Il lavoro su saggi patogeno respiratorio qui descritti è stato sostenuto da fondi per lo sviluppo interno Cornell Animal Health Centro Diagnostico. Sviluppo della scala nanometrica flusso di lavoro PCR e sistemi di garanzia di qualità è stato parzialmente finanziato (FOA PA-13-244) e svolto in collaborazione con Veterinary Laboratory Investigation la Food and Drug Administration e Response Network (FDA Vet-LIRN) sotto Grant No 1U18FD005144- 01. I costi di pubblicazione sono stati sponsorizzati da VWR e Quanta Biosciences. Ringraziamo Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Wang Weihua, e Katrina Walker per la loro assistenza con la scrittura e la revisione del protocollo. Ringraziamo Mike Carroll per filmare le interviste agli autori. Abbiamo finalmente Ringraziamo l&#39;editor e tre revisori anonimi per i loro utili commenti.

<ol>
	<li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).</li><li>Bustin, S. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform.">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).</li><li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform.">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li><li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+screening+for+blood-borne+viral,+bacterial,+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform.">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li><li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+(H1N1)+pandemic+influenza+virus.">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li><li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR.">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li><li>Dreier, J., St&#246;rmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays.">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li><li>Pusterla, N., Hussey, G. 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Marcia Slater e Elen Ortenberg sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific Inc. che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Questa procedura è stata utilizzata per il test di routine di patogeni respiratori nel nostro laboratorio nel corso di sei mesi (2-3 volte a settimana). Abbiamo anche avuto successo usando la stessa procedura per enterica profiling patogeno in campioni fecali e batteri isolati su un piatto personalizzato separatamente. Una volta che le piastre vengono prodotte, personale esperto in grado di completare i passaggi 2-7 entro una giornata lavorativa standard. Le fasi più critiche sono la corretta tenuta della piastra preamplificatore, il trasferimento dei campioni preamplificati fra piastre (che deve essere fatto rapidamente per evitare l&#39;evaporazione), ed il rivestimento finale della piastra di amplificazione. L&#39;uso del foglio di macro come guida per l&#39;analisi risultato (controllo curve per campioni e controlli) era anche critica in quanto riduce notevolmente la quantità di tempo e lavoro di ufficio necessario per questo processo. Il foglio di calcolo macro fornito è un esempio; avrebbe bisogno di essere modificato o ricreato per piatti con diverse configurazioni. Questo può essere facilmente performed da qualcuno con conoscenze di base foglio di calcolo. A causa della piccola quantità di campione caricato sulla piastra di amplificazione (33 nl), è necessario pre-amplificazione. Nella ottimizzazione di questo protocollo (non mostrato), abbiamo confrontato una serie di parametri di preamplificazione compreso il master mix, aggiunta di primer casuali, il numero di cicli, tempo di ricottura, e diluizione prima dell&#39;amplificazione. Ogni bersaglio aveva le sue condizioni ottimali, e quelli qui descritti rappresentano quelli che ha dato il limite migliore della complessiva rilevazione per il nostro pannello. Questo pannello copre un&#39;ampia gamma di obiettivi patogeni e tipi di campione che si incontrano nei test diagnostico veterinario di routine, ma le modifiche alle procedure di preamplificazione può essere necessaria per diversi pannelli. Le condizioni di amplificazione quelle ottimizzati sono basate su uno standard sonda basata protocollo in tempo reale PCR con un 10 min a 95 ° C attivazione enzimatica seguita da denaturazione a 95 ° C e AnnEaling / estensione a 60 ° C. I primer e le sonde sono pre-stampati sulle piastre anche utilizzando condizioni produttore ottimizzato e quindi non richiedono titolazione. Combinando i passaggi trascrizione inversa e pre-amplificazione per tutti i campioni (indipendentemente dal tipo di destinazione) è necessario per mantenere l&#39;efficienza del flusso di lavoro. Avere tutti i campioni trascrizione inversa è anche utile per massimizzare la sensibilità. Inoltre, l&#39;uso di una miscela master per il preamplificatore ottimizzata per inibitori riduce permette versatilità nel combinare diversi tipi di campione sulla stessa piastra. Il Center for Disease Control (CDC) saggio matrice di influenza descritto da Shu et al. 7 e adattato qui per le reazioni scala nanolitro è una influenza universale Un test che è appropriato per i campioni di prova da esseri umani e animali da compagnia. E &#39;stato progettato per il rilevamento universale del gene matrice di tutti i virus dell&#39;influenza A usando rea scala microlitroAZIONI. E &#39;stato utilizzato in tutto il mondo come parte di un Panel virus CDC influenza umana e di un pannello di influenza suina CDC. Il EHV-1 test 8 adattato qui rileva un importante patogeno respiratorio dei cavalli che possono causare aborti e malattie neurologiche (recensito da Pusterla e Hussey 10). Il significato di adattare questi test per una piattaforma high-throughput con un controllo interno specie indipendente è che possono essere incorporati in un approccio di sorveglianza OneHealth. Avendo entrambi questi saggi su una piattaforma di test high-throughput faciliterà la preparazione alle emergenze per le strutture cliniche, ricoveri, e gli eventi di prestazioni. I risultati sopra descritti erano rappresentative di tutti gli obiettivi sulla piastra con l&#39;eccezione di Mycoplasma CYNOS, che ha mostrato considerevolmente più variazione delle prestazioni analitica. Questo è probabilmente dovuto alla temperatura di sub-ottimali di fusione (T m) dei primer, che idealmente dovrebbe essere 58-60 &amp;# 176; C (la sonda ideale Tm è 68-70 ° C). Una limitazione di questa piattaforma è che ci vuole più tempo per progettare e realizzare le piastre che per ordinare le singole sonde, che limita la capacità di modificare rapidamente le sequenze. Un&#39;altra limitazione di PCR in tempo reale, in generale, è l&#39;incapacità di rilevare romanzo o patogeni inattesi. Questo può essere superato in una certa misura progettando saggi che hanno sequenze di specie diverse, ma imparziali metodologie basate genoma sequenziamento sono più adatti per la scoperta di nuovi agenti. 11,12 Nanoscale PCR in tempo reale permette un nuovo paradigma per la sindrome-based piuttosto che specie basati su test, che è utile per ridurre reagenti e costo del lavoro in diagnostica molecolare ad alto throughput. Su larga scala test panel da questo approccio può facilitare gli sforzi di sorveglianza OneHealth come quelli descritti da Dunne e Gurfield 13 e Moutailler et al. 14. La raccolta dei campioni di tamponi precoce,generalmente entro 3 giorni di manifestazione clinica, offre la migliore possibilità di identificare la presenza di patogeni respiratori. Infettiva comparsa della malattia è spesso imprevedibile, e le prove che possono essere eseguite su diverse specie, senza la necessità di modifica dei reagenti sono ideali per la preparazione. Le future applicazioni di questa tecnologia sono suscettibili di essere in pathotyping, profilatura resistenza antimicrobica, ed ulteriori pannelli di diagnostica clinica sindrome-based. Nanoscale PCR in tempo reale è molto utile per lo screening rapido, high-throughput di molteplici tipi di campioni e patogeni, e sarebbe completato da approcci imparziali o parzialmente distorti sequenziamento-based per l&#39;individuazione di nuove ed emergenti agenti patogeni.

Con la domanda per la rilevazione rapida e completa di molteplici agenti in diagnostica clinica per l&#39;uomo e gli animali, unico organismo metodi diagnostici molecolari per il rilevamento degli agenti patogeni sono gravosi se non usato per un gran numero di campioni in fase di sperimentazione per una singola malattia. Nel contesto veterinaria, high throughput metodologie diagnostiche sono particolarmente importanti a causa della necessità supplementare per coprire patogeni da un&#39;ampia varietà di specie. OneHealth approcci per la gestione delle malattie di origine alimentare e la sorveglianza degli agenti patogeni emergenti sono esempi di esigenze di test che includono un numero di batteri, virus (DNA o RNA based), parassiti e funghi. La sfida di combinare test per più analiti insieme (multiplexing) al fine di migliorare l&#39;efficienza di test è una possibile perdita di sensibilità e un grande peso per l&#39;ottimizzazione e la validazione di saggi. in tempo reale scala nanoliter reazione a catena della polimerasi (PCR) è un alternativo per la pratica di multiplazione che permette molte reazioni separate di eseguire contemporaneamente sullo stesso campione 1. La piattaforma OPENARRAY è un&#39;applicazione di questo principio 2; combina la tecnologia dei microarray con real-time PCR. Basato sul concetto di multiplexing spaziale, ogni campione viene testato per un gran numero di bersagli in separato fori passanti. Questa piattaforma è stata inizialmente utilizzata con legame al DNA a doppio filamento Cyanine a base chimica 2 ed è ora disponibile per la chimica sonda-based utilizzando sonde tempra scuri 3. Questa piattaforma è stata principalmente utilizzato per la profilazione genetica negli esseri umani e negli animali 4 5. E &#39;stato recentemente adattato per rilevare il DNA e RNA agenti patogeni da Grigorenko et al. 6 utilizzando una procedura in due fasi inversa trascrizione / pre-amplificazione (preamplificatore). Descriviamo qui di una procedura preamplificatore a base one-step per la rilevazione di entrambi i tipi di agenti patogeni nel sec respiratoriaretions e una varietà di altri tipi di campioni che possono essere eseguite interamente in una giornata lavorativa normale. Al completamento del preamplificatore one-step, i campioni vengono trasferiti ad una piastra a 384 pozzetti, che è il formato accettato dal sistema di gestione dei liquidi automatizzato che viene con questa piattaforma nanoscala PCR. Il sistema disegna il master mix e il campione su tutta la superficie di un massimo di 4 piastre (192 campioni e controlli) alla volta. In seguito a questo processo di caricamento, si descrive come i campioni sono amplificati e analizzati utilizzando un foglio di calcolo macro che riassume la media di 3 repliche tecnici per ogni combinazione campione / target in una tabella che si inserisce in una pagina stampata. è stato stabilito un metodo uniforme per l&#39;analisi del DNA e / o RNA estratto da campioni che utilizzano questa piattaforma. Un&#39;ampia varietà di campioni sono stati estratti, retrotrascritto, e pre-amplificato in un formato a 96 pozzetti, minimizzando la possibilità di errori. campioni respiratori testati inclusi tamponi nasali, tamponi faringei profondi,lavaggi trans-tracheale, lavaggio broncoalveolare, e tessuto polmonare. Poiché alcuni degli agenti testati possono anche essere presenti nel sangue periferico o feci, abbiamo incorporato questi tipi di campioni nella procedura. Questo flusso di lavoro consente di risparmiare tempo e risorse rispetto alla corsa esperimenti in più piatti, permettendo test efficiente attraverso patogeno e la tossina rilevazione gene pannello a base al posto di test individuale. Il pannello respiratoria dimostrato qui aveva 18 saggi di ogni stampati in triplice copia fori passanti, che possono ospitare fino a 48 campioni per piastra. I patogeni equine rilevati inclusi adenovirus equina 1 e 2, il virus arterite equina, equina virus rinite A e B, equina herpesvirus (AAT) tipi 1 e 4, e Streptococcus equi. I patogeni canino incluso canine coronavirus respiratorio (betacoronavirus), virus del cimurro canino, adenovirus canino, virus parainfluenza canina, pneumovirus canina, Bordetella bronchiseptica e Mycoplasma CYNOS. UNl&#39;influenza universale sono stati inclusi anche un saggio e un controllo interno (MS2 RNA fago).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:227px;">Zap-OGlobin II lytic reagent</td>
			<td style="width:239px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">7546138</td>
			<td style="width:167px;">Optional reagent for preparing blood samples.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:227px;">Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">AM1840</td>
			<td>Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix )</td>
			<td style="width:239px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">95134-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Gene-specific primer pool</td>
			<td style="width:239px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom order</td>
			<td>Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:227px;">Random primer mix</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1330S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:227px;">Standard 96-well plate</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:227px;">Amplification master mix (OpenArray master mix)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4462164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Clear adhesive seal</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">430611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Foil seal</td>
			<td style="width:239px;">Excel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:227px;">384-well plate</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4406947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4470813</td>
			<td>Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:30px;width:227px;">Accessories kit</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4469576</td>
			<td>Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:227px;">AccuFill tips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4457246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4471090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">Liquid handler (OpenArray AccuFill System)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4457243</td>
			<td>This is purchased with the amplification machine.</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:227px;">Primer design software (Primer Express)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4363991</td>
			<td>See manufacturer&#39;s instructions for detailed primer and probe specifications.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:227px;">Image analysis program (ImageJ)</td>
			<td style="width:239px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Spreadsheet program (Excel)</td>
			<td style="width:239px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at https://products.office.com/en-us/excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">PCR plate spinner</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89184-608</td>
			<td>This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">TE buffer</td>
			<td style="width:239px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8890-100ML</td>
			<td>10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">DMEM</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tissue disruptor (TissueLyser II)</td>
			<td style="width:239px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">Conventional thermal cycler (Veriti)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td>Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput detection of respiratory pathogens in animal specimens by nanoscale pcr

scala nanoliter real-time PCR utilizza multiplexing spaziale per consentire a più test da eseguire in parallelo su un singolo piatto senza gli svantaggi tipici di combinare insieme le reazioni. Abbiamo progettato e valutato un pannello basato su questo principio per identificare rapidamente la presenza di agenti patogeni comuni nei cani e cavalli con malattia respiratoria acuta. Questo manoscritto descrive un flusso di lavoro PCR diagnostico su scala nanometrica per la preparazione del campione, l&#39;amplificazione e l&#39;analisi di sequenze bersaglio patogeni, concentrandosi sulle procedure che sono diverse dalle reazioni scala microlitro. Nel pannello respiratoria presentato, 18 saggi sono stati ogni istituiti in triplice copia, che possono ospitare fino a 48 campioni per piastra. Una estrazione e di pre-amplificazione del flusso di lavoro universale è stato ottimizzato per la preparazione dei campioni high-throughput per ospitare molteplici matrici e gli agenti patogeni a base di DNA e RNA. dati rappresentativi sono presentati per un obiettivo RNA (influenza A matrice) e un obiettivo di DNA (herpesvirus equino1). La possibilità di testare in modo rapido e preciso per un gruppo completo sindrome a base di agenti patogeni è uno strumento prezioso per migliorare l&#39;efficienza e l&#39;ergonomia di test diagnostici e per la diagnosi della malattia respiratoria acuta e gestione.

I risultati sono mostrati nelle figure 1 e 2 per un saggio rappresentante RNA (matrice influenza) e test DNA (EHV-1) con una combinazione di controlli positivi e campioni clinici presentati per test diagnostici di routine. I segnali di fluorescenza emessi durante questa reazione tipica sono mostrati in Figura 1, che riporta i valori di fluorescenza prime per ciclo. Tutti i valori di soglia relativo ciclo (CT) sono stati generati automaticamente dal software della macchina di amplificazione. Fluorescenza di fondo è stato utilizzato come metrica separata per la valutazione della qualità loading invece di inserirla nelle letture di fluorescenza prima di calcolare valori Ct. Il limite analitico di rilevazione (LOD) per ogni obiettivo è stato calcolato sulla base della media complessiva dei valori Ct al livello di rilevamento del 95% più 2 deviazioni standard in una pozza di controlli pertutti gli obiettivi. La diluizione più alta in cui almeno il 95% dei replicati sono risultati positivi per la metodica di rappresentanza era di 50 copie; rilevamento di 5 copie avuto successo nel 50% dei replicati. Nessuno dei due test è stato rilevato al di sotto di una copia. I limiti di determinazione per il dosaggio RNA e DNA sono stati calcolati a valori Ct di 21.92 e 20.05. Questi valori sono stati considerati i tagli per i valori di segnalazione come positivi contro sospetti (potenzialmente non ripetibile). Altri aspetti della performance analitica degli obiettivi è stata valutata utilizzando diluizioni seriali di controlli positivi pool eseguito in tre giorni diversi (Figura 2). Le efficienze medie delle analisi rappresentative RNA e DNA sono stati 101,1% e del 106,6%; l&#39;efficienza media complessiva per tutti i target era 101,3%. I saggi avevano anche buona linearità (R 2&gt; 0,98). Variazione all&#39;interno replicare fori passanti in genere era all&#39;interno deviazioni standard di 0,2 per entrambi i campioni clinici di und controlli. Non è stata osservata cross-reattività tra uno qualsiasi dei bersagli. Il foglio di lavoro Risultati finali nel file supplementare mostra risultati quantitativi rappresentativi per 10 campioni di diagnostica clinica e 4 controlli. I campioni clinici sono un sottoinsieme dei tipi di campioni di routine test, compresa nasali / orofaringei, tessuto polmonare, e campioni di feci. Un (equina) campione di feci in questa serie mostra un fallito controllo interno MS2, che indica la presenza di inibitori nel campione. Questo è tipicamente gestito dalla diluizione del campione eluito e / o ri-estrazione. Come è il caso qui, il controllo di amplificazione negativo deve essere negativo per tutte le destinazioni, e il controllo di estrazione negativo dovrebbe contenere solo il controllo interno. Nel set clinica, campioni prodotti valori Ct per betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, cimurro canino virus A, il virus parainfluenza canina, pneumovirus canino, e l&#39;influenzaUN. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> Figura 1. trame amplificazione. Letture di fluorescenza vengono riportati in cicli di amplificazione per il dosaggio RNA (A) e test DNA (B). I triangoli sono mostrati denota valori Ct. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> Figura 2. Le curve standard. Le curve standard dal dosaggio RNA e DNA testato in tre giorni diversi sono tracciati per dimostrare la linearità e la gamma di amplificazione utilizzando controlli positivi. Ciclo soglia valori (R) sono in grafico contro log (10) del numero di copie di RNA (A) o DNA ( <strong&gt; B) di serie. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> Tabella 1. Schema del piatto e di destinazione posizioni di amplificazione. Le lastre utilizzate per la scala nanometrica in tempo reale test PCR su questa piattaforma sono microscopio dimensioni e sono disposti in 48 sottoarray di 64 fori passanti, con un totale di 3.072 fori passanti per reazioni individuali. Un sottoarray è mostrato qui, con 18 bersagli in triplice copia. Ogni campione viene aggiunto a una sottomatrice dal gestore liquido. Le piastre sono rivestite con composti idrofili e idrofobi per mantenere i reagenti in fori passanti tramite tensione superficiale. Il chip in acciaio inox è &quot;fotolitograficamente modellato e bagnato-attaccato per formare un allineamento rettilineo di 3.072 micro-lavorati, 320 micron diamete. R fori di 33 nl ogni &quot;2 abbreviazioni per gli obiettivi sono i seguenti: BCOR, canino coronavirus respiratorio (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, adenovirus canino; CPIV, virus parainfluenza canina; CPNV, pneumovirus canino; DISTA / B, canino cimurro virus A e B; EADV1 / 2, adenovirus equina 1/2; EAV, equina virus arterite; EHV1 / 4, equina a herpesvirus 1/4; ERVA / B, equina virus rinite A / B; IVM, influenza A matrice; MCYNOS, Mycoplasma CYNOS, MS2, controllo interno (MS2 RNA del fago); SEQU, Streptococcus equi. <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> Viene mostrato Tabella 2. carta di trasferimento del piatto. Una mappa di trasferimento piatto color-coded per l&#39;utilizzo di una pipetta a 8 canali fissi per il trasferimento dalla piastra preamplificatore a 96 pozzetti alla piastra a 384 pozzetti. In alternativa, una pipetta regolabile può essere utilizzato. La stessa procedura viene eseguita ogni volta, indipendentemente h<html> ow molti campioni nella piastra. <img alt="File supplementare" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> Viene fornito il file supplementare. Un file di foglio di calcolo con attivazione macro che contiene due macro per i risultati di formattazione in una tabella di sintesi (come descritto nel protocollo). Un tipico tabella dei risultati generati dalle macro è incluso nel file (sotto Risultati finali). Le due macro riempiranno i nomi di esempio nella prima colonna (fino a 48 campioni) e la media dei tre valori Ct per ciascun bersaglio per quelli con risultati positivi; notare che gli obiettivi che non si amplificano appaiono vuoti in questa tabella. Questo può essere facilmente stampata su un pezzo di carta e utilizzato come riferimento per controllare efficacemente i dati grezzi. Nella scheda risultati finali, vengono mostrati risultati rappresentativi per i campioni clinici 10 e 4 controlli. Abbreviazioni per i nomi di analisi sono elencati nella legenda della tabella 1.www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per scaricare il file.

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High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  Cornell University Animal Health Diagnostic Center.  test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio. 

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

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Immunologia e infezioni

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

High-throughput di Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

La genotipizzazione di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Per ribosomiale Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Test immunoistochimico per il rilevamento dell'antigene del lyssavirus da tessuti fissati con formalina

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the presence of neutralizing antibodies against the virus may provide protection against future infection. Thus, as the creation and translation of effective COVID-19 vaccines continues at an unprecedented speed, the development of fast and effective methods to measure neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 will become increasingly important to determine long-term protection against infection for both previously infected and immunized individuals. This paper describes a high-throughput protocol using vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped with the SARS-CoV-2 spike protein to measure the presence of neutralizing antibodies in convalescent serum from patients who have recently recovered from COVID-19. The use of a replicating pseudotyped virus eliminates the necessity for a containment level 3 facility required for SARS-CoV-2 handling, making this protocol accessible to virtually any containment level 2 lab. The use of a 96-well format allows for many samples to be run at the same time with a short turnaround time of 24 h.

The protocol described here outlines a fast and effective method for measuring neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 spike protein by evaluating the ability of convalescent serum samples to inhibit infection by an enhanced green fluorescent protein-labeled vesicular stomatitis virus pseudotyped with spike glycoprotein.

Rilevamento di anticorpi neutralizzanti SARS-CoV-2 utilizzando l'imaging fluorescente ad alto rendimento dell'infezione da pseudovirus

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...