We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).

動物に関わるすべての手順は、ノースウェスタン大学施設内動物管理使用委員会（IACUC）により承認ガイドラインに従って行いました。 1.マウスモデル<ol><li>運動トレーニングに8-12週齢のマウスを使用してください。 生体内で行使により誘導されるオートファジーを検出するために、イメージング研究および生化学的分析のためのC57BL / 6マウスのためのGFP-LC3トランスジェニックマウス（C57BL / 6バックグラウンド）を使用します。 </li></ol> 2.運動誘発オートファジー<ol><li> トレッドミルのセットアップ-強制運動 <ol><li>順応し、2日間10℃上り坂オープントレッドミル上でマウスを訓練します。 1日目に8メートル/分で5分間、マウスを行使し、2日目に8 mでは5分間のマウス運動/分10m /分10でさらに5分間続きます。優しい手ナッジによって実行するために、マウスを奨励します。 </li><li> 3日目に、マウスが10°上り坂トレッドミル、startiで90分間実行して、単一の試合を受けてみましょう10m /分の速度でngの。 40分後、30分の合計は1メートル/ 10分毎分の速度で、トレッドミルの速度を増加させ、そしてその後17メートル/分に達するまで1メートル/ 5分毎分の速度で速度を増加させます、運動時間の90分と距離を実行しているの1070メートルの合計。 </li><li>低強度範囲（1.2ヘルツ）で電気刺激を設定し、繰り返し足の衝撃を回避するために実行するためにマウスを奨励します。 </li><li>組織収集のために、運動直後頸椎脱臼が続くイソフルラン吸入によってマウスを安楽死させます。他の承認された安楽死の方法はまた、二酸化炭素または他の麻酔薬のIP注射として使用することができます。オートファジーのレベルは、安楽死の方法によって影響されていないようです。 </li></ol></li><li> 自発運動-車輪のセットアップを実行します <ol><li>シングル収容されたマウスでケージの中にマウスランニングホイール（11.4センチメートル直径）を配置します。 </li><li>自転車の走行距離計を使用して、実行中の容量を確認してください。（π* 11.4）358で[ホイールの全回転当たりの距離（mm）]ホイールパラメータを設定します。 24時間後の走行距離を測定します。 </li><li>マウスは、走行輪と2週間自主的に実行してみましょう。組織収集のために、実行している期間の後、午前中にマウスを生け贄に捧げます。 </li></ol></li></ol> 3.オートファジーフラックスの評価<ol><li>安静時や運動条件下でのオートファジーフラックスを測定するために、3日間のオートファジー阻害剤クロロキンでマウスを治療し、PBSで処置したマウスと比較します。 <ol><li> PBSにクロロキンを溶解する（5 mg / mlで）、3日間連続して腹腔内に50mg / kg /日の用量でマウスにクロロキンを注入します。マウスを犠牲にし、組織を最後の注射後3時間を収集します。 </li><li>行使されたマウスは、50 mg / kg /日の用量で2日間連続クロロキンでそれらを前処理。三日目に、後クロロキンの同じ濃度でマウスを注入し、90分彼らは別の90分間のトレッドミル上で実行してみましょう。 </li><li>頸椎脱臼が続くイソフルラン吸入によってマウスを、安楽死させます。クロロキンの総インキュベーション時間は、コントロール（安静時）マウス（3時間）と同じになるように、すぐに実行した後の組織を収集します。 注：別の方法として、マウス組織におけるオートファジーフラックスを決定するためにクロロキンの単回注射を使用します。 </li></ol></li></ol> 4.組織の収穫と固定<ol><li> 7.4の最終pHで、PBS中：組織の収穫の前には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、新鮮な4％パラホルムアルデヒド（必要な個人用保護機器PFA、注意を）準備します。 4℃で両方のソリューションを格納します。 </li><li> （GFP-LC3マウス用）4％PFAの20ミリリットル - 15と30ミリリットル注射器を埋めます。 20 Gカテーテル針で注射器を接続します。 </li><li>運動後、頸椎脱臼に続いて、イソフルラン吸入によりマウスを安楽死させます。 </li><li>そのBAに清潔な作業面に動物を置きますCK。カットし、心臓を露出するために、振動板を切断して胸腔を開きます。 </li><li>肺と肝臓が完全に青ざめるまで、血が出て来るように、カテーテルを介して心臓の右心室にゆっくりと15ミリリットル4％PFAの合計を注入するために肝臓に小さな切開を行います。 90ミリリットル/時の一定流量でシリンジポンプを使用して、すぐに運動セッションの後、マウスを灌流。 </li><li>灌流後、針を除去し、関心の組織（ 例えば脳 11と骨格筋）を収集。骨格筋の場合は、外側広筋を解剖。簡単に言えば、筋肉を露出させる12の大腿四頭筋をローカライズし、大腿骨の上部に接続された外部の筋肉である外側広筋を、ばらばらにするために、後方の脚の皮膚を引っ張ります。 </li><li>さらに固定および脱水のために、4℃で24時間、4％PFA中でGFP-LC3マウスの組織を配置し、その後15％に転送4℃でのスクロース-PBSで一晩または組織が安定するまで、その後、一晩4℃で30％のスクロース-PBSまたは長期保存のために。彼らは強い光に敏感であり得るとして、できるだけ多くの暗所でサンプルを保管してください。 </li><li>ウェスタンブロット分析のために液体窒素中で直接、C57BL / 6マウスからの組織を凍結し、-80℃で保管しスナップ。 </li></ol> GFP-LC3涙点の5イメージング解析<ol><li> 組織のプロセス <ol><li>そのような標識された小さなペトリ皿で数分間の「最適切削温度化合物」（10月）などの媒体を埋め込んで組織（以前はPFAで固定し、30％スクロース中に保存されている）を事前扱います。 </li><li>組織をカバーするのに十分な新鮮な10月を含む標識cryomoldに組織を転送します。オリエントcryomold（外側広筋の筋と半脳のための矢状断面のための断面）の底部に向かってセクショニング面。泡の形成を避けます。 </li><li> FRE10月が白くなるまで、ドライアイスで満たされた屋根付きの発泡クーラーで数分間cryomoldを配置することによって、サンプルをEZE。 、標識された箔で個々のサンプルを包むビニール袋にそれらを密封し、-80℃で一晩以上保管してください。 </li><li> 10μmの厚さでサンプルのセクションを切断し、スライド上のセクションをマウントするクライオスタットを使用してください。 -20℃でスライドを保存し、常に可能な限り光から離れてスライドを保ちます。 </li></ol></li><li> スライドの準備 <ol><li>冷凍庫からスライドを外し、室温でそれらを解凍。 DAPIでメディアのマウントの低下と組織切片をカバーしています。上に適切なサイズのカバーガラスを置き、気泡形成を回避します。 </li><li> 、カバーガラスの縁をシールマニキュアは、暗所で室温で乾燥させ、その後、4℃で光を通さない容器にスライドを保存する、またはGFP-LC3の涙点の撮像キャプチャを続行するためにマニキュアを使用してください。 </li></ol></li><li> &lt;GFPの強い&gt;定量 - 蛍光顕微鏡によるLC3の斑点<ol><li>すべてのサンプルについて同じ条件（露出と設定）で画像をキャプチャ、落射蛍光顕微鏡を実行します。 GFPは、525nmでの発光波長を使用します。 DAPIのために、490nmのを使用しています。外側広筋のための60X目的と脳の前頭皮質領域を用いて、サンプルあたり少なくとも10の画像を取得します。 </li><li>実験群のために盲目に統計分析のために各画像中の2500 平方 μmの組織領域にGFP-LC3の斑点の数を定量化します。 &quot;オブジェクト数&quot;の自動測定機能を用いて、各サンプルの10枚の平均値を計算します。外側広筋の筋肉の設定は次のとおりです。しきい値L = 10、H = 200; 2Xはスムーズ。 1Xきれいな、と脳の前頭皮質の設定は、次のとおりです。しきい値L = 11、H = 200; 2Xはスムーズ。 1Xきれい。 </li></ol></li></ol>オートファジーマーカー6.ウェスタンブロット分析<ol><li> &lt;強い&gt;組織プロセス<ol><li>溶解バッファー準備：50 mMトリス - 塩酸; 150mMのNaCl; 1 mMのEDTA; 1％トリトンX-100。プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤（新たに追加されました）。 </li><li> Cストレージ-80℃からC57BL / 6マウスの組織を削除します。次の工程の前にカミソリの刃で小片に筋肉組織をカット。サンプルに冷溶解緩衝液（外側広筋の場合）（ヘミ脳用）800μlあるいは500μl添加します。中程度の速度でホモジナイザーを用いて4℃でサンプルをホモジナイズします。 </li><li>完全に回転させながら4℃で1時間にさらに30分間均質化混合物を溶解します。 </li><li> 、4℃で10分間12,000×gでホモジネートをスピンダウンし、ペレットを廃棄し、新しいチューブに上清を収集します。 </li></ol></li><li> オートファジー分析 <ol><li>製造業者の仕様書に従ってBCAタンパク質アッセイキットを使用して、組織溶解物のタンパク質濃度を決定します。各サンプルを正規化同じ濃度に。 </li><li> 、1比5 95℃でそれを沸騰- 10分、ならびにP62（抗P62抗体としてオートファジーマーカー13、14、上のウェスタンブロット分析を続行：1で2×Laemmliサンプル緩衝液で試料を結合1：500希釈）およびLC3（抗LC3抗体、1：500希釈）。氷の上でより長いインキュベーションは、LC3の複数の劣化バンドを生成することができるように、すぐにサンプル緩衝液を添加した後、サンプルを沸騰させます。 </li><li> ImageJのを使用してデンシトメトリー分析によってP62とLC3のバンドを定量化し、対応するアクチンバンドに値を正規化します。 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

オートファジーは、エネルギーを提供し、細胞質成分または損傷した細胞小器官のリソソーム分解により細胞毒性を減少させる異化プロセスです。オートファジーの研究は細胞の恒常性の調節およびストレス応答のメカニズムを理解することが重要です。新モデルと方法論は、多くの病理学的プロセス16、17にどのように寄与するかを損なわオートファジー研究し、研究分野15で浮上しています。 栄養欠乏（飢餓）および薬理学的誘導は、一般的に、インビトロおよびインビボでオートファジーを誘導するための方法を使用しています。特に、動物モデルのためのこれらの方法は、全体的な結果に影響を与え得る悪影響を示すことができます。それは飢餓の少なくとも48時間を必要とするため、例えば、オートファジーの検出可能なレベルを誘導するために、動物は、エネルギーは、通常の運動活動、のために必要としていない可能性があります多くのその後の行動研究の結果に影響を与えます。まだ薬理学的誘導物質はまた、オートファジー経路に特異性の欠如に副作用をもたらすことができます。主要なオートファジー誘導因子のラパマイシンおよびその誘導体は、mTOR活性を抑制し、長期治療のための実験設計において考慮されるべきである代謝機能不全及び免疫抑制18、19、20を生じさせます。したがって、我々は、動物モデルにおけるオートファジーの活性化のための複数の生理的かつ堅牢な方法に取り組んできました。 最近、我々と他の人が特定した運動効果的な、より速く、より安全なオートファジー誘導因子vivoで 7、8、9インチホイールを実行して、トレッドミルや自発運動による強制運動の両方がオートファジーのAに対する運動の効果を分析するために使用されていますctivation、運動時間と強度21、22の変化と。 5週間-例えば、トレッドミルの時間が実行されている（40メートル/分の最大10メートル/分の速度で開始する）は3月または4に立候補骨格筋21に豊富LC3の脂質化、および長期的な自主的なホイールを誘導しますまた、基底オートファジーを増加させ、骨格筋21,22においてオートファジータンパク質の発現を増強します。 ここでは、説明やマウスを行使するために、2つの方法（トレッドミル、ランニングホイール）を比較し、オートファジー誘導における高効率で短いプロトコルを最適化して提示します。それぞれのアプローチは、長所と短所があります。トレッドミル上の強制運動の90分の単一の試合は、骨格筋と脳にオートファジーを誘導するのに十分です。私たちは、トレッドミル運動7の時間経過を行われ、exerciことを発見しましたここで説明SE条件も他23によって検証されたマウスの骨格筋においてオートファジーの最大レベルを誘導します。これらの条件下では、マウスは、有酸素運動を受けます。以前に報告されたように嫌気条件は筋肉量を増加させるが、必ずしも運動を強化しない高強度の運動の持続時間が短いことにより得られるのに対し、有酸素運動は、長時間のトレッドミル24、25、26上の速度の緩やかな増加に実行することによって誘導されます持久力27、28。さらに、このプロトコルでここに報告走行速度が正に好気性容量29を評価するために間接的な方法により、酸素消費能力と相関します。したがって、トレッドミル上の有酸素運動は、オートファジーを誘導するための迅速かつ効果的な方法です。 しかし、FORCedはマウスにストレスを与える可能性が密閉空間で実行されています。したがって、動物に追加のストレスを与えることを避けるために、私たちの代わりに、実行中のマウスを維持するための方法として、指がnudgesやワイヤータッセル使用ビルトイン電気ショック。トレッドミルと比較して、走行輪の使用は多くの利点を有します。これは、ストレスの少ないあり、研究者の観察時間を必要とせず、オートファジーの活性化の長期的影響を研究するために便利です。しかし、走行輪上の演習では、自発的であり、したがって、異なるマウスまたは異なる日に同じマウスの間の距離と速度を実行しているという点でばらつきが発生します。したがって、個々の変動を最小限にするために（ 例えば 、数週間）長期間車輪にマウスを実行する必要があります。重要なのは、アプローチはまた、マウスが実際に実行されていることを確認するために夜間走行距離計を使用する必要があります。我々は、2週間にわたって、野生型C57BL / 6マウスの平均走行距離を測定し、そしてそれらはapproxi実行することを見出しましたmately 1キロのトレーニング（1日目）の先頭に/夜と8まで実行することができます - それは難しいです、が、全体的に14日目で10キロ/夜は、走行輪は、ほとんどの器官でオートファジーを刺激するための有効な方法でありますトレッドミルを使用する場合と比較して、骨格筋におけるオートファゴソームの蓄積をキャプチャします。その理由は、骨格筋が高いオートファジーフラックスとGFP-LC3の斑点測定によるオートファジーの誘導を検出するために実行した後、即時の組織採取を必要とする高速オートファゴソームの分解速度を、持っていることです。いずれかのプロトコルでは、殺処分後の組織の急速なPFA灌流および固定は、そうでなければ簡単に解剖中に分解されたオートファゴソーム構造を維持する手順の重要なステップです。 このプロトコルは、脳や骨格筋などのマウス組織でオートファジーを刺激するために有酸素運動を使用する方法を示します。これらの方法は、mはオートファジー経路のメカニズムを研究するために使用することができこのようなミトコンドリアのメンテナンス23として組織機能のaintenance、そのようなカンナビノイド9の鎮痛効果を高めるなどの動物疾患モデルの行動や健康の規制上のオートファジー誘導の長期的影響を研究します。どちらのトレッドミルランニングホイール方法は、オートファジーの良好なレベルを誘導します。まだ別の研究目標を達成するための最適なアプローチを選択する場合、その違いを考慮することが重要です。

オートファジーは、飢餓および低酸素1,2のような種々のストレス条件に応答して誘導される進化的に保存された分解経路です。オートファジーの間、オートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞は、不要なまたは損傷した細胞内のコンポーネントを組み込み、劣化3のためのリソソームにそれらを運びます。基底オートファジーは、細胞機能および生物の開発のために不可欠であり、障害のある基底オートファジーは神経変性、腫瘍形成および2型糖尿病4、5、6を含む多くの疾患に関与しています。 最もよく知られている生理的オートファジー誘導因子が飢餓です。しかし、それは、2つの主要な制限を有します。まず、飢餓は、 例えば 、効果的動物でオートファジーを誘導するために、マウスにおける食物制限の48時間を長い期間を要しますほとんどの臓器インチ第二に、飢餓はほとんど脳内で比較的安定した栄養供給に起因する脳のオートファジーを誘導します。実際には、多くの薬物は、血液脳関門を通過できないように、小分子誘導物質によってオートファジーの誘導を検出することも困難です。このように、より良い疾患の病因におけるオートファジーの活性化の機能を分析するために、我々は最近、運動は時間7、8、9の短い期間でオートファジーを誘導するために、より強力な生理的な方法であることを発見しました。飢餓と比較して、オートファジーを効果的に30分ほど速く実行トレッドミルによって誘導されます。このように、運動は健康上の利点を仲介し、疾患の予防にオートファジーのメカニズムを研究するための便利で強力な生理的なアプローチです。 LC3およびP62を含むオートファジー活性の検出のためのいくつかのタンパク質マーカーがあります。 LC3（微小管結合タンパク質1A / 1B-光Cヘイン3）は、オートファジーの誘導時にPE（ホスファチジルエタノールアミン）に結合しているサイトゾルタンパク質（LC3-I型）です。 PE脂質化LC3（LC3-II型）は、オートファゴソーム膜に動員され、GFPで標識したときオートファゴソームを可視化するために使用することができます。顕微鏡下でオートファゴソームの構造を点状にする細胞質ゾルからの転座は、オートファジー誘導の指標です。 P62は、（例えば、ユビキチン化タンパク質など）オートファジー基板のカーゴ受容体であり、同様にオートファゴソームに組み込まれます。タンパク質は、オートファゴソームとともにリソソームで分解されるので、そのレベルは、オートファジーフラックスを測定するために使用することができます。ここでは、強制運動（トレッドミル）と自発運動（車輪を実行している）などの有酸素運動によって誘発される異なるマウス組織でオートファジーを定量化するために、これらのマーカーを使用する方法を示しています。同じ手順は、他の誘導物質を処理した後、オートファジーのインビボ測定に適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Treadmill</td>
			<td style="width:204px;">Columbus Instruments</td>
			<td style="width:195px;">150-RM Exer 3/6</td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mouse running wheel</td>
			<td style="width:204px;">Super Pet</td>
			<td style="width:195px;">100079365</td>
			<td>diameter 11.4 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Odometer</td>
			<td style="width:204px;">Bell</td>
			<td style="width:195px;">DASHBOARD 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:204px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:195px;">KDS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:204px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">Model: inverted microscope ECLIPSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Cryostat</td>
			<td style="width:204px;">Leica</td>
			<td style="width:195px;">CM 1850UV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Homogenizer</td>
			<td style="width:204px;">IKA</td>
			<td style="width:195px;">003737001 / Model: T10 Basic S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Chloroquine</td>
			<td style="width:204px;">CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td>
			<td style="width:195px;">14194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Parafolmaldehye</td>
			<td style="width:204px;">SIGMA-ALDRICH</td>
			<td style="width:195px;">P6148</td>
			<td>Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Mounting media</td>
			<td style="width:204px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:195px;">H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">p62 antibody</td>
			<td style="width:204px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:195px;">610833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">LC3 antibody</td>
			<td style="width:204px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:195px;">NB100-2220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X Laemmli Sample Buffer</td>
			<td style="width:204px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td style="width:195px;">161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ImageJ</td>
			<td style="width:204px;">NIH</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

activating autophagy by aerobic exercise in mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

このプロトコルは、有酸素運動によるマウス組織におけるオートファジーを誘導するために2つの異なる方法を説明します。順化の2日間進めマルチレーントレッドミル上の強制運動の90分の合計。またはシングル収容されたマウスで使用される走行輪に自発運動の2週間。各運動プロトコルでは、我々は、蛍光顕微鏡および様々な臓器におけるウェスタンブロット分析によってオートファジーフラックスを測定することができます。 私たちは運動1によりオートファジーを監視するためのレポーター系としてGFPタグLC3を発現するトランスジェニックマウスラインを使用しました。オートファジー誘導の際に、LC3は、点状の構造でオートファゴソームに細胞質ゾルから移動します。切片化後、GFP-LC3の斑点の形成が、直接蛍光顕微鏡（ 図1A）によって可視化することができます。また、オートファゴソーム構造はまたのためのLC3抗体によって免疫染色することができますイメージング。トレッドミル運動の90分または自主的なランニングの2週間のいずれかが休止状態（ 図1B）と比較すると、骨格筋（外側広筋）と大脳皮質の両方でGFP-LC3の斑点の数を増加させました。前頭皮質領域がオートファジーが明らかにこれまでのいずれかの方法により誘導される脳内の主要な地域となっていることに留意すべきです。運動はまた、ウェスタンブロット分析（ 図1C）によって検出することができる脂質共役体（LC3-II）のサイトゾル型（LC3-I）からLC3の変換を誘導しました。 （LC3-IIおよびGFP-LC3の斑点によって表される）オートファゴソームの運動誘発性増加はむしろ、そのようなバフィロマイシンA1またはクロロキンのようなリソソーム分解の阻害剤の使用によって評価オートファゴソーム分解のブロック、より高められたオートファジーフラックスに起因しています。ここでは、元のようにオートファジー貨物受容体P62の分解を測定しました十分。運動は（トレッドミルの90分）（ 図2）を行使する前にクロロキンを注射して救助された静止状態、より骨格筋にP62の高い劣化を引き起こしました。同様の結果はまた、車輪を実行することにより、自発的な運動で観察されています。このように、トレッドミルや走行車輪によって有酸素運動は、LC3の定常状態レベルおよびP62の分解によって測定し、 生体内でオートファジーを誘導します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig1.jpg" /> 図1.有酸素運動は、マウス組織におけるオートファジーを誘導します。代表的な画像制御条件（休止）の下でGFP-LC3トランスジェニックマウスの骨格筋（外側広筋）と脳（前頭皮質）におけるGFP-LC3の斑点の（A）及び定量化（B）、強制運動の90分後（トレッドミル）または自発運動（車輪）の2週間後。結果sがマウス当たり10枚の平均値±SEMを表します。 N = 5のマウス。以下の発光波長を使用した：GFP - 525 NMと、 DAPI - 490 nmの。 （C）（トレッドミルによる）休養し、行使されたマウスからの骨格筋（外側広筋）におけるLC3のウエスタンブロット検出。定量データは、アクチン（左）とLC3-I（右）へのLC3-IIの比に正規化LC3-IIのレベルを表します。 N = 3のマウス。統計値は、対照試料にそれぞれの値を比較しています。結果は平均値±s *、P &lt;0.05を意味表します。 **、P &lt;0.01。 ***、P &lt;0.001、t検定。スケールバー、25μmで。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55099/55099fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig2.jpg" /> 図2.運動がマウス骨格筋におけるオートファジーフラックスを増加させます。 （A）ウエスタンブロット休息とリソソーム阻害剤のクロロキンの存在下または非存在下でマウスを行使から外側広筋におけるP62の検出。対応するアクチンバンドに正規化P62の（B）（左）定量分析。 （右）P62束はクロロキン処理したP62とは、PBSで処理したP62の正規化された濃度測定値を減算することによって決定されます。結果は、平均±SEM、N = 3マウスを意味する表現します。 *、P &lt;0.05、t検定。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55099/55099fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

オートファジーの活性化は、多くの疾患の予防に有益です。 生体内でオートファジーを誘導する生理的なアプローチの一つは、物理的な運動です。ここでは、有酸素運動によってオートファジーを活性化し、マウスにおけるオートファジーのレベルを測定する方法を示しています。

マウスで有酸素運動によってオートファジーのアクティブ化

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

activating-autophagy-by-aerobic-exercise-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K ビュー.  Northwestern University. オートファジーの活性化は、多くの疾患の予防に有益です。 生体内でオートファジーを誘導する生理的なアプローチの一つは、物理的な運動です。ここでは、有酸素運動によってオートファジーを活性化し、マウスにおけるオートファジーのレベルを測定する方法を示しています。 

ビデオ: Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

好気性菌による制御植物組織の分解のための寒天ブロックの小宇宙

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

生物学

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

運動時のエネルギーシステムの貢献を決定する

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

マウスにおける流体力学的遺伝子送達によるタンパク質の一過性発現

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

オートファジーの解析で<em&gt;ペニシリウム·クリソゲヌム</em&gt;蛍光顕微鏡と組み合わせて飢餓パッドを使用した

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. The majority of cellular activities require physical interactions between proteins. To analyze and map these interactions, various experimental techniques as well as bioinformatics tools were developed. Autophagy is a cellular recycling mechanism that allows the cells to cope with different stressors, including nutrient deprivation, chemicals, and hypoxia. In order to better understand autophagy-related signaling events and to discover novel factors that regulate protein complexes in autophagy, we performed protein-protein interaction screens. Validation of these screening results requires the use of immunofluorescence and immunoprecipitation techniques. In this system, specific autophagy-related protein-protein interactions that we discovered were tested in Neuro2A (N2A) and HEK293T cell lines. Details of the technical procedures used are explained in this visualized experiment paper.

Presented here are two antibody-based protein-protein interaction research techniques: immunofluorescence and immunoprecipitation. These techniques are suitable for studying physical interactions between proteins for the discovery of novel components of cellular signaling pathways and for understanding protein dynamics.

オートファジー研究でタンパク質間相互作用の研究

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a simple protocol to monitor this process is described. Moreover, typical results and experimental validation of the method under autophagy-inducing conditions in various types of cultured mammalian cells are provided. During bulk autophagy, autophagosomes sequester cytosol, and thereby also soluble cytosolic proteins, alongside other autophagic cargo. LDH is a stable and highly abundant, soluble cytosolic enzyme that is non-selectively sequestered into autophagosomes. The amount of LDH sequestration therefore reflects the amount of bulk autophagic sequestration. To efficiently and accurately determine LDH sequestration in cells, we employ an electrodisruption-based fractionation protocol that effectively separates sedimentable from cytosolic LDH, followed by measurement of enzymatic activity in sedimentable fractions versus whole-cell samples. Autophagic sequestration is determined by subtracting the proportion of sedimentable LDH in untreated cells from that in treated cells. The advantage of the LDH sequestration assay is that it gives a quantitative measure of the autophagic sequestration of endogenous cargo, as opposed to other methods that either involve ectopic expression of sequestration probes or semi-quantitative protease protection analyses of autophagy markers or receptors.

Here a simple and well-validated protocol for measuring bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells is described. The method is based on quantifying the proportion of lactate dehydrogenase (LDH) in sedimentable cell fractions compared to total cellular LDH levels.

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional microscopy to surface nephron features, and 2-photon studies are limited in that interventions can only be assessed at the organ, rather than the nephron level. In particular, micropuncture studies of the glomeruli of mice have been challenged by the paucity of surface glomeruli in mice. To address this limitation in order to pursue studies of aspirate from Bowman&#39;s space in mouse physiologic models, we developed 2-photon glomerular micropuncture. We present a novel surgical preparation that allows lateral access to the kidney while preserving the required vertical imaging column for 2-photon microscopy. Administration of high molecular weight fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran is used to render the renal vasculature and therefore glomeruli visible for 2-photon imaging. A quantum dot-coated pipette is then introduced under stereotactic guidance to a glomerulus selected from the several to many which may be visualized within the imaging window. In this protocol, we provide details of the preparation, materials, and methods necessary to carry out the procedure. This technique facilitates previously-impossible physiologic study of the kidney, including recovery of filtrate from Bowman&#39;s space and all segments of the nephron within the imaging depth limit, about 100 &#181;m below the renal capsule. Pressure, charge and flow may all be measured using the introduced pipette. Here, we provide representative data from liquid chromatography/mass spectrometry performed on aspirate from Bowman&#39;s space. We expect this technique to have wide applicability in renal physiologic investigation.

We present use of 2-photon microscopy to place a micropipette within Bowman&#39;s urinary space in mice, combining 2 foundational techniques of renal physiology. Use of 2-photon microscopy overcomes critical limitations of conventional microscopy for micropuncture renal physiology studies.

2 光子顕微鏡による促進マウス Bowman 腔のそれによって

Renal micropuncture and renal 2-photon imaging are seminal techniques in renal physiology. However, micropuncture is limited by dependence on conventional ...