Die Arbeit an respiratorischen Erreger Assays hier beschrieben wurde von der Cornell Animal Health Diagnostic Center interne Entwicklungsfonds unterstützt. Die Entwicklung der nanoskaligen PCR-Workflow und die damit verbundenen Qualitätssicherungssysteme wurde teilweise finanziert (FOA PA-13-244) und in Zusammenarbeit mit der Food and Drug Administration Veterinary Laboratory Investigation and Response Network (FDA Vet-LIRN) unter Grant No 1U18FD005144- ausgeführt 01. Die Gebühren für die Veröffentlichung wurden von VWR und Quanta Biosciences gefördert. Wir danken Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, und Katrina Walker für ihre Unterstützung beim Schreiben und das Protokoll zu überprüfen. Wir danken Mike Carroll, die Autor Interviews für die Dreharbeiten. Wir danken schließlich den Editor und drei anonymen Gutachtern für ihre hilfreichen Kommentare.

<ol>
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Marcia Slater und Elen Ortenberg sind Mitarbeiter von Thermo Fisher Scientific Inc., der in diesem Artikel verwendeten Reagenzien und Instrumente produziert.

Dieses Verfahren wurde für die Routineprüfung von respiratorischen Pathogenen in unserem Labor im Laufe von sechs Monaten (2-3 mal pro Woche) verwendet. Wir haben auch Erfolg das gleiche Verfahren für magensaftresistente Erreger Profilierung in Kotproben und bakterielle Isolate auf einem separat angepasst Platte verwenden. Sobald die Platten hergestellt werden, können erfahrene Mitarbeiter Schritte abgeschlossen innerhalb einer Standard Arbeitstag 2-7. Die kritischsten Schritte sind die einwandfreie Abdichtung des Vorverstärkers Platte, wobei die Übertragung von vorverstärkt Proben zwischen den Platten, und die endgültige Überdeckung der Verstärkungsplatte (die schnell Verdampfung durchgeführt werden müssen, um zu verhindern). Verwendung des Makro-Tabelle als Leitfaden für die Ergebnisanalyse (Kurven für Proben und Kontrollen Kontrolle) war ebenfalls wichtig, da sie stark die Menge an Zeit und Papiere für diesen Prozess benötigt reduziert. Die bereitgestellte Makro-Tabelle ist ein Beispiel; es müssten für Platten mit unterschiedlichen Konfigurationen modifiziert oder neu erstellt werden. Dies kann leicht sein performed von jemandem mit grundlegenden Tabellen Wissen. Aufgrund der sehr geringen Menge an Probe geladen auf die Verstärkungsplatte (33 nl) wird Vorverstärkung erforderlich. Bei der Optimierung dieses Protokolls (nicht gezeigt) verglichen wir eine Reihe von Vorverstärkung Parameter einschließlich der Master-Mix, Zugabe von Zufallsprimern, die Anzahl der Zyklen, Glühzeit und Verdünnung vor der Amplifikation. Jedes Ziel hatte seine eigenen optimalen Bedingungen und die hier beschriebenen repräsentieren diejenigen, die die besten Nachweisgrenze insgesamt für unsere Platte ergab. Dieses Panel deckt ein breites Spektrum von pathogenen Ziele und Probentypen, die in der Routine Veterinärdiagnostik angetroffen werden, aber Änderungen an den Vorverstärkung Verfahren können für verschiedene Platten erforderlich sein. Die Hersteller optimierte Amplifikationsbedingungen sind auf einem Standard-Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Protokoll mit einem 10 min bei 95 ° C Enzymaktivierung, gefolgt von einer Denaturierung bei 95 ° C und ann basierendEaling / Extension bei 60 ° C. Die Primer und Sonden sind vorgedruckt auf den Platten auch hersteller optimierten Bedingungen verwenden und benötigen daher keine Titration. die Reverse-Transkription und Vorverstärkung Schritte Kombination für alle Proben (unabhängig von der Art des Ziels) war notwendig, um die Effizienz in der Arbeitsablauf zu halten. alle Proben transkribierten umkehren zu haben, ist auch von Vorteil für die Maximierung der Empfindlichkeit. Weiterhin kann die Verwendung eines Master-Mix für den Vorverstärker, die zur Minimierung Inhibitoren optimiert ermöglicht Vielseitigkeit in verschiedenen Probentypen auf der gleichen Platte verbinden. Das Center for Disease Control (CDC) Influenza - Matrix - Test von Shu et al. 7 und hier für Nano- Maßstab Reaktionen angepasst ist ein universelles Influenza - A - Test, der für die Prüfung Proben von Menschen und Haustieren geeignet ist. Es wurde für den universellen Erfassung des Matrix-Gen aller Influenza-A-Viren mit Mikrolitermaßstab rea entworfenctions. Es wurde auf der ganzen Welt als Teil einer CDC humanen Influenzavirus-Panel und einer CDC Schweinegrippe-Panel verwendet. Der EHV-1 - Test 8 angepasst hier erkennt einen wichtigen respiratorischen Erreger der Pferde , die Abtreibungen und neurologische Krankheit (rezensiert von Pusterla und Hussey 10) verursachen können. Die Bedeutung dieser Tests zu einer Hochdurchsatz-Plattform mit einer Spezies-unabhängige interne Kontrolle der Anpassung ist, dass sie in eine OneHealth Überwachung Ansatz integriert werden können. beide dieser Tests auf einem Hochdurchsatz-Testplattform hat, wird die Notfallplanung für die klinische Einrichtungen, Schutz und Performance-Events erleichtern. Die oben beschriebenen Ergebnisse waren repräsentativ für alle Ziele auf der Platte mit Ausnahme von Mycoplasma Cynos, die in der analytischen Leistung deutlich mehr Variation zeigte. Dies war wahrscheinlich auf die suboptimale Schmelztemperatur (T m) der Primer, die im Idealfall sein sollte 58-60 &amp;# 176; C (die ideale Sonde Tm 68-70 ° C). Eine Einschränkung dieser Plattform ist, dass es länger als die Platten für die Bestellung von einzelnen Sonden, die die Fähigkeit, Sequenzen zu schnell ändern begrenzt zu entwerfen und herzustellen braucht. Eine weitere Einschränkung der Echtzeit-PCR in der Regel ist die Unfähigkeit, neuartige und unerwartete Pathogene zu erkennen. Dies kann durch die Gestaltung Assays zu einem gewissen Grad überwunden werden , die Sequenzen in mehreren Spezies entsprechen, aber unvoreingenommene ganze Genom - Sequenzierung basierte Methoden sind besser geeignet für die Entdeckung von neuen Wirkstoffen. 11,12 Nanoskalige real-time PCR ermöglicht ein neues Paradigma für Syndrom-basierte eher als Spezies-basierte Tests, die für die Reduktionsmittel und Arbeitskosten im Hochdurchsatz-Molekulardiagnostik nützlich ist. Groß Panel Test durch diesen Ansatz kann OneHealth Überwachungs Bemühungen erleichtern, wie jene , die von Dunne und Gurfield 13 und Moutailler et al. 14. Sammlung von Tupferproben früh,Regel innerhalb von 3 Tagen nach dem Auftreten klinischer Symptome, bietet die beste Chance, das Vorhandensein von Atemwegserreger zu identifizieren. Infektionskrankheit Auflaufen ist oft unvorhersehbar, und Tests, die auf verschiedene Arten, ohne die Notwendigkeit einer Änderung der Reagenzien durchgeführt werden können für Bereitschafts- ideal sind. Zukünftige Anwendungen dieser Technologie sind wahrscheinlich in Pathotypisierung, Antibiotikaresistenz Profilierung zu sein, und weitere Syndrom basierten klinischen Diagnostik-Panels. Nanoskalige real-time PCR ist besonders nützlich für eine schnelle, Hochdurchsatz-Screening von Mehrfachproben und Erregertypen, und würde durch unvoreingenommene oder teilweise voreingenommen Sequenzierung basierte Ansätze zur Identifizierung neuer und entstehender Erreger ergänzt werden.

Mit der Nachfrage nach schnellen und umfassenden Nachweis von mehreren Agenten in der klinischen Diagnostik für Mensch und Tier, Einzelorganismus molekulardiagnostischen Methoden zur Erregernachweis sind beschwerlich verwendet, es sei denn für eine große Anzahl von Proben für eine einzelne Krankheit getestet. Im Veterinär Zusammenhang sind Hochdurchsatz-Diagnosemethoden besonders wichtig aufgrund der zusätzlichen Bedarf an Pathogenen aus einer Vielzahl von Arten abdecken. OneHealth Ansätze zur Verwaltung von lebensmittelbedingten Erkrankungen und Schwellen Erreger Überwachung Beispiele für Testanforderungen sind, die eine Reihe von Bakterien enthalten, Viren (DNA oder RNA-Basis), Parasiten und Pilze. Die Herausforderung an Tests für mehrere Analyten kombiniert zusammen (Multiplexing), um Testeffizienz zu verbessern, ist ein möglicher Verlust der Empfindlichkeit und eine große Belastung für die Optimierung und Validierung von Assays. Nano- Maßstab real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein alterauf die Praxis der Multiplex nativen , die viele getrennte Reaktionen laufen gleichzeitig auf derselben Probe 1 ermöglicht. Die Openarray - Plattform ist eine Anwendung dieses Prinzips 2; es kombiniert Microarray-Technologie mit Echtzeit-PCR. Basierend auf dem Konzept der räumlichen Multiplexen wird jede Probe für eine Vielzahl von Zielen in getrennten Durchgangslöchern getestet. Diese Plattform wurde zunächst mit Cyanin-basierten doppelsträngigen DNA - Bindungs Chemie 2 und ist jetzt für sondenbasierte Chemie mit dunklen Lösch Sonden 3 verwendet. Diese Plattform hat in den Menschen 4 und Tiere für die genetische Profilierung 5 verwendet in erster Linie sind. Es wurde vor kurzem durch Blut übertragbaren DNA und RNA Pathogenen durch Grigorenko et al zu erfassen. 6 einen zweistufigen Reverse-Transkriptions / Vorverstärkung (Vorverstärker) Verfahren. Wir beschreiben hier ein Ein-Schritt-Vorverstärker-basierte Verfahren für beide Arten von Krankheitserregern in der Atem sec Erkennungretions und eine Vielzahl von anderen Probentypen, die vollständig in einem Standard-Arbeitstag durchgeführt werden kann. Nach Beendigung der Ein-Schritt-Vorverstärker werden Proben auf eine Platte mit 384 Vertiefungen überführt, die das Format durch das automatisierte Flüssigkeitshandhabungssystem angenommen ist, die mit dieser nanoskaligen PCR Plattform kommt. Das System zeichnet die Master-Mix und die Probe über die Oberfläche von bis zu 4 Platten (192 Proben und Kontrollen) zu einer Zeit. Im Anschluss an diese Ladevorgang beschreiben wir, wie Proben verstärkt und analysiert, um eine Makro-Tabelle verwenden, die den Durchschnitt der drei technische Replikate für jede Probe / Ziel-Kombination in einer Tabelle zusammengefasst, die auf einer gedruckten Seite passt. Ein einheitliches Verfahren zur Analyse von extrahierten DNA und / oder RNA aus Proben mit Hilfe dieser Plattform etabliert. Eine große Vielfalt von Proben wurden extrahiert, revers transkribiert und in einer 96-Well-Format-Pre verstärkt, das Potenzial für Fehler zu minimieren. Atemproben getestet enthalten Nasenabstrichen, tiefe Pharynxabstriche,trans-tracheale wäscht, Bronchiallavage und Lungengewebe. Da einige der Agenten im peripheren Blut vorhanden sein können, auch getestet oder Kot, eingebaut wir diese Arten von Proben in das Verfahren. durch eine effiziente Prüfung durch Panel-basierte Erreger und Toxin-Gen Detektion anstelle einzelner Test Diese optimierten Workflow hilft, Zeit und Ressourcen zu sparen im Vergleich zu Experimenten in mehreren Platten ausgeführt wird. Die Atem Panel hier gezeigt hatte 18 Assays in dreifacher Ausfertigung Durchgangslöcher gedruckt jeweils zu 48 Proben pro Platte aufnehmen können. Die Pferde-Erreger nachgewiesen enthalten Pferde-Adenovirus 1 und 2, Pferde-Arteriitis - Virus, Pferde-Rhinitis Virus A und B, Pferde - Herpesvirus (EHV) Typen 1 und 4 und Streptococcus equi. Die Hunde-Erreger enthalten Hunde-respiratorischen corona (betacoronavirus), Hundestaupevirus, Hunde - Adenovirus, Hunde-Parainfluenza - Virus, Eckzahn Pneumovirus, Bordetella bronchiseptica und Mycoplasma Cynos. EINuniversellen Influenza-A-Test und eine interne Kontrolle (MS2 RNA-Phagen) wurden ebenfalls enthalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="751">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:227px;">Zap-OGlobin II lytic reagent</td>
			<td style="width:239px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">7546138</td>
			<td style="width:167px;">Optional reagent for preparing blood samples.</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:227px;">Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">AM1840</td>
			<td>Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix )</td>
			<td style="width:239px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">95134-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Gene-specific primer pool</td>
			<td style="width:239px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">custom order</td>
			<td>Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:227px;">Random primer mix</td>
			<td style="width:239px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">S1330S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:227px;">Standard 96-well plate</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">N8010560</td>
			<td>This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:41px;width:227px;">Amplification master mix (OpenArray master mix)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4462164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Clear adhesive seal</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">430611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Foil seal</td>
			<td style="width:239px;">Excel Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:227px;">384-well plate</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4406947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:227px;">Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4470813</td>
			<td>Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:30px;width:227px;">Accessories kit</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4469576</td>
			<td>Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:227px;">AccuFill tips</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4457246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:227px;">Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4471090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">Liquid handler (OpenArray AccuFill System)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4457243</td>
			<td>This is purchased with the amplification machine.</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;width:227px;">Primer design software (Primer Express)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4363991</td>
			<td>See manufacturer&#39;s instructions for detailed primer and probe specifications.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:227px;">Image analysis program (ImageJ)</td>
			<td style="width:239px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Spreadsheet program (Excel)</td>
			<td style="width:239px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at https://products.office.com/en-us/excel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">PCR plate spinner</td>
			<td style="width:239px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89184-608</td>
			<td>This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">TE buffer</td>
			<td style="width:239px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">8890-100ML</td>
			<td>10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">DMEM</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Tissue disruptor (TissueLyser II)</td>
			<td style="width:239px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:227px;">Conventional thermal cycler (Veriti)</td>
			<td style="width:239px;">Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">4375786</td>
			<td>Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput detection of respiratory pathogens in animal specimens by nanoscale pcr

Nano- Maßstab real-time PCR verwendet Spatial Multiplexing mehrere Tests zu ermöglichen, parallel auf einer einzigen Platte ohne die typischen Nachteile der Kombination von Reaktionen zusammen ausgeführt werden. Wir entwarfen und ausgewertet, um eine Platte auf diesem Prinzip beruhen, um schnell das Vorhandensein von gemeinsamen Krankheitserregern bei Hunden und Pferden mit akuten Atemwegserkrankungen zu identifizieren. Dieses Manuskript beschreibt einen nanoskaligen diagnostischen PCR-Workflow für die Probenvorbereitung, Amplifikation und Analyse von Zielpathogens Sequenzen, auf Verfahren konzentrieren, die von Mikrolitermaßstab Reaktionen unterschiedlich sind. In der Atem Panel vorgestellt wurden 18 Tests jeweils dreifach angesetzt, zu 48 Proben pro Platte aufnehmen können. Eine universelle Extraktion und Vorverstärkung Workflow wurde für Hochdurchsatz-Probenvorbereitung optimiert, um mehrere Matrizen und DNA- und RNA-basierte Krankheitserreger beherbergen. Repräsentative Daten sind für eine Ziel-RNA (Influenza-A-Matrix) und eine Ziel-DNA (Pferde-Herpesvirus vorgestellt1). Die Fähigkeit, schnell und genau zu prüfen, für eine umfassende, Syndrom-basierte Gruppe von Krankheitserregern ist ein wertvolles Instrument zur Verbesserung der Effizienz und Ergonomie von Diagnostik-Tests und für akute Atemwegserkrankungen Diagnose und Behandlung.

Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 für einen repräsentativen RNA - Assay (Influenza Matrix) und DNA - Test (EHV-1) mit einer Kombination von positiven Kontrollen und klinischen Proben abgegeben für diagnostische Routinetests gezeigt. Die Fluoreszenzsignale in dieser typischen Reaktion emittiert werden , in Abbildung 1 gezeigt , die rohen Fluoreszenzwerte pro Zyklus plottet. Alle relativen cycle threshold (Ct) -Werte wurden durch die Verstärkung Maschine Software automatisch generiert. Die Hintergrundfluoreszenz wurde als separate Metrik für die Beurteilung der Belastungs Qualität verwendet, anstatt sie in die Fluoreszenzmesswerte vor der Berechnung der Ct-Werte enthält. Die analytische Nachweisgrenze (LOD) für jedes Ziel wurde auf dem Gesamtmittelwert der Ct-Werte bei 95% Erkennungspegel plus 2 Standardabweichungen in einem Pool von Kontrollen berechnet füralle Ziele. Die höchste Verdünnung, bei denen mindestens 95% der Replikate positiv für den repräsentativen Assays wurden war 50 Kopien; Nachweis von 5 Kopien war in 50% der Wiederholungsversuche erfolgreich. Weder Test wurde bei unterhalb einer Kopie erkannt. Die LOD für die RNA und DNA-Test wurden bei Ct-Werte von 21,92 und 20,05 berechnet. Diese Werte wurden als die Cutoffs für die Berichterstattung Werte als positiv gegenüber verdächtig zu sein (möglicherweise nicht wiederholbar). Andere Aspekte der analytischen Leistungsfähigkeit der Ziele wurde mit Reihenverdünnungen von gepoolten positiven Kontrollen laufen bewertet an drei verschiedenen Tagen (Abbildung 2). Die mittleren Wirkungsgrade der repräsentativen RNA und DNA-Tests wurden 101,1% und 106,6%; der Gesamtmitteleffizienz für alle Ziele war 101,3%. Die Tests hatten auch eine gute Linearität (R 2&gt; 0,98). Variation innerhalb Replikation Durchgangslöcher war in der Regel innerhalb von Standardabweichungen von 0,2 für beide klinischen Proben eind Kontrollen. Keine Kreuzreaktivität zwischen jedem der Targets beobachtet. Die endgültigen Ergebnisse Arbeitsblatt in der zusätzlichen Datei zeigt repräsentative quantitative Ergebnisse für 10 klinische diagnostische Proben und 4 steuert. Die klinischen Proben sind eine Teilmenge der Arten von Proben routinemäßig einschließlich nasal / Oropharynxabstriche getestet, Lungengewebe und Stuhlproben. Ein (Pferde-) Stuhlprobe in dieser Reihe zeigt eine gescheiterte MS2 interne Kontrolle, die die Anwesenheit von Inhibitoren in der Probe anzeigt. Dies wird typischerweise durch Verdünnung der eluierten Probe und / oder Wiedergewinnung geleitet. Wie es hier der Fall ist, sollte die negativen Verstärkungssteuerung für alle Ziele negativ sein, und die negative Extraktionskontrolle sollte nur die interne Kontrolle enthält. In der klinischen Satz hergestellten Proben Ct - Werte für betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, Hundestaupevirus A, Hunde-Parainfluenza - Virus, Eckzahn Pneumovirus und GrippeEIN. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> Abbildung 1. Amplification Plots. Fluoreszenzablesungen gegen Amplifikationszyklen für die RNA - Assay (A) aufgetragen und DNA - Assay (B). Triangles sind bezeichnet Ct - Werte angezeigt. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> Abbildung 2. Standardkurven. Standardkurven aus der RNA und DNA - Test an drei verschiedenen Tagen getestet werden aufgetragen , um die Linearität und den Bereich der Amplifikation unter Verwendung von Positivkontrollen zu demonstrieren. Zyklus Schwellenwert (Ct) -Werte gegen log aufgetragen (10) der Anzahl von Kopien von RNA (A) oder DNA ( <strong&gt; B) Standard. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> Tabelle 1 : Schematische der Verstärkungsplatte und Zielorten. Die Platten verwendet für nanoskalige real-time PCR - Tests auf dieser Plattform sind Mikroskop - Objektträger-Größe und sind in 48 Sub - Arrays von 64 Durchgangslöcher mit insgesamt 3.072 Durchgangslöcher angeordnet für einzelne Reaktionen. Eine Sub-Array wird hier gezeigt, mit 18 Zielen in dreifacher Ausfertigung. Jede Probe wird hinzugefügt, um ein Subarray der Flüssigkeitshandhabungs. Platten werden mit hydrophilen und hydrophoben Verbindungen beschichtet Reagenzien in Durchgangslöchern durch die Oberflächenspannung zu halten. Der Edelstahl-Chip &quot;photolithographisch strukturiert und nass geätzt von 3072 Mikro bearbeitet, 320 &amp; mgr; m diamete eine geradlinige Anordnung zu bilden. r Löcher von 33 nl jeder &quot;2 Abkürzungen für Ziele sind wie folgt: BCOR, Hunde- Atemcorona (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, Hunde - Adenovirus; CPIV, Hunde-Parainfluenza - Virus; CPNV, Eckzahn Pneumovirus; DISTA / B, Hunde- Staupevirus A und B; EADV1 / 2, Pferde-Adenovirus 1/2; EAV, Pferde-Arteriitis-Virus; EHV1 / 4, Pferde-Herpes-Virus Typ 1/4; ERVA / B, Pferde- Rhinitis Virus A / B; IVM, Influenza-A-Matrix; MCYNOS, Mycoplasma Cynos; MS2, die interne Kontrolle (MS2 RNA - Phagen); TeilAnl, Streptococcus equi. <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> Tabelle 2. Platte Transfer Karte. Eine farbkodierte Platte Transfer Karte für die Verwendung eines festen 8-Kanal - Pipette aus der 96-Well - Vorverstärker Platte zu übertragen , um die 384-Well - Platte gezeigt. Alternativ kann eine einstellbare Pipette verwendet werden. Das gleiche Verfahren wird jedes Mal durchgeführt, unabhängig von h<html> ow viele Proben sind in der Platte. <img alt="Supplemental Datei" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> Supplemental - Datei. Ein Makro-fähigen Tabellenkalkulationsdatei zwei Makros für die Formatierung Ergebnisse in einer Übersichtstabelle enthält (wie im Protokoll beschrieben) vorgesehen ist. Ein typisches Ergebnis Tabelle durch die Makros erzeugt wird in der Datei (unter Jahresergebnis) enthalten. Die beiden Makros werden in den Musternamen in der ersten Spalte (bis zu 48 Proben) und der Durchschnitt der drei Ct-Werte für jedes Ziel für die mit positiven Ergebnissen zu füllen; beachten Sie, dass die Ziele, die nicht verstärken hat in dieser Tabelle leer angezeigt. Dies kann leicht auf ein Blatt Papier gedruckt werden, und als Referenz verwendet effizient die Rohdaten für die Überprüfung. In der abschließenden Ergebnisse Registerkarte repräsentative Ergebnisse für 10 klinische Proben und 4 Kontrollen gezeigt. Abkürzungen für die Assay - Namen sind in der Legende von Tabelle 1 aufgelistet.www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um diese Datei herunterzuladen.

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High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Aufrufe.  Cornell University Animal Health Diagnostic Center.  Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel. 

Serie: High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Kombination von Klebstoff-tape-basierten Sampling und Fluoreszenz In situ Hybridisierung zum schnellen Nachweis von Salmonellen On Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminescent &#39;Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Aufbau einer Liquid-bedeckten Kultur Polarized Menschliche Airway Epithelial Calu-3-Zellen, um Host-Zell-Antwort, um Atemwegspathogene Studie<em&gt; In-vitro-</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Hochdurchsatz-Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

Genotypisierung<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Durch ribosomalen Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Eine High-Throughput-Plattform für das Screening von Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Immunohistochemistry Test for the Lyssavirus Antigen Detection from Formalin-Fixed Tissues

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. While the direct fluorescent antibody (DFA) test or the direct rapid immunohistochemical test (DRIT) are most commonly utilized for the antigen detection, both tests require fresh and/or frozen tissues for impressions on slides prior to the antigen detection using antibodies. If samples are collected and fixed in formalin, neither test is optimal for the antigen detection, however, testing can be performed by conventional immunohistochemistry (IHC) after embedding in paraffin blocks and sectioning. With this IHC method, tissues are stained with anti-rabies antibodies, sections are deparaffinized, antigen retrieved by partial proteolysis or other methods, and incubated with primary and secondary antibodies. Antigens are stained using horseradish peroxidase / amino ethyl carbazole and counterstained with hematoxylin for the visualization using a light microscope. In addition to the specific antigen detection, formalin fixation offers other advantages like the determination of histological changes, relaxed conditions for specimen storage and transport (under ambient temperatures), ability to test retrospective cases and improved biological safety through the inactivation of infectious agents.

Here, we present an immunohistochemistry test protocol for the detection of rabies virus antigen as an alternative diagnostic test for formalin-fixed tissues.

Immunhistochemischer Test für den Lyssavirus-Antigennachweis aus formalinfixierten Geweben

One of the primary diagnostic modalities for rabies is the detection of viral ribonucleoprotein (RNP) complex (antigen) in the infected tissue samples. ...

Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the presence of neutralizing antibodies against the virus may provide protection against future infection. Thus, as the creation and translation of effective COVID-19 vaccines continues at an unprecedented speed, the development of fast and effective methods to measure neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 will become increasingly important to determine long-term protection against infection for both previously infected and immunized individuals. This paper describes a high-throughput protocol using vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotyped with the SARS-CoV-2 spike protein to measure the presence of neutralizing antibodies in convalescent serum from patients who have recently recovered from COVID-19. The use of a replicating pseudotyped virus eliminates the necessity for a containment level 3 facility required for SARS-CoV-2 handling, making this protocol accessible to virtually any containment level 2 lab. The use of a 96-well format allows for many samples to be run at the same time with a short turnaround time of 24 h.

The protocol described here outlines a fast and effective method for measuring neutralizing antibodies against the SARS-CoV-2 spike protein by evaluating the ability of convalescent serum samples to inhibit infection by an enhanced green fluorescent protein-labeled vesicular stomatitis virus pseudotyped with spike glycoprotein.

Nachweis von SARS-CoV-2 neutralisierenden Antikörpern mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzbildgebung von Pseudovirus-Infektionen

As the COVID-19 pandemic caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continues to evolve, it has become evident that the ...