The authors have no Acknowledgements.

1. Preparazione delle cellule <ol><li> cellule in crescita <ol><li> Grow D. cellule discoideum a medio AX a 23 ° C sotto la luce nelle piastre di coltura di tessuti. Evitare di tenere le cellule ad alta densità superiore al 75% di confluenza. NOTA: Per una risposta ottimale al calore stress, le cellule devono essere in fase di crescita esponenziale e non abbiano raggiunto fase stazionaria. </li><li> Il giorno prima di imaging, le cellule diviso in media di fluorescenza bassa (LFM) a 1 x 10 4 cellule / ml. NOTA: Questo passaggio è necessario per ridurre la fluorescenza di fondo causato dal fluido AX. Il tempo di incubazione può essere ridotto ad un minimo di 2 ore. Tuttavia, vescicole prese in media AX possono ancora generare qualche segnale di fondo dopo 2 ore. </li></ol></li><li> Cellule Preparazione per la microscopia <ol><li> Prima di imaging, le cellule raccolta dalla piastra di tessuto in LFM e trasferire un numero adeguato di cellule in piatti di fondo di vetro. NOTA: Solitamente,1 x 10 5 cellule / ml è sufficiente; tuttavia, se il setup sperimentale richiede periodi lunghi di imaging (più di 8 ore), il numero di cellule devono essere adeguati con attenzione, come D. cellule discoideum passeranno al ciclo di sviluppo e iniziare a trasmettere e globale se il numero di cellule sono elevati, mentre le sostanze nutrienti sono bassi. </li><li> Permettono alle cellule di stabilirsi per 20 min. Rimuovere le cellule non regolati sostituendo con attenzione il mezzo utilizzato con terreno fresco. </li></ol></li></ol> 2. Imaging NOTA: Il protocollo può essere utilizzato su sistemi a grande campo così come in configurazioni microscopia confocale. L&#39;utilizzo di una scatola di incubazione a temperatura controllata che copre gli obiettivi e la fase microscopio è utile, ma non essenziale per il controllo della temperatura. La temperatura della scatola incubazione è impostata la temperatura più alta usata nell&#39;esperimento, ad esempio, a 40 ° C se viene eseguita stress termico. Altrimenti, la temperatura viene impostata su 256; C. I cambiamenti di temperatura devono essere fatte in anticipo per consentire al sistema di adattarsi, come variazioni di temperatura durante l&#39;imaging possono influenzare la messa a fuoco. NOTA: Durante l&#39;imaging, la temperatura viene controllata utilizzando una camera di raffreddamento. La temperatura di default per l&#39;imaging cellule non-ha sottolineato è 23 ° C. Per le condizioni di tensione termica, la temperatura viene aumentata di conseguenza al livello desiderato. L&#39;elemento piezoelettrico nella camera di raffreddamento può rispondere molto rapidamente al cambiamento di temperatura. Tuttavia, il focus delle immagini può variare leggermente (può discostarsi fino a 20 micron a seconda del cambiamento di temperatura). Così rifocalizzazione manualmente all&#39;interno i primi minuti di acquisizione dell&#39;immagine, a meno che il microscopio utilizzato è dotato di un hardware di autofocus. <ol><li> L&#39;acquisizione delle immagini in condizioni di non-stress <ol><li> celle di immagine in condizioni di non-ha sottolineato a 23 ° C, acquistano un minimo di 6 campi di vista (FOV). NOTA: condizione non lo stress può essere visualizEd entrambi registrando un breve time-lapse (5-30 min) o l&#39;acquisizione di immagini fisse rappresentative. Per ogni linea di condizione o di cellule acquisire un minimo di 6 campi di vista (FOV). NOTA: Nel caso le singole celle sono di interesse, posizionare le rispettive cellule nel mezzo del FOV e registrare una serie di piastrelle 3 x 3 con il FOV contenente le cellule di interesse nel mezzo D.. cellule discoideum sono mobili e possono migrare fuori del campo di vista. Tuttavia, la serie di piastrelle 3 x 3 aumenta l&#39;area potenzialmente esplorato dalla cella di interesse e rimane tracciabile per periodi time-lapse di ~ 6 ore. </li><li> Acquisire z-pile di massimo 7 micron di 1-0.25 micron passi per catturare l&#39;intero volume della cella. </li><li> Acquisire un&#39;immagine di campo chiaro riferimento per valutare il numero totale di cellule. </li></ol></li><li> Acquisizione di immagini per lo stress termico <ol><li> Regolare la temperatura della camera di raffreddamento a 30 ° C secondo le istruzioni del produttore. &lt;/ Li&gt; <li> Dopo che il display della temperatura ha raggiunto il valore desiderato, riorientare manualmente il canale in campo chiaro e visualizzate tutte FOV registrati prima di iniziare il time-lapse. </li><li> Avviare un time-lapse per 4 ore di stress da calore, con un intervallo di tempo di 5-10 minuti tra i punti di tempo. Controllare la corretta messa a fuoco durante l&#39;acquisizione dei primi due punti di tempo. </li></ol></li><li> Acquisizione di immagini durante il recupero <ol><li> Dopo lo stress da calore, ridurre la temperatura torna a 23 ° C, attendere che il display della temperatura per regolare e riorientare manualmente. </li><li> Registra filmati time-lapse in fase di recupero per 8-10 ore a 10-20 intervalli di tempo min. Controllare la corretta messa a fuoco durante l&#39;acquisizione del primo punto temporale. </li></ol></li></ol> Analisi 3. Immagine NOTA: per quantificare il numero di cellule che ospitano foci citosolica, valuta il numero totale di cellule e il numero di cellule con foci citosolico in ogni tempotelaio. A causa della difficoltà di segmentare cellule da immagini in campo chiaro, la quantificazione deve essere fatto manualmente. Qui di seguito, l&#39;analisi dei dati è descritto per il pacchetto gratuito di elaborazione delle immagini ((http://fiji.sc/Fiji). Si richiede il plugin &quot;Cell Counter&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Valutare il numero totale di cellule <ol><li> Caricare l&#39;immagine in campo chiaro stack (XYT) facendo clic su &quot;File&quot; e &quot;Apri&quot;. </li><li> Aprire il plugin &quot;Cell Counter&quot; ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Cell Counter&quot;). Caricare la risma immagine cliccando su &quot;Inizializza&quot;. </li><li> Scegliere il tipo appropriato di contatori barrando l&#39;apposita casella. NOTA: l&#39;uso di tipo 1 come contatore per il numero totale di cellule e di tipo 2 come contatore per le cellule con focolai citosolico. Contare tutte le cellule. </li><li> Salvare i marcatori cliccando &quot;Save Markers&quot;. </li></ol></li><li> Valutare il numero di cellule con focolai citosolica <ol> &lt;li&gt; Caricare il HyperStack immagine di fluorescenza (XZYT) ( &quot;File&quot; - &quot;Apri&quot;) e fare una proiezione massima intensità utilizzando la &quot;Z-proiettore&quot; (Immagine / pile). </li><li> Aprire il plugin &quot;Cell Counter&quot;. Caricare l&#39;immagine risultante pila (XYT) facendo clic su &quot;Inizializza&quot;. </li><li> Caricare i marcatori facendo clic su &quot;Carica&quot; ​​Markers. ATTENZIONE: I nomi dei file di immagine di riferimento e lo stack di fluorescenza devono essere identici. Se necessario, rinominare di conseguenza prima di inizializzare lo stack di immagini. </li><li> Scegliere il tipo di indicatore appropriato (vedi 3.1.3) e contare le cellule con focolai citosolico. I marcatori esistenti possono essere utilizzati come guida per la posizione delle singole cellule. </li><li> Recuperare il numero di conteggi per fetta cliccando su &quot;Risultati&quot; e salvare i conteggi altrove per ulteriori calcoli. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il protocollo qui descritto può essere usato per studiare il comportamento di una particolare proteina di interesse in risposta allo stress indotto da calore. Aumento della temperatura a 30 ° C è stato segnalato per innescare la risposta allo stress termico e in queste condizioni la vitalità di D. discoideum è marcatamente ridotta. modifiche Il protocollo può essere modificato per confrontare il comportamento delle varie proteine ​​nelle stesse condizioni di stress. Per questo, le cellule che esprimono proteine ​​diverse con lo stesso tag fluorescenti vengono trasferiti in piatti multi-e, come quattro piatti da camera (sezione 1.3.1). Il protocollo può essere applicato anche su cellule co-esprimono proteine ​​con differenti marcatori, come GFP o RFP. Questo può essere ad esempio utilizzato per monitorare il comportamento delle varie componenti del sistema di controllo qualità delle proteine ​​(PQC). Le cellule che esprimono marcatore aggregazione GFP-tagged e diversi componenti PCQ RFP-tag possono essere osservate con multi-pozzobombati per l&#39;imaging. Questo garantisce le stesse condizioni di stress (velocità di aumento della temperatura / diminuzione, la durata della temperatura incremento / decremento) e permette studi comparativi. Inoltre, il protocollo può essere usato per studiare l&#39;influenza del sistema PQC sulla risposta allo stress termico. L&#39;attività dei componenti può essere modulata cambiando livelli di espressione utilizzando strumenti genetici come knock-out o sovraespressione o utilizzando disponibili in commercio inibitori specifici 6. Il proteasoma può essere inibita aggiungendo MG132 (100 mM) o lactacistina (10 pM) per mezzo di crescita. Il chaperone Hsp90 può essere inibita mediante geldanamycin (6 micron) o radicicol (10 micron). Il chaperone Hsp70 può essere inibita con VER-155088, anche se non siamo riusciti a confermare l&#39;efficacia di inibizione nelle nostre impostazioni sperimentali finora. Inibitori dovrebbero essere aggiunti un giorno prima di imaging e le cellule sono incubate per 14 ore. Criti<html> CAL passaggi all&#39;interno del protocollo Il passaggio critico per la valutazione della perturbazione indotta dal calore è lo stato delle cellule prima dell&#39;esperimento di imaging. Studi in lievito hanno mostrato che le cellule acquisiscono la resistenza ad una varietà di stress ambientali durante la fase stazionaria 13. Abbiamo anche osservato risposta minimo per applicare lo stress da calore se D. cellule discoideum avevano raggiunto fase stazionaria prima di imaging. Pertanto, mantenendo un numero costante di cella &lt;5 x 10 5 cellule / ml è critica. Inoltre, il numero di cellule elevate possono indurre la transizione dal ciclo vegetativo di D. discoideum al ciclo di sviluppo, innescando così percorsi da fame, che potrebbero portare ad una diversa risposta allo stress da calore. Se il numero di cellule alti sono raggiunti in fase di recupero dopo lo stress da calore, lo streaming e le cellule aggregazione possono interferire con l&#39;analisi dei dati come le cellule si muovono fuori fuoco (vedi Figura 4). contenuto &quot;&gt; limitazione della tecnica La perdita di messa a fuoco è il collo di bottiglia del protocollo. Durante variazioni di temperatura, il piano focale può spostare drasticamente, che richiede rifocalizzazione manuale in un periodo di tempo immediatamente dopo la modifica della temperatura. Il salto nel fuoco può essere a volte troppo estremo da superare con autofocus software, soprattutto se il tempo tra i punti di tempo è alta. Tuttavia, se il microscopio utilizzato è dotato di un autofocus hardware, questa strozzatura può essere aggirato. Importanza della tecnica con rispetto a metodi esistenti In confronto con configurazioni esistenti, come l&#39;uso di camere climatizzate, scatole di incubazione a temperatura controllata che coprono gli obiettivi ei fase fasi microscopio o temperatura controllata e collari oggettive, l&#39;uso di una camera di raffreddamento fornisce un controllo più preciso del ambiente temperatura. Il Peltier-elemento nella camera di raffreddamento può mantenere una tem costante ed uniformetemperatura in tutto l&#39;apparato sperimentale. In configurazioni classiche, le differenze di temperatura locali potrebbero portare a risultati di osservazione diversi. Inoltre, può rispondere rapidamente e rapidamente ai cambiamenti indotti nella temperatura, mentre configurazioni classici adattano molto lentamente alle variazioni di temperatura indotte, in particolare l&#39;abbassamento della temperatura. Il Peltier-elemento nella camera di raffreddamento può anche coprire una gamma più ampia di temperatura (15-40 ° C) rispetto configurazioni classici, con le temperature che raggiungono come 15 ° C o 40 ° C è molto difficile. Dictyostelium discoideum è particolarmente sensibile alla foto-tossicità. Precedenti studi utilizzati ascorbato come spazzino per ridurre la foto-tossicità. Tuttavia, i periodi di imaging lunghi richiedono integrazione aggiuntiva. Inoltre, l&#39;uso di ascorbato è limitata a studi in cui il meccanismo di interesse non è influenzato dal supplemento antiossidante. Si propone che l&#39;imaging temperatura controllata può essere utilizzata come alternativa ca.oach per minimizzare fototossicità e potrebbe essere combinata con l&#39;aggiunta di ascorbato di diminuire ulteriormente la tossicità. effetti fototossiche possono essere minimizzati fornendo una temperatura costante ed uniforme di 23 ° C utilizzando una camera di raffreddamento. Le cellule ripreso con controllo della temperatura mostrano meno segni di foto-tossicità, quali l&#39;arrotondamento delle cellule, per un periodo di tempo più lungo. Questo permette anche di imaging con intensità elevate, intervalli di tempo più o più campi di vista (FOV). Applicazione generale Stress termico a temperature superiori ha dimostrato di innescare calore diversa risposta allo stress 14. Pertanto, aumentando la temperatura a 34 ° C o 37 ° C potrebbe indurre una risposta differente. Oltre allo stress temperatura applicata, la durata di una particolare situazione di stress può essere modificato per studiare la risposta immediata o adattamento a lungo termine per stress termico. In generale, il protocollo descritto può essereesteso a una vasta gamma di applicazioni. Poiché il controllo preciso della temperatura riduce considerevolmente effetti foto-tossico, il protocollo può essere utilizzato in ambienti che richiedono elevati tempi di esposizione e / o elevate intensità di luce di eccitazione, per esempio, per la visualizzazione di proteine con un livello di espressione basso, o in combinazione con brevi intervalli di tempo tra le immagini, ad esempio, durante il time-lapse imaging. Può anche essere vantaggioso per immagini di oggetti che coprono tutta la cella, ad esempio, microtubuli, come queste impostazioni richiedono un elevato numero di z-sezioni ottiche.

Dictyostelium discoideum sono solitari amebe vivente terreno che si nutrono di batteri e altri microrganismi, che sono presi da fagocitosi. Ha un ciclo di vita unico e straordinario che è stato un importante settore di ricerca dalla sua scoperta 1. Il precoce interesse per lo sviluppo multicellulare 2 e le basi molecolari della chemiotassi 3 fu presto completata da studi incentrati sulla motilità cellulare, la polarità delle cellule, immunità innata. Inoltre, D. discoideum è stato introdotto come sistema modello per 4,5 ricerca biomedica. Recentemente, abbiamo stabilito D. discoideum come un nuovo sistema per studiare il sistema di controllo della qualità delle proteine (PQC) 6,7. Il suo proteoma è arricchito in proteine prioniche come aggregazione a rischio, che rappresenta una sfida per il controllo della qualità delle proteine 8. Per studiare se D. discoideum ha sviluppato meccanismi molecolari speciali per controllare il suo altamente agCongregazione incline proteoma, abbiamo studiato il comportamento delle proteine ​​marker di aggregazione a rischio sia in normali condizioni colturali e durante lo stress. Condizioni di stress, come ad esempio lo stress da calore, può essere utilizzato per aumentare il tasso di proteine misfolding 9. Pertanto, abbiamo cercato un sistema in cui siamo riusciti a indurre cambiamenti di temperatura e contemporaneamente seguire il comportamento delle proteine ​​marker. A questo scopo, abbiamo combinato live-cell imaging con riscaldamento Peltier controllato utilizzando un (camera di raffreddamento) inserto fase termica. Questo metodo ha permesso di mantenere una temperatura costante ed uniforme, così da indurre un cambiamento rapido ma preciso della temperatura. Live-cell imaging viene utilizzato per studiare una varietà di processi biologici in D. discoideum. Tuttavia, questo approccio deve affrontare due limiti importanti. Innanzitutto, le cellule mostrano un&#39;alta motilità e tendono a migrare fuori del campo di vista, inseguimento quindi delle singole celle spesso richiede l&#39;imaging di una grande area. La mobilità delle cellule puòessere ridotto di agar di copertura 10, tuttavia, tali condizioni non sono adatti per l&#39;imaging a lungo termine a causa di un calo della redditività. In secondo luogo, D. cellule discoideum mostrano una particolarmente elevata sensibilità a foto-tossicità, che si traduce in arrotondamento cellulare e arresto mitotico 11. Precedenti protocolli affrontato questo problema con l&#39;aggiunta di acido ascorbico come scavenger di radicali e la riduzione dei tempi di esposizione 12. Quest&#39;ultimo può essere critico se la proteina di interesse è espressa a livelli bassi e mostra un segnale debole fluorescenza. Gli autori suggeriscono anche di fornire una temperatura costante di 21 ° C sia per l&#39;imaging in una stanza con aria condizionata o utilizzando le caselle di incubazione a temperatura controllata, che coprono l&#39;obiettivo e microscopio fase 12. Qui, si descrive un metodo con un migliorato controllo della temperatura utilizzando una camera di raffreddamento impostato a 23 ° C. Durante l&#39;imaging nostro set-up migliora in modo significativo la resistenza alla foto-tossicità. essoconsente l&#39;utilizzo di tempi di esposizione più elevati e superiori intensità di luce di eccitazione. Questo è di particolare importanza durante time-lapse imaging, come gli intervalli di tempo devono essere attentamente bilanciata rispetto al numero di posizioni imaged e il tempo di esposizione utilizzato. La possibilità di aumentare il numero di posizioni impressi permette anche la copertura di un&#39;area più ampia di imaging e facilita il monitoraggio delle singole celle in un periodo di tempo più lungo.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Il protocollo di imaging descritto può essere utilizzato per analizzare il comportamento di proteine prioniche come aggregazione a rischio in un&#39;ameba D. discoideum durante stress termico. La Figura 1 mostra la distribuzione di Q103 proteine polyglutamine GFP-etichettato in cellule normali condizioni colturali (Figura 1A), dopo 2 ore di stress termico a 30 ° C (Figura 1B) e dopo 6 ore di recupero stress e crescita a normali condizioni di crescita (Figura 1C). Su aumento della temperatura da 23 ° C a 30 ° C, il marcatore Q103-GFP fonde da una distribuzione diffusa per puntiformi strutture. Dopo il rilascio di stress e la crescita a temperatura normale, queste strutture si dissolvono. La ridistribuzione di Q103-GFP e la formazione di calore indotta da stress citosolico foci possono essere quantificati utilizzando l&#39;analisi dell&#39;immagine. La figura 2A mostra l&#39;analisi dei singoli FOV utilizzando Fiji e il plugin &quot;Cell contatore &quot;. La figura 2B mostra la quantificazione della risposta allo stress termico. Questo dimostra che l&#39;aumento di focolai Q103-GFP citosolico in numero con continuo stress da calore. Durante lo stress da calore, il sistema (PQC) il controllo della qualità delle proteine è sopraffatto, quindi aggregation- proteine inclini come la Q103 proteina prionica-simili non possono essere mantenute in uno stato solubile e sempre aggregata foci citosolico. le cellule mostrano anche un arrotondamento caratteristica, come illustrato nella Figura 1B. la riduzione dei foci citosolico dopo la rimozione di stress suggerisce che l&#39;aggregato le proteine ​​sono dissolti. La qualità delle immagini è sensibile alla densità cellulare iniziale. Figura 3 mostra un esempio di cellule dopo il recupero stress, confrontando appropriata densità iniziale delle cellule (Figura 3A) e alta densità iniziale delle cellule (Figura 3B). Se la densità cellulare iniziale era troppo elevato, le cellule stellata per formare flussi come illustrato in figura 3b. Ciò che impone difficoltà sul successiva quantificazione come le cellule hanno spostato fuori del piano focale. Il metodo descritto può essere utilizzato per monitorare le variazioni di temperatura indotte come descritto sopra. Può anche essere utilizzato per ridurre fototossicità quando l&#39;imaging a temperatura crescita fisiologica. Figura 4 mostra un confronto di cellula ripreso a 23 ° C in una camera di raffreddamento (figura 4A) e cellule ripreso senza controllo della temperatura in una camera climatizzata, impostare a 25 ° C (Figura 4B). Al momento l&#39;esposizione costante alla luce di eccitazione, le cellule completano il quadro quando non è ripreso in condizioni di temperatura controllata. Questo cambiamento di forma delle cellule indica stress. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figura 1: <sTrong&gt; proteine prioniche come aggregazione inclini cambiare la loro distribuzione cellulare durante lo stress termico. GFP-tagged ricco di poliglutamine huntingtina esone 1 (Q103) è costitutivamente espresso in AX2-214 D. cellule discoideum (segnale GFP raffigurato nella tabella di ricerca invertito scala di grigi). (A) In condizioni normali di crescita a 23 ° C, Q103-GFP è diffuso distribuita nel citoplasma. (B) Dopo 2 ore di stress da calore a 30 ° C, Q103-GFP fonde in focolai citosolico (frecce rosse). Le cellule mostrano una caratteristica cambiamento di forma e completano. (C) Al rilascio stress e crescita a 23 ° C, il foci citosolico vengono disciolti. Dopo 6 ore, senza foci citosolico può essere osservato. Barra di scala = 10 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2: Quantificazione di formazione foci citosolico indotta dal calore (A) Analisi delle cellule con il pacchetto di elaborazione delle immagini gratuito Fiji e il plugin &quot;Cell Counter&quot;.. La quantità totale di cellule (tipo 1, contro i marcatori blu) viene determinata l&#39;immagine in campo chiaro a. I marcatori sono caricati nel GFP-canale e il numero di cellule con citosolica focolai (tipo 2, marcatori da banco rosso) è determinata. (B) Quantificazione dei focolai dopo 3 ore di stress da calore a 30 ° C e 3 ore di recupero dello stress a 23 ° C (n = 4 campi di vista, errore bar = SD). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 3: Effetto della densità cellulare in time-lapse imaging a lungo termine Cells (A) impressi a densità cellulari iniziali &lt;10 5 cellule / ml.. Dopo 3 ore di stress termico a 30 ° C e 6 ore di recupero stress a 23 ° C, le cellule rimangono nel ciclo vegetativo e dividere. Solo poche cellule uscire dal piano focale. (B) Le cellule ripreso a densità cellulari iniziale&gt; 10 6 cellule / ml. Dopo 9 ore di immagini (impostazioni come in A), le cellule sono entrati nel ciclo di sviluppo e ha iniziato lo streaming e l&#39;aggregazione. Le cellule in aggregati non possono essere chiaramente distinti. Una gran parte di cellule esce dal piano focale e non possono essere analizzati. Barra di scala = 10 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figura 4:. Effetto di controllo di temperatura effetti fototossiche cellule (A) ripreso per 10 min a temperatura controllata a 23 ° C: 6 campi di vista, z-stack (spaziatura 0,5 mM, spessore del campione 8 mM), lasso di tempo (totale tempo 10 min, periodo 1 min), il canale GFP (0,07 msec tempo di esposizione, il 10% dell&#39;intensità del laser), canale RFP (0,1 msec tempo di esposizione, l&#39;intensità del laser 10%). Le cellule non mostrano segni dei cambiamenti morfologici caratteristici associati allo stress fototossico. (B) Le cellule ripreso per 10 minuti, senza controllo della temperatura (stesse condizioni in A). Le cellule mostrano segni di fototossicità indotta arrotondamento, che indica lo stress. Barra di scala = 10 micron. Le cellule sono stati ripresi in un sistema basato su un microscopio con un obiettivo 100x / 1.4 apertura numerica (NA). Le immagini sono state raccolte con una telecamera CCD da 1.024 x 1.024 pixel file utilizzando 1 x 1 binning.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.2K Views.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

Analisi delle dinamiche di Actomyosin su scale cellulari e tissutali locali utilizzando film time-lapse di camere d'uovo di Drosophila coltivate

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

Un metodo di imaging semi-alto e un toolkit di visualizzazione dei dati per analizzare lo sviluppo embrionale C. elegans

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Monitoraggio della cinetica di aggregazione proteica in vivo utilizzando il conteggio automatico dell'inclusione in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Biochimica

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Neuroscienze

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Biologia

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

Una camera flessibile per l'imaging di cellule vive time-lapse con microscopia a diffusione Raman stimolata

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

Bioingegneria

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di

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A lungo termine Imaging in diretta di