuales en láminas etiquetados, sellarlos en una bolsa de plástico, y almacenar a -80 ° C durante la noche o más. </li><li> Utilice un criostato para cortar secciones de la muestra con un espesor de 10 micras, y montar las secciones en las diapositivas. Almacenar las diapositivas a -20 ° C, y mantener siempre las diapositivas lejos de la luz siempre que sea posible. </li></ol></li><li> preparación de los portaobjetos <ol><li> Retirar los portaobjetos del congelador y descongelar a temperatura ambiente. Cubrir la sección de tejido con una gota de medio de montaje con DAPI. Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado en la parte superior y evitar la formación de burbujas. </li><li> Use esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos, permitir que el esmalte de uñas se seque en la oscuridad a temperatura ambiente, y luego almacenar los portaobjetos en un recipiente hermético a la luz a 4 ° C, o proceder con la captura de imágenes de puntos lagrimales GFP-LC3. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; La cuantificación de GFP - LC3 puntos lagrimales mediante microscopía de fluorescencia <ol><li> Realizar microscopía de epifluorescencia, la captura de imágenes en el mismo estado (ajustes de exposición y) para todas las muestras. Para GFP, utilice una longitud de onda de emisión de 525 nm; para DAPI, utilice 490 nm. Adquirir al menos diez imágenes por muestra usando un objetivo de 60X para vasto lateral y la región de la corteza frontal del cerebro. </li><li> Cuantificar el número de puntos lagrimales GFP-LC3 en un área de tejido de 2.500 m 2 en cada imagen para el análisis estadístico, ciego para los grupos experimentales. Calcular el promedio de 10 imágenes de cada muestra, utilizando la función de medición automática de &quot;recuento de objetos&quot;. Ajustes para el músculo vasto lateral son: Umbral L = 10, H = 200; 2X liso; 1X limpia, y la configuración de la corteza frontal del cerebro son: Umbral L = 11, H = 200; 2X liso; 1X limpia. </li></ol></li></ol> 6. Análisis Western Blot en la autofagia Marcadores <ol><li> &lt;strong&gt; proceso de Tejidos <ol><li> Preparar el tampón de lisis: 50 mM Tris-HCl; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; 1% Triton X-100; inhibidor de la proteasa y el inhibidor de fosfatasa (recién añadido). </li><li> Eliminar el tejido de los ratones C57BL / 6 de -80 ° C de almacenamiento. Cortar el tejido muscular en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar antes de la siguiente proceso. Añadir 800 l (por hemi-cerebro) o de 500 l (por vasto lateral) de tampón de lisis frío a la muestra. Homogeneizar la muestra a 4 ° C con un homogeneizador a una velocidad media. </li><li> lisar completamente la mezcla se homogeneizó durante otros 30 minutos a 1 hora a 4 ° C con rotación. </li><li> Centrifugar el homogeneizado a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C, desechar el sedimento, y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo. </li></ol></li><li> análisis de la autofagia <ol><li> Determinar la concentración de proteína de lisados ​​de tejido utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Normalizar cada muestraa la misma concentración. </li><li> Combinar la muestra con el tampón de muestra 2x Laemmli en una proporción 1: 1, hervir a 95 ° C durante 5 a 10 min, y proceder con el análisis de transferencia Western en la autofagia marcadores 13, 14, tales como p62 anticuerpo anti-p62 (, dilución 1: 500) y LC3 anticuerpo anti-LC3 (, 1: 500 dilución). Hervir las muestras inmediatamente después de la adición del tampón de muestra, como de incubación más largo en el hielo puede generar múltiples bandas degradadas de LC3. </li><li> Cuantificar p62 y LC3 bandas por análisis de densitometría utilizando ImageJ, y normalizar el valor de la banda de actina correspondiente. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

La autofagia es un proceso catabólico que proporciona energía y reduce la citotoxicidad por la degradación lisosomal de los componentes del citoplasma o orgánulos dañados. El estudio de la autofagia es importante comprender la regulación de la homeostasis celular y los mecanismos de respuesta al estrés. Nuevos modelos y metodologías están emergiendo en el campo de investigación de 15, para estudiar cómo la autofagia alterada contribuye a numerosos procesos patológicos 16, 17. La privación de nutrientes (inanición) y la inducción farmacológica se usan comúnmente enfoques para inducir la autofagia in vitro e in vivo. Estos métodos, especialmente para los modelos animales, pueden mostrar efectos adversos que pueden influir en los resultados generales. Por ejemplo, ya que requiere al menos 48 horas de inanición para inducir un nivel detectable de la autofagia, los animales pueden no haber energía necesaria para la actividad de motor regular, queafecta el resultado de muchos estudios de comportamiento siguientes. Sin embargo, inductores farmacológicos también pueden dar lugar a efectos secundarios debido a su falta de especificidad a la vía de la autofagia. La principal rapamicina autofagia inductor y sus derivados suprimen la actividad mTOR y provocan disfunción metabólica y la inmunosupresión 18, 19, 20, que debe ser tomado en consideración en el diseño experimental para el tratamiento a largo plazo. Por lo tanto, hemos estado trabajando sobre las formas más robustas y fisiológicos para la activación de la autofagia en modelos animales. Recientemente ejercicio y otros han identificado como una solución eficaz, más rápido y más seguro inductor de la autofagia en vivo 7, 8, 9. Tanto el ejercicio forzado por cinta de correr y el ejercicio voluntario mediante la ejecución de la rueda se han utilizado para analizar los efectos del ejercicio en la autofagia unactivation, con variaciones en la duración del ejercicio e intensidad 21, 22. Por ejemplo, una hora de carrera en cinta rodante (a partir de la velocidad de 10 m / min hasta un máximo de 40 m / min) induce abundante lipidación LC3 en el músculo esquelético 21, y la rueda voluntaria a más largo plazo se ejecuta durante 3 meses o 4 - 5 semanas también aumenta la autofagia basal y aumenta la expresión de proteínas en el músculo esquelético autofagia 21, 22. Aquí describimos y se compararon los dos métodos (cinta rodante y la rueda de marcha) para ejercer los ratones, y presentó optimizado protocolos más cortos con una alta eficiencia en la inducción de la autofagia. Cada método tiene ventajas y desventajas. Una sola sesión de 90 minutos de ejercicio en cinta rodante forzada es suficiente para inducir la autofagia en el músculo esquelético y el cerebro. Hemos hecho un curso de tiempo de ejercicio en cinta ergométrica 7, y se encontró que el exerciSE condiciones descritas aquí inducen el nivel máximo de la autofagia en músculo esquelético del ratón, que también está validada por otros 23. En estas condiciones, los ratones se someten a ejercicio aeróbico; como se informó anteriormente, el ejercicio aeróbico es inducida mediante la ejecución prolongada con aumentos graduales de velocidades en una cinta de correr 24, 25, 26, mientras que la condición anaeróbica se obtiene por un corto período de ejercicio de alta intensidad, lo que aumenta la masa muscular, pero no necesariamente a mejorar el ejercicio la resistencia 27, 28. Por otra parte, la velocidad de circulación se informó aquí en este protocolo se correlaciona positivamente con la capacidad de consumo de oxígeno, por métodos indirectos para evaluar la capacidad aeróbica 29. Por lo tanto, el ejercicio aeróbico sobre una cinta de correr es una forma rápida y eficaz para inducir la autofagia. Sin embargo, forced que se ejecuta en un espacio cerrado puede ejercer el estrés a los ratones. Por lo tanto, para evitar dar un estrés adicional a los animales, utilizamos el dedo empuja o borlas de alambre como un método para mantener los ratones corriendo, en lugar de la incorporada en el choque eléctrico. En comparación con la cinta, el uso de la rueda de rodadura tiene muchas ventajas. Es menos estresante, no requiere tiempo de observación de los investigadores, y es conveniente para estudiar los efectos a largo plazo de la activación de la autofagia. Sin embargo, el ejercicio en una rueda de correr es voluntaria y por lo tanto genera variabilidad en términos de la distancia de funcionamiento y la velocidad entre los diferentes ratones o el mismo ratón en días diferentes. Por lo tanto, es necesario ejecutar los ratones en una rueda durante un período prolongado de tiempo (por ejemplo, varias semanas) para minimizar la variabilidad individual. Es importante destacar que el enfoque también requiere la utilización de un cuentakilómetros en la noche para verificar que el ratón está en realidad en funcionamiento. Se midió la distancia promedio de ejecución de ratones C57BL / 6 de tipo salvaje durante un período de 2 semanas, y se encontró que corren aproximadamente 1 km / noche en el comienzo de la formación (día 1) y se puede ejecutar hasta 8 - 10 km / noche en el día 14. En general, la rueda de correr es un método eficaz para estimular la autofagia en la mayoría de los órganos, si bien, es más difícil para capturar la acumulación autofagosoma en el músculo esquelético en comparación con el uso de la cinta de correr. La razón es que el músculo esquelético tiene un alto flujo autophagic y una tasa de degradación autophagosome rápido, que requiere la recolección inmediata del tejido después de correr para detectar la inducción de la autofagia por medición puntos lagrimales GFP-LC3. En cualquiera de los protocolos, la rápida perfusión PFA y la fijación de los tejidos después de la eutanasia de los animales es un paso crítico del procedimiento para conservar las estructuras autofagosoma que son de otra manera degradan fácilmente durante la disección. Este protocolo se muestra cómo utilizar el ejercicio aeróbico para estimular la autofagia en tejidos de ratón, incluyendo el cerebro y el músculo esquelético. Estos métodos se pueden utilizar para estudiar los mecanismos de la vía de la autofagia en el mantenimiento de la función de los tejidos, tales como el mantenimiento mitocondrial de 23 años, y para estudiar los efectos a largo plazo de la inducción de la autofagia en la regulación del comportamiento y la salud de modelos de enfermedad animal, tales como la mejora de los efectos analgésicos de los cannabinoides 9. Tanto los métodos de cinta rodante y la rueda para correr inducen un buen nivel de autofagia; sin embargo, es importante tener en cuenta sus diferencias a la hora de elegir el mejor enfoque para satisfacer diferentes objetivos de investigación.

La autofagia es una vía de degradación evolutivamente conservado, que se induce en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como el hambre y la hipoxia 1, 2. Durante la autofagia, las vesículas de doble membrana, llamados autofagosomas, incorporan componentes subcelulares innecesarias o dañadas y los transportan hacia los lisosomas para la degradación 3. Autofagia basal es esencial para la función celular y el desarrollo organismo, y alteración de la autofagia basal está implicado en muchos trastornos, incluyendo neurodegeneración, la tumorigénesis y la diabetes 4, 5, 6 tipo 2. El más conocido inductor de la autofagia fisiológica es el hambre. Sin embargo, tiene dos limitaciones importantes. En primer lugar, el hambre toma un largo período de inducir la autofagia con eficacia en animales, por ejemplo, 48 horas de restricción de alimentos en ratonesen la mayoría de órganos. En segundo lugar, el hambre apenas induce la autofagia cerebro, debido a un suministro de nutrientes relativamente estable en el cerebro. De hecho, también es difícil de detectar la inducción de la autofagia por inductores de molécula pequeña, como muchos fármacos no pueden pasar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, para analizar mejor la función de activación de la autofagia en la patogénesis de enfermedades, recientemente hemos descubierto que el ejercicio es un método fisiológico más potente para inducir la autofagia en un corto período de tiempo 7, 8, 9. En comparación con el hambre, la autofagia se induce de manera efectiva mediante la ejecución de cinta de correr tan rápido como 30 minutos. Por lo tanto, el ejercicio es un enfoque fisiológico conveniente y potente para estudiar el mecanismo de la autofagia en la mediación de beneficios para la salud y la prevención de enfermedades. Hay varios marcadores de proteínas para la detección de la actividad de la autofagia, incluyendo LC3 y p62. LC3 (proteína asociada a los microtúbulos 1A / 1B-c luzhain 3) es una proteína citosólica (LC3-I de forma) que está conjugado con PE (fosfatidiletanolamina) a la inducción de la autofagia. LC3 lipidada-PE (forma LC3-II) es reclutado en las membranas de autophagosomal y se puede utilizar para visualizar autofagosomas cuando están marcados con GFP. Su translocación desde el citosol a punctata estructuras de autofagosomas bajo microscopía es una indicación de la inducción de la autofagia. p62 es un receptor de carga para sustratos autofagia (tales como proteínas de ubiquitinación), y se incorpora en autofagosomas también. Dado que la proteína se degrada en los lisosomas, junto con autofagosomas, sus niveles se pueden utilizar para medir el flujo la autofagia. Aquí mostramos cómo utilizar estos marcadores para cuantificar la autofagia en diferentes tejidos de ratón inducidos por el ejercicio aeróbico, incluyendo ejercicio forzado (cinta) y el ejercicio voluntario (con ruedas de rodamiento). Los mismos procedimientos se pueden aplicar también a la medición in vivo de la autofagia después del tratamiento de otros inductores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Treadmill</td>
			<td style="width:204px;">Columbus Instruments</td>
			<td style="width:195px;">150-RM Exer 3/6</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mouse running wheel</td>
			<td style="width:204px;">Super Pet</td>
			<td style="width:195px;">100079365</td>
			<td>diameter 11.4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Odometer</td>
			<td style="width:204px;">Bell</td>
			<td style="width:195px;">DASHBOARD 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:204px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:195px;">KDS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:204px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">Model: inverted microscope ECLIPSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cryostat</td>
			<td style="width:204px;">Leica</td>
			<td style="width:195px;">CM 1850UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:204px;">IKA</td>
			<td style="width:195px;">003737001 / Model: T10 Basic S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Chloroquine</td>
			<td style="width:204px;">CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td>
			<td style="width:195px;">14194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Parafolmaldehye</td>
			<td style="width:204px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:195px;">P6148</td>
			<td>Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mounting media</td>
			<td style="width:204px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:195px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">p62 antibody</td>
			<td style="width:204px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:195px;">610833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:204px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:195px;">NB100-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:204px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:195px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">NIH</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activating autophagy by aerobic exercise in mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Este protocolo describe dos métodos diferentes para inducir la autofagia en tejidos de ratón de ejercicio aeróbico: un total de 90 minutos de ejercicio en una cinta rodante forzada de varios carriles precedida por dos días de aclimatación; o dos semanas de ejercicio voluntario en una rueda de funcionamiento utilizado por los ratones alojados individualmente. En cada protocolo de ejercicio, podemos medir el flujo autofagia mediante microscopía de fluorescencia y análisis de Western blot en diversos órganos. Se utilizó una línea de ratones transgénicos que expresan GFP-LC3 etiquetado como un sistema indicador para controlar la autofagia por el ejercicio 1. Tras la inducción de la autofagia, LC3 transloca desde el citosol a la autofagosoma en estructuras puntiformes. Después de seccionar, la formación de puntos lagrimales GFP-LC3 puede estar directamente visualizó por microscopía de fluorescencia (Figura 1A). Alternativamente, las estructuras también se pueden autofagosoma inmunotiñeron por un anticuerpo LC3 paraformación de imágenes. O bien 90 minutos de ejercicio caminadora o 2 semanas de carrera voluntaria aumentaron el número de puntos lagrimales GFP-LC3 tanto en el músculo esquelético (vasto externo) y la corteza cerebral, en comparación con la condición de reposo (Figura 1B). Cabe señalar que la región de la corteza frontal ha sido la región principal en el cerebro donde la autofagia está claramente inducida por cualquiera de los métodos hasta ahora. El ejercicio también induce la conversión de LC3 de la forma citosólica (LC3-I) a la forma conjugados de lípidos (LC3-II), que se puede detectar por análisis de transferencia Western (Figura 1C). incremento inducido por el ejercicio de autofagosomas (representados por LC3-II y GFP-LC3 puntos lagrimales) se debe a un flujo autophagic elevada, en lugar de un bloque en la degradación autophagosome, evaluada por el uso de inhibidores de la degradación lisosomal, tales como bafilomicina A1 o cloroquina . A continuación se midió la degradación de la autofagia p62 del receptor de carga como examplio. El ejercicio (90 min de cinta de correr) causó una mayor degradación de p62 en el músculo esquelético de la condición de reposo, que fue rescatado por inyección con cloroquina antes del ejercicio (Figura 2). Los resultados similares se observan también con el ejercicio voluntario de ruedas corriendo. Por lo tanto, el ejercicio aeróbico por las ruedas de la máquina para correr o correr induce la autofagia en vivo, medida por el nivel de estado estacionario de LC3 y la degradación de p62. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig1.jpg" /> Figura 1. El ejercicio aeróbico Induce la autofagia en el ratón tejidos. Imágenes representativas (A) y cuantificación (B) de los puntos lagrimales GFP-LC3 en el músculo esquelético (vasto externo) y el cerebro (corteza frontal) de ratones transgénicos GFP-LC3 bajo la condición de control (en reposo), después de 90 minutos de ejercicio forzado (cinta de correr ) o después de 2 semanas de ejercicio voluntario (rueda). Resultados representan la media ± SEM de 10 fotografías por ratón. N = 5 ratones. Se utilizaron las siguientes longitudes de onda de emisión: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) de detección de transferencia Western de LC3 en el músculo esquelético (vasto lateral) de ratones descansado y ejercidos (por cinta). Cuantificación de datos representan el nivel de LC3-II normalizó a la actina (izquierda) y la relación de LC3-II a LC3-I (derecha). N = 3 ratones. Estadística está comparando cada valor de la muestra de control. Los resultados representan la media ± SEM *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,01; ***, P &lt;0,001, prueba t. Barra de escala, 25 micras. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55099/55099fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig2.jpg" /> Figura 2. El ejercicio aumenta el flujo autofagia en ratón músculo esquelético. (A) Western blotdetección de p62 en el vasto externo de ratones descansado y ejercidos en la presencia o ausencia de inhibidores de la cloroquina lisosomales. (B) (izquierda) análisis de cuantificación de p62 normalizado a la banda de actina correspondiente. (Derecha) El flujo de p62 se determina restando el valor densitométrico normalizado de p62 tratado con PBS de la de p62 cloroquina tratados. Los resultados representan la media ± SEM N = 3 ratones. *, P &lt;0,05, prueba t. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55099/55099fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

activación autofagia es beneficioso en la prevención de una serie de enfermedades. Uno de los enfoques fisiológicos para inducir la autofagia in vivo es el ejercicio físico. Aquí mostramos cómo activar la autofagia mediante el ejercicio aeróbico y medir los niveles de autofagia en ratones.

La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

activating-autophagy-by-aerobic-exercise-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K vistas.  Northwestern University.  activación autofagia es beneficioso en la prevención de una serie de enfermedades. Uno de los enfoques fisiológicos para inducir la autofagia in vivo es el ejercicio físico. Aquí mostramos cómo activar la autofagia mediante el ejercicio aeróbico y medir los niveles de autofagia en ratones. 

Video: Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Bloque de agar-microcosmos de descomposición controlada de Tejidos Vegetales de hongos aerobios

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Investigación

Biología

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

Determinación de la Contribución de los Sistemas de energía durante el ejercicio

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Expresión transitoria de proteínas por hidrodinámico entrega de genes en ratones

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Análisis de la autofagia en<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

Estudio de las interacciones proteína-proteína en la autofagia investigación

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Tinción Inmunofluorescente In Situ de Autofagia en Células Madre Musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

Micropunción del espacio de Bowman en ratones por 2 fotones microscopía

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...