Questo lavoro è stato supportato in parte dalla concessione R01DK100237 R.A.W e il National Science Foundation Graduate ricerca Fellowship No. DGE-1313583 di Raffaele Ringraziamo anche il College di Scienze Undergraduate Research Fellowship programma estivo per supporto per M.U. Vorremmo ringraziare il centro per la ricerca di Zebrafish presso l'Università di Notre Dame per la loro cura dedicato del nostro zebrafish. Vorremmo anche ringraziare il dipartimento di scienze biologiche, come pure i membri del nostro laboratorio per tutte le loro supporto e informazioni preziose.

Il seguente protocollo utilizza zebrafish adulti tenuto e curato dal centro per la ricerca di Zebrafish presso l'Università di Notre Dame. Tutti i metodi per l'utilizzo di embrioni e zebrafish adulti sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale.
1. embrione fissazione
<ol><li>Raccogliere gli embrioni di zebrafish utilizzando metodi precedentemente descritti39,40. Alle 24 hpf, aggiungere 500 µ l di soluzione di miscela di proteasi aspecifiche (50 mg/mL) per l'E3 in un embrione piatto Incubare a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Una volta che gli embrioni iniziano a scoppiare di chorion, rimuovere tutto il liquido dal piatto dell'embrione.</li>
	<li>Lavare gli embrioni 2 - 3 volte con E3 fresco aggiungendo circa 20 mL di E3, agitando delicatamente la E3 nel piatto, e quindi decantare il liquido in un recipiente di scarico liquido.</li>
	<li>Per eutanasia gli embrioni prima del fissaggio, aggiungere 2 mL di tricaina 0,2% per l'E3.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in un flaconcino di vetro da 5 mL utilizzando una pipetta Pasteur di plastica. Rimuovere la maggior parte della soluzione tricaina/E3 con la pipetta dopo gli embrioni hanno depositato sul fondo del flaconcino.</li>
	<li>Difficoltà 24 embrioni hpf con 5 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) per 2-4 h a RT, senza agitazione. Attenzione: PFA è tossico e soluzioni PFA dovranno essere gestiti sotto una cappa chimica, mentre il ricercatore indossa un camice da laboratorio, guanti e occhiali di protezione. Preparazione del fissativo PFA dalla polvere granulata di PFA dovrebbe essere effettuato con cura eccezionale, come il granulato PFA tende a disperdere attraverso carica statica. Nota: Gli embrioni possono risolvere in 4% PFA durante la notte a 4 ° C. Preparare 4% PFA riscaldando 1x tamponato fosfato salino (PBS) ad ebollizione rimestando continuamente la soluzione per sciogliere completamente il granulato PFA. Una volta che la soluzione è raffreddata giù per RT, il 4% PFA è filtro sterilizzato facendolo passare attraverso un sistema monouso di 0,45 µm per filtrazione sotto vuoto, quindi e aliquotati in porzioni di 15 mL o 50 mL per la conservazione a-20 ° C.</li>
	<li>Rimuovere il 4% PFA e gli embrioni di lavare due volte con 1 tampone fosfato X salino con 0.1% Tween-20 (PBST) a RT. lavare gli embrioni una volta con 5 mL di metanolo al 100% (MeOH) a RT. aggiungere 5 mL di fresco 100% MeOH agli embrioni e incubare a-20 ° C per almeno 20 min. Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati in 100% MeOH a-20 ° C fino al momento per la preparazione di embrione.</li>
</ol>2. ibridazione e preparazione embrione
<ol><li>Reidratare gli embrioni con il lavaggio una volta in 5 mL di 50% MeOH in 1 x PBST per 5 min a RT. continua reidratazione lavando gli embrioni in 5 mL di 30% MeOH in 1 x PBST per 5 min a RT. lavare gli embrioni in 5 mL di 1 x PBST due volte per 5 minuti ciascuno, a RT.</li>
	<li>Permeabilize gli embrioni di incubarle in 5 mL di una soluzione di 1:1,000 proteinasi K (pK) (10 mg/mL) in 1 x PBST per 2 minuti a TA. Nota: Più vecchi embrioni possono essere incubati più di 2 min con la concentrazione di pK indicata sopra, tuttavia meno di 2 minuti di tempo di una concentrazione di 5 mg/mL e l'incubazione è suggerito per gli embrioni più giovani di 24 hpf.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di pK e lavare immediatamente in 5 mL di 1x PBST due volte a RT. Difficoltà gli embrioni in 5 mL di 4% PFA a temperatura ambiente per almeno 20 min. Nota: Gli embrioni possono risolvere in 4% PFA durante la notte a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere PFA e lavare due volte in 5 mL di 1 x PBST a TA.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni in 5 mL di 1 x PBST nelle provette microcentrifuga fondo piatto posizionato verticalmente in un rack microcentrifuga a RT per facilitare le interazioni tra ciascun embrione e la soluzione di ibridazione successive.</li>
	<li>Lavare gli embrioni due volte in 1,5 mL di soluzione di ibridazione (IBRID +) a RT. aggiungere 1,5 mL di fresco Hyb + e incubare gli embrioni a 70 ° C in un forno di ibridazione per 4-6 h.</li>
	<li>Sostituire i 1,5 mL di ibrid + con un volume di soluzione della sonda (10 µ l RNA sonda/500 µ l Hyb +) sufficiente a coprire completamente gli embrioni. Nota: Sintetizzare antisenso sonda RNA usando precedentemente descritto metodi39.</li>
	<li>Ibridare la sonda pernottamento in forno a 70 ° C l'ibridazione con il montante di tubi singoli posizionati nel rack microcentrifuga, senza agitazione.</li>
</ol>3. caldo lavaggi e blocco
Nota: Lavaggi caldi vengono eseguite mettendo la soluzione appropriata sugli embrioni e incubando poi in forno a 70 ° C. ibridazione Per mantenere le soluzioni di lavaggio a 70 ° C, mettere le provette da 50 mL di ciascuna soluzione in forno ibridazione quando la sonda / IBRID + miscela viene aggiunto.
<ol><li>Rimuovere la sonda. Lavare gli embrioni due volte a 70 ° C in 1,5 mL di 50% formammide/2 x tampone salino-sodio citrato (SSC) per 20-30 minuti ciascuno. Nota: La sonda può essere memorizzata nella Hyb + a-20 ° C e ri-utilizzata in un secondo momento.</li>
	<li>Lavare gli embrioni una volta a 70 ° C in 1,5 mL di 2 x SSC per 15 min. lavare gli embrioni due volte a 70 ° C in 1,5 mL di 0,2 X SSC per 20-30 minuti ciascuno. Sostituisci 0.2 x SSC con 1,5 mL di reagente bloccante e incubare per una notte a 4 ° C. Nota: È possibile incubare reagente bloccante a RT per 4 h invece di pernottamento.</li>
</ol>4. anticorpo incubazione e acido maleico Buffer lavaggi
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Sostituire il Reagente Bloccante con 0,2 mL di anti-DIG-POD nel Reagente Bloccante con un rapporto di 1:1,000 e incubare per 3 h in lamina o un'altra luce di blocco coperchio a TA. Nota: In alternativa, l'anticorpo può incubare overnight a 4 ° C.</li>
	<li>Dopo 3 h, lavare gli embrioni in 1,5 mL di tampone acido maleico 2 - 4 volte per 10-15 minuti ciascuno, a RT. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C in 1,5 mL di tampone fresco acido maleico. Nota: Non è necessario Incubare per una notte nel buffer di acido maleico, ma facendo così diminuisce la sonda sfondo.</li>
</ol>5. sonda di rilevamento e rimozione di perossidasi
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Tampone acido maleico di rimuovere e sostituire con 1,5 mL di PBS 1X. Lavare gli embrioni due volte in 1,5 mL di PBS 1X per 5 min a RT. Incubare embrioni in 0,2 mL di Cy3 fluorescente macchiatura soluzione per 60 minuti a TA. Nota: Il tempo di incubazione può variare per diverse sonde.</li>
	<li>Lavare gli embrioni una volta con 1,5 mL della seguente percentuale MeOH in 1X PBS per 10 min a RT: 30% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH e 100% MeOH.</li>
	<li>Incubare gli embrioni con 1,5 mL di 1% H2O2 in MeOH per 30 min a RT. Wash gli embrioni una volta con 1,5 mL di MeOH seguenti soluzioni in 1X PBS per 10 min a RT: 75% MeOH, 50% MeOH e 30% MeOH. Lavare gli embrioni due volte per 5 minuti ciascuno a RT in 1,5 mL di PBS 1X. Nota: Gli embrioni possono essere memorizzati in PBS durante la notte a 4° C.</li>
</ol>6. immunofluorescenza
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Lavare gli embrioni in 1,5 mL di ddH2O per 5 min a RT. Wash gli embrioni in 1,5 mL di acetone pre-refrigerati (conservato a-20 ° C) per 7 min a RT. lavare gli embrioni una volta in 1,5 mL di ddH2O per 5 min a RT. Wash gli embrioni una volta in 1.5 mL di 1 x PBST con 1% DMSO (PBDT) per 5 minuti a TA.</li>
	<li>Incubare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT + 10% siero bovino fetale (FBS) su un agitatore meccanico a temperatura ambiente per 2 h.</li>
	<li>Rimuovere PBDT + FBS e sostituirli con 1,5 mL di anticorpi primari, anti-acetilato tubulina (prodotto da mouse) e anti-γ-tubulina (prodotto da coniglio), diluito insieme a 1: 400 in PBDT + 1% FBS. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C. Nota: Tempi di incubazione possono variare a seconda l'anticorpo primario. Test di diversi intervalli di tempo potrebbe essere necessario ottimizzare l'etichettatura.</li>
</ol>7. secondaria dell'anticorpo
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Per rimuovere l'eccesso anticorpo non legato da embrioni, lavare in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl per 1 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Lavare gli embrioni 5 volte in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS + 0,1 M NaCl per 30 minuti ciascuno, su un rocker RT. lavare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT + 1% FBS per 30 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Incubare gli embrioni durante la notte a 4 ° C a 200 µ l di anticorpi secondari, Alexa 488 capra anti-topo IgG e Alexa 647 capra anti-coniglio IgG, diluito insieme a PBDT a 1: 500.</li>
</ol>8. DAPI macchiatura
Nota: Conservare gli embrioni protetti dalla luce ambientale.
<ol><li>Lavare gli embrioni rapidamente a RT in 1,5 mL di PBDT due volte. Sostituire PBDT con 1,5 mL di DAPI, diluito 1:15000 in 1 X PBST e incubare per 15 min a RT su un agitatore meccanico.</li>
	<li>Lavare gli embrioni in 1,5 mL di PDBT + 1% FBS + 0,1 M NaCl tre volte a RT per 15-20 minuti ciascuno. Conservare gli embrioni in 1,5 mL di PBDT a 4 ° C fino al momento di montare e immagine.</li>
</ol>9. montaggio e Imaging per Zebrafish Pronephros
<ol><li>Embrione laici laterale su vetrino in un piccolo volume, circa 10 µ l, di PBDT.</li>
	<li>Spremere l'embrione dietro gli occhi con una coppia di una pinzetta per rimuovere la testina e alcuni della palla tuorlo.</li>
	<li>Utilizzare una pinzetta per raschiare delicatamente la palla di tuorlo rimanente dal corpo dell'embrione. Rimuovere il tuorlo dissociata e liquido supplementare dal vetrino con un tessuto sottile.</li>
	<li>Aggiungere una goccia di montaggio supporto alla coda rimanente dell'embrione e posizionare in modo che la coda è disposto lateralmente. Porre un coprivetrino in cima alla coda per appiattire il campione, quindi inserire in una casella di scivolo coperto.</li>
	<li>Ciglia di rene a 60 ingrandimenti su un microscopio confocale utilizzando i seguenti canali di immagine: DAPI in blu (set presso 408,0 laser nm), FITC in verde (set presso 488.0 laser nm), Cy3 tingere-contrassegnati in rosso (set alle 561.0 laser nm) e Alexa 680 in bianco (set a 637.0 laser nm).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Goldsmith, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization.">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11, (2011).</li><li>Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tbx2a/b+transcription+factors+direct+pronephros+segmentation+and+corpuscle+of+Stannius+formation+in+zebrafish.">The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish.</a> Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).</li><li>Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cilia+in+zebrafish.">Imaging cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).</li><li>Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+apoptosis+in+zebrafish+embryos+by+whole-mount+immunofluorescence+to+detect+activated+caspase+3.">Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3.</a> J Vis Exp. (82), e51060 (2013).</li><li>Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+using+chromogenic+substrates+in+zebrafish.">Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish.</a> Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).</li><li>Julich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beamter/deltaC+and+the+role+of+Notch+ligands+in+the+zebrafish+somite+segmentation,+hindbrain+neurogenesis+and+hypochord+differentiation.">beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation.</a> Dev Biol. 286, 391-404 (2005).</li><li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos.">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, (2014).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+Mount+Preparation+for+Observation+and+Analysis+of+Zebrafish+Embryo+Specimens+Stained+by+Whole+Mount+In+situ+Hybridization.">Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization.</a> J Vis Exp. (89), e51604 (2014).</li><li>Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Manual+Small+Molecule+Screen+Approaching+High-throughput+Using+Zebrafish+Embryos.">A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. (93), e52063 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo descritto sopra è ottimizzato per l'etichettatura MCCs in pronephros con odf3b trascrizioni e α-tubulina in embrioni di zebrafish 24 hpf. Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di utilizzare embrioni appena fissi e preparati. Gli embrioni che sono stati corretti e immagazzinati in MeOH o IBRID + a-20 ° C per più di una settimana possono essere utilizzati, ma la probabilità di sfondo indesiderati macchiatura aumenta con il tempo che gli embrioni sono conservati in deposito.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi di questa tecnica sono necessarie per adattare questo metodo per altre suite di particolari marcatori, ad es. altri riboprobes antisenso e altri anticorpi. Molti metodi per regolare i parametri delle fasi del processo intero supporto ibridazione in situ sono stati documentati in precedenza dal nostro gruppo ed altri31,34,36,38, 39. Allo stesso modo, ogni anticorpo proteina richiederà alcuni risoluzione dei problemi in termini di tempi di trattamento, e approssimative gamme di diluizioni e tempi di incubazione per ogni anticorpo primario migliori sono stimate dalla valutazione di risultati documentati28, 35. per gli embrioni di età inferiore ai 24 hpf, pK trattamento dovrebbe essere inferiore a 2 min, dove oltre 24 anni di embrioni hpf devono essere trattati con pK per più di 2 min. Inoltre, gli embrioni oltre 24 hpf dovrebbe essere sbiancato di pigmento prima del trattamento di pK.
Dopo colorazione con la soluzione colorante fluorescente, è fondamentale per rimuovere qualsiasi restante macchia, anticorpo e perossidasi eseguendo la serie di lavaggi di metanolo e perossido di idrogeno. I lavaggi di PBS immediatamente successivi sono vitali per rimuovere il metanolo in eccesso da embrioni. Importante, prima di procedere con gli anticorpi se, abbiamo trovato che l'acetone e risciacqui con acqua deionizzata rendono gli embrioni meno tendono ad aderire l'un l'altro e/o le provette da centrifuga. Nella nostra esperienza, gli anticorpi per specifici fattori di trascrizione e di altri geni, anche se potrebbero funzionare in modo efficiente macchie occidentali, non funzionano bene per se in zebrafish. Tuttavia, proteine altamente conservate e abbondanti, come α-tubulina e β-catenina, funzionano bene in zebrafish per se16,37.
Con il pesce, è possibile visualizzare trascrizioni del RNA dei geni che non hanno ancora gli anticorpi specifici in zebrafish. Combinando il pesce con se, come dimostrato dal presente protocollo, co-localizzazione di trascritti di RNA e proteine può essere visto in vivo (Figura 2). La natura flessibile del protocollo consente la rapida risoluzione dei problemi per la visualizzazione dei vari trascritti di RNA e proteine in numerosi tessuti e intervalli di tempo. Quando combinato con i tratti già rispettati di embrioni di zebrafish, questo protocollo di pesce + se fornisce un altro strumento per esplorare l'espressione di geni e proteine importanti per via dello sviluppo.

Nel corso degli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un organismo il primo modello per studiare biologia inerente allo sviluppo. Gli embrioni si sviluppano di fuori della madre e sono otticamente trasparenti. Inoltre, la formazione di organi vitali come l'occhio, il rene e il proencefalo si verifica rapidamente, con strutture formate da solo 24 h post fertilizzazione (hpf). D'importanza, il genoma di zebrafish è altamente conservato con mammiferi1,2,3. Inoltre, zebrafish e organi mammiferi hanno simili anatomia e fisiologia. Il rene embrionale di zebrafish, o pronephros, dimostra il valore del sistema modello per l'esame di funzione del gene durante primi nefrogenesi e determinazione di destino delle popolazioni di cellule epiteliali conservata del nefrone vertebrati4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. allo stesso modo, l'embrione di zebrafish è diventato sempre più importante nell'esaminare l'ontogenesi di MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Come suggerisce il loro nome, MCCs sono cellule epiteliali, caratterizzate da un fascio di ciglia mobili situato sulla superficie apicale17. In zebrafish, MCCs funzionare in flusso di fluido e sono disperse in un "sale e pepe" come la moda in tutta la metà di ogni nefrone dei pronephros da 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. anche se essi sono stati notati solo in una manciata di rene umano malattia casi18,19,20,21, MCCs sono prevalenti in altri tessuti di mammiferi come il cervello e trachea22,23,24, che pone una serie di sfide per il disegno sperimentale. Elegante in vari modelli vertebrati compreso zebrafish hanno dimostrato una via conservata del destino MCC, con la tacca via di segnalazione come inibitore di MCC sviluppo12,17,25 ,26,27. Di conseguenza, i pronephros zebrafish fornisce un modello facilmente accessibile per studiare i meccanismi genetici di MCC sviluppo in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Trasparenza e facile manipolazione genetica degli embrioni di zebrafish hanno dimostrato di essere tratti inestimabile quando si studia le vie genetiche e molecolari che regolano il destino delle cellule, la crescita dei tessuti e lo sviluppo del primo embrione1,2 ,3. Come tali, tecniche tradizionali per visualizzare trascrizioni del gene e della proteina, quali ibridazione in situ e intero monte se, sono stati applicati a e ottimizzato per il Danio rerio16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando i più diffusi protocolli per pesce e se, è possibile aggiungere etichette e analizzare MCCs in vivo16,28,37,38.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>non-specific protease mixture solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001, pronase from Streptomyces griseus</td>
			<td>Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td>To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embryo dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>225012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable plastic Pasteur pippettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA) solution</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>19210</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20&#176;C. Do not refreeze once thawed for use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB11072</td>
			<td>Dilute in distilled water to make a 1X stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 stock</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02038</td>
			<td>Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>0.1% Tween-20 in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol (MeOH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34860-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td>Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flat bottom microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-300; 87003-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00600</td>
			<td>store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization solution (HYB+)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 &#956;g/&#956;L heparin; store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-247-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB13156</td>
			<td>dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking reagent solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11096176001</td>
			<td>dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>maleic acid buffer solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375 and S7653</td>
			<td>150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11207739910</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 fluorescent staining solution</td>
			<td>PerkinElmer, Inc.</td>
			<td>NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system</td>
			<td>store at 4&#176;C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-500mL</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>molecular grade distilled water (ddH2O)</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25-055-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00636-01000</td>
			<td>store an aliquot at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435-01000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10438-034</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6793</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#947;-tubulin anitbody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5192</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>odf3b cDNA clone MGC:63985</td>
			<td>OpenBiosystems</td>
			<td>IMAGE:6792478</td>
			<td>store bacterial glycerol stock at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCL</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915-05000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21245</td>
			<td>store at 4&#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11029</td>
			<td>store at 4&#176;C; protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td>aliquot and store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass coverslip</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>12-540A</td>
			<td>18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-1050</td>
			<td>Dumont Tweezers Pattern #55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mounting media</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>18606, Aqua-Poly/Mount</td>
			<td>store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope and associated software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rocker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1660710EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing multiciliated cells in the zebrafish through a combined protocol of whole mount fluorescent in situ hybridization and immunofluorescence

Negli ultimi anni, l'embrione di zebrafish è emerso come un modello popolare per studiare biologia inerente allo sviluppo a causa di caratteristiche quali la ex utero lo sviluppo dell'embrione e trasparenza ottica. In particolare, l'embrione di zebrafish è diventato un organismo importante per studiare l'organogenesi renale vertebrati, nonché lo sviluppo delle cellule multiciliated (MCC). Per visualizzare MCCs nel rene embrionale zebrafish, abbiamo sviluppato un protocollo combinato di ibridazione del intero-supporto fluorescente in situ (FISH) e montare tutto immunofluorescenza (IF) che permette l'imaging ad alta risoluzione. Questo manoscritto descrive la nostra tecnica per la co-localizzazione di trascritti di RNA e proteine come strumento per comprendere meglio la regolamentazione dei programmi di sviluppo attraverso l'espressione di vari fattori di lignaggio.

Embrioni di zebrafish di selvaggio-tipo sono stati fissati alle 24 hpf e immediatamente preparato come descritto sopra. Figura 1 illustra un flusso di lavoro sperimentale, insieme ad alcune fasi illustrate. Il flusso di lavoro descritto nei passaggi 1-8 comprende i processi di approvvigionamento campione, fissazione e la manipolazione del tessuto fisso per etichettare le trascrizioni endogene con riboprobes antisenso seguita dall'immunofluorescenza per etichetta proteina di interesse. Passaggio 9 del flusso di lavoro si riferisce specificatamente progettati per ottimizzare la visualizzazione del tronco embrionali zebrafish tecniche di imaging ed il montaggio. Nei disegni che accompagnano il passaggio 9, illustriamo il metodo di manipolazione per il posizionamento del tessuto su un vetrino. In questo passaggio, la palla di testa e tuorlo di embrione vengono rimossi, lasciando la coda per essere posizionato lateralmente tra una lastra di vetro e il vetrino coprioggetti. Rimozione della sfera di tuorlo e la testa è suggerito per la migliore immagine della popolazione residente MCC in pronephros, come la palla di tuorlo reagisce in auto e ostacola il processo di montaggio.
Immagini rappresentative ottenute utilizzando un microscopio confocale sono fornite in Figura 2, che mostra l'embrione stesso di selvaggio-tipo a 60x e uno zoom digitale allo stesso ingrandimento. I pannelli superiori forniscono immagini di ogni singolo canale, mentre i due pannelli di fondo sono la sovrapposizione composita di questi dati di imaging. La scatola bianca (nell'immagine colonna sinistra) delinea l'area che è al centro dello zoom digitale (l'immagine della colonna di destra). Evidenziata nel riquadro finale dello zoom digitale, i nuclei sono stati etichettati in DAPI e MCCs sono stati rilevati basato su un ribosonde antisenso progettato per riconoscere odf3b, dove gli anticorpi a γ-tubulina denotano i corpi basali e α-tubulina denota le ciglia. Nello zoom digitale della sovrapposizione composito, il cerchio con tratteggio giallo indica il perimetro di un MCC, che è stato identificato dovuto il possesso di odf3b trascrizioni, più corpi basali e ciglia. La cella adiacente mono-ciliated, etichettata con un cerchio giallo punteggiato, è stata identificata basata sul fenotipo di possedere un singolo corpo basale e un singolo Cilio.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figura 1: schema di diagramma di flusso sperimentale. Questo diagramma di flusso Mostra un flusso di lavoro sperimentale, corredato da illustrazioni di fasi critiche in cui il fiocco di neve indica freddo incubazione, le tre linee curve rappresentano il calore e l'orologio rappresenta tempi lunghi di incubazione. Il flusso di lavoro possa essere eseguito in un minimo di 6 giorni (Vedi il numero del giorno nell'angolo superiore destro di ogni fase del processo), tuttavia alcuni passaggi possono essere eseguiti su più lunghi periodi di tempo, come indicato nel protocollo. Una rappresentazione dettagliata del processo di montaggio è tirata fuori, dimostrando la coda finale dell'embrione montato tra il vetrino e il vetrino coprioggetti. Una casella tratteggiata nera delinea l'area che è imaged 60 ingrandimenti. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figura 2: rappresentante risultati per la visualizzazione di MCCs dei pronephros zebrafish. Proiezioni di massima dell'immagine di un embrione di zebrafish di selvaggio-tipo hpf 24 a 60 X ingrandimento, come pure uno zoom digitale sul confocale a 60 ingrandimenti dell'embrione stesso. Le caselle bianche indicano l'area incentrata su per lo zoom. Le macchie individuali di DAPI (nuclei), odf3b (MCCs), γ-tubulina (corpi basali) e α-tubulina (ciglia) sono etichettate e quindi fuse insieme nei pannelli di fondo due. Lo zoom digitale, forniamo approssimazioni delle posizioni delle cellule come segue: un MCC è delineato dal cerchio con tratteggio giallo, e il cerchio giallo punteggiato delinea una cella mono-ciliati. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence at JoVE.c

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

visualizing-multiciliated-cells-zebrafish-through-combined-protocol

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

8.1K Views.  University of Notre Dame. Sviluppo di ciglia è vitale per l'organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.

Video: Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

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Biologia dello sviluppo

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

Multi-bersaglio Cromogenico Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione per il confronto Gene domini di espressione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an integral part of the male reproductive tract, is responsible for sperm storage, maturation, and transport. The adult epididymis is a highly coiled tube that develops from a simple and straight embryonic precursor known as Wolffian duct (WD). Proper coiling of the epididymis is essential for male fertility, as sperm in the testis are unable to fertilize an oocyte. However, the mechanism responsible for epididymal development and coiling remains unclear, partially due to the lack of whole organ culture and imaging methods. In this study, we describe an in vitro culture system and whole mount immunofluorescence protocol to better visualize the process of WD coiling and development, which may also be applied to study other tubular organs.

We present a method for isolation and culture of the mouse Wolffian duct (WD). We also demonstrate a detailed procedure for whole mount immunostaining of cultured/freshly isolated WDs with fluorescently tagged antibodies. Together, these techniques enable the study of WD development, coiling, and differentiation.

Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Analisi quantitativa intero-monta immunofluorescenza delle popolazioni di cellule progenitrici cardiache in embrioni di topo

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...