Name: studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging
Uploaded: 2016-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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The authors have no Acknowledgements.

1. 셀 준비 <ol><li> 성장 세포 <ol><li> D. 성장 조직 배양 플레이트의 조명 아래 23 ° C에서 AX 매체에 discoideum 세포. 75 % 컨 플루 위의 높은 밀도에서 세포를 유지하지 마십시오. 주 : 최적의 응답은 열 스트레스를 들어, 세포가 기하 급수적 성장기에 있어야하고 정지상 도달 안된다. </li><li> 영상 전날, 1 × 104 세포 / ml 낮은 형광 매체 (LFM)로 분할 세포. 주의 :이 단계는 AX 매체에 의한 백그라운드 형광을 감소시킬 필요가있다. 배양 시간이 2 시간을 최소한으로 줄일 수있다. 그러나, AX 매체에 용해 소체 여전히 2 시간 후에 약간의 배경 신호를 생성 할 수있다. </li></ol></li><li> 현미경에 대한 준비 세포 <ol><li> 촬영하기 전에 LFM에서 조직 판에서 수확 세포와 유리 바닥 접시에 세포의 적절한 수를 전송합니다. 참고 : 일반적으로,1 × 10 5 세포 / ㎖ 충분하다; 실험 장치 (8 시간 이상) 긴 촬상 기간을 필요로하는 경우에는, 셀 번호 신중 D. 같이 조정될 필요 discoideum 세포는 발달주기에 전환과 영양분이 낮은 동안 휴대 번호가 높은 경우 스트리밍 집계하기 시작합니다. </li><li> 세포가 20 분 동안 정착하도록 허용합니다. 조심스럽게 새로운 배지로 사용되는 매체를 대체하여 비 정착 세포를 제거합니다. </li></ol></li></ol> 2. 이미지 주 : 프로토콜 넓은 필드 시스템뿐만 아니라, 공 초점 현미경 설정에 사용될 수있다. 목적을 덮는 온도 제어 배양 상자 현미경 스테이지의 사용은 유용하면서도 온도 제어에 필수적이지 않다. 열 응력 행하면 배양 상자의 온도는 40 ° C로, 실험 예에서 사용 된 높은 온도로 설정된다. 그렇지 않다면, 온도는 25로 설정되어있는6; C. 온도 변화는 촬상시의 온도의 변화가 초점에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 시스템은 적용 할 수 있도록 사전에 이루어져야한다. 주 : 촬상 동안, 온도가 냉각 실을 사용하여 제어된다. 비 스트레스 세포 이미징의 기본 온도는 23 ° C이다. 열 스트레스 조건, 온도를 원하는 수준으로 적절하게 증가된다. 냉각 실의 피에조 소자는 온도 변화에 빠르게 응답 할 수있다. 그러나, 이미지의 초점은 (는 온도 변화에 따라 최대 20 ㎛, 이탈 가능)이 약간 변화된다. 사용한 현미경 하드웨어 자동 초점이 장착되어 있지 않으면 서, 이와 같이 재 초점은 화상 획득의 첫 번째 분 내에 요구된다. <ol><li> 비 응력 조건 하에서 화상 취득 <ol><li> 23 ° C에서 비 스트레스 조건에서 이미지 세포는보기의 6 분야 (영상 범위)의 최소 취득. 참고 : 비 스트레스 조건은 visualiz 될 수 있습니다에드 대표 스틸의 짧은 시간 경과 (5 ~ 30 분) 또는 취득을 기록하여 하나. 각 조건 또는 셀 라인보기의 6 분야 (영상 범위)의 최소 취득. 주 : 각 셀이 관심이있는 경우, FOV의 중앙에 각 셀의 위치와 중앙에서 관심 셀을 포함하는 FOV 가진 3 × 3 타일 D. 시리즈를 녹화한다. discoideum 세포 운동성 및 FOV에서 마이그레이션 것이다. 단, 3 × 3 타일 시리즈 잠재적으로 관심있는 셀이 탐색 영역을 증가시키고, 이것은 ~ 6 시간의 경과 기간의 추적 유지된다. </li><li> 셀의 전체 부피를 캡처 1-0.25 μm의 단계에서 최대 7 ㎛ 인 Z-스택을 획득. </li><li> 세포의 총 수를 평가하는 기준 시야 화상을 취득. </li></ol></li><li> 열 스트레스에 대한 이미지 수집 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 30 ℃까지 냉각 실의 온도를 조정한다. &lt;/ 리&gt; <li> 온도 표시부가 원하는 값에 도달 한 후에, 시야 채널 수동 촛점과 저속을 시작하기 전에 기록 된 모든 영상 범위를 확인한다. </li><li> 시점 간 5-10 분의 시간 간격으로 열 응력의 4 시간 동안 시간 경과를 시작한다. 올바른 처음 두 시점의 취득시 초점 확인합니다. </li></ol></li><li> 복구시 이미지 획득 <ol><li> 열 스트레스 후, 다시 23 ° C까지 온도를 감소 조정하고 수동으로 집중할 수있는 온도 표시 될 때까지 기다립니다. </li><li> 10 ~ 20 분 시간 간격으로 8 ~ 10 시간 동안 복구 단계에서 기록 시간 경과 영화. 올바른 처음 지점의 인수 동안 초점을 맞추고 있는지 확인합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 분석 주 : 세포질 병소 형질 세포 수를 정량화 세포의 총 수 및 각 시간 세포질 병소와 세포의 수를 평가하기틀. 때문에 시야 이미지에서 세포를 분할의 어려움, 정량화 수동으로 수행해야합니다. 이하에서, 데이터 분석이없는 화상 처리 패키지 ((http://fiji.sc/Fiji). 이것은 &quot;셀 카운터&quot;(http://fiji.sc/Cell_Counter) 플러그인을 필요 대해 설명한다. <ol><li> 세포의 수를 평가 <ol><li> &quot;파일&quot;및 &quot;열기&quot;를 클릭하여 밝은 이미지 필드 스택 (XYT)를 넣습니다. </li><li> 은 &quot;카운터에서 셀&quot;플러그인 (- &quot;셀 카운터&quot; &quot;플러그인&quot;)을 엽니 다. &quot;초기화&quot;를 클릭하여 이미지 스택을로드합니다. </li><li> 해당 상자에 체크하여 카운터의 적절한 유형을 선택합니다. 참고 : 전체 세포의 수와 세포질 초점과 셀 카운터로 2 형에 대한 카운터로 사용 1을 입력합니다. 모든 세포를 계산합니다. </li><li> &quot;저장 마커&quot;를 클릭하여 마커를 저장합니다. </li></ol></li><li> 세포질 초점 가진 세포의 수를 평가 <ol> &lt;리&gt;는 형광 이미지 hyperstack (XZYT) ( &quot;파일&quot;- &quot;열기&quot;를)로드하고 &quot;Z-프로젝터&quot;(이미지 / 스택)를 사용하여 최대 강도 투사합니다. </li><li> 은 &quot;카운터에서 셀&quot;플러그인을 엽니 다. &quot;초기화&quot;를 클릭하여 결과 이미지 스택 (XYT)를 넣습니다. </li><li> &quot;로드 마커&quot;를 클릭하여 마커를로드합니다. 주의 : 기준 영상과 형광 스택의 파일 이름이 동일해야합니다. 필요한 경우, 이미지 스택을 초기화하기 전에 적절하게 이름을 바꿉니다. </li><li> 해당 마커 유형을 선택합니다 (3.1.3 참조) 세포질 초점으로 세포를 계산합니다. 기존의 마커는 각 셀의 위치에 대한 지침으로서 사용될 수있다. </li><li> &quot;결과&quot;를 클릭하여 슬라이스 당 카운트의 수를 검색하고 추가 계산을 위해 다른 곳에서 수를 저장합니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum.">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li><li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. 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The authors have nothing to disclose.

여기에 설명 된 프로토콜에 열 유도 응력에 응답하여 특정 관심 단백질의 거동을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 30 ° C까지 승온 열 스트레스 반응을 유발하는 것으로보고하고 D. 이러한 조건에서 생존 한 discoideum는 현저하게 감소된다. 수정 프로토콜은 동일한 응력 조건 하에서 다양한 단백질의 거동을 비교하기 위해 수정 될 수있다. 이를 위해, 같은 형광 태그와 다른 단백질을 발현하는 세포가 이러한 네 개의 챔버 접시 (섹션 1.3.1)로 다중 - 웰 접시에 옮기고있다. 프로토콜은 또한 GFP 또는 RFP 같은 다른 마커 단백질과 함께 공동 발현하는 세포에 적용 할 수있다. 이 단백질의 품질 관리 (PQC) 시스템의 다른 구성 요소의 동작을 모니터링하는 데, 예를 들어 수있다. GFP-태그 집계 마커 다른 RFP-태그 PCQ 성분을 발현하는 세포를 다중 웰을 사용하여 관찰 할 수있다이미징 걸려. 이것은 동일한 응력 조건 (온도 증가 / 감소, 온도 증가 / 감소 구간의 속도) 보장 및 비교 연구를 허용한다. 또한, 프로토콜은 열 스트레스 반응에 PQC 시스템의 영향을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 구성 요소의 활성은 이러한 녹아웃 또는 과발현 유전 도구를 사용하여 발현 수준을 변화시킴으로써 또는 시판 특정 억제제 (6)을 이용하여 변조 될 수있다. 프로 테아 좀은 성장 배지로 MG132 (100 μM) 또는 인 lactacystin (10 μM)를 첨가함으로써 억제 할 수있다. 샤프론의 Hsp90는 젤다 나 마이신 (6 μM) 또는 라디 (10 μM)를 사용하여 억제 할 수있다. 우리가 지금까지 우리의 실험 설정에서 억제 효능을 확인하지 수 있지만 보호자 인 Hsp70은 VER-155088으로 억제 할 수있다. 억제제 촬상 하루 전에 첨가되어야하고, 세포를 14 시간 동안 배양 하였다. Criti<html> 프로토콜 내 칼 단계 열 - 유도 교란의 평가를위한 중요한 단계 촬상 실험 이전의 셀의 상태이다. 효모의 연구는 세포가 정지상 (13) 동안 환경 스트레스의 다양한 저항을 얻을 것으로 나타났다. 우리는 또한 D. 경우 적용 열 스트레스에 최소한의 응답 성을 관찰 discoideum 세포는 이전의 이미지로 고정 단계에 도달했다. 따라서, 일정한 세포 수를 유지 &lt;5 × 105 세포 / ㎖가 중요하다. 또한, 높은 셀 번호 D. 식물의 사이클에서 천이를 유도 할 수있다 따라서 스트레스를 가열하는 다른 반응으로 이어질 수 있습니다 기아 경로를, 트리거, 발달주기에 discoideum. 높은 세포 수는 열 스트레스 스트리밍 후의 회복 단계에 도달하고 전지가 초점 이동 응집 세포 데이터 분석을 방해 할 수있는 경우 (도 4 참조). 콘텐츠 &quot;&gt;는 기술의 한계 포커스의 손실은 프로토콜의 병목 현상이다. 온도 변화 동안, 초점면은 즉시 온도를 변경 한 후 시간에 재 집속 설명서를 요구하는 대폭 전환 할 수있다. 포커스의 점프 때때로 시점 사이의 시간이 높고, 특히, 소프트웨어의 오토 포커스에 의해 극복하기에는 너무 극단적 일 수있다. 사용한 현미경 하드웨어 자동 초점이 장착되는 경우,이 병목 현상이 회피 될 수있다. 기존 방법에 대하여 기술의 중요성 이러한 에어컨 방, 목적 및 현미경 스테이지 또는 온도 제어 단계와 대물 옷깃을 덮는 온도 제어 배양 상자의 사용과 같은 기존의 셋업에 비하여, 냉각 실의 사용은 주위의보다 정확한 제어를 제공한다 온도. 냉각 실의 펠티에 소자는 일정하고 균일 한 템을 유지할 수 있습니다실험 설정을 통해 가능한 온도. 고전적인 설정에서, 지역의 온도 차이는 서로 다른 관측 결과로 이어질 수 있습니다. 고전 셋업 특히 강온 유도 온도 변화에 매우 느리게 적응하면서 또한, 온도에 의한 변화에 신속하고 빠르게 응답 할 수있다. 냉각 실의 펠티에 소자는 또한 15 ° C, 40 ° C로서 도달 온도가 매우 어렵다되는 고전 설정보다 더 넓은 온도 범위 (15 ~ 40 °의 C)을 커버 할 수있다. Dictyostelium의 discoideum은 사진 독성에 특히 민감하다. 이전의 연구는 광 독성을 감소 소제로서 아스코르브 산을 사용했다. 그러나, 긴 촬영 기간이 추가 보완이 필요합니다. 또, 아스코르브 산의 사용이 주목기구는 항산화 보조 식품에 의해 영향을받지 않는다 연구에 제한된다. 우리는 온도 제어 이미징 appr 대안으로 사용될 수 제안oach는 광 독성을 최소화하고 더 독성을 감소 아스코르브 산의 첨가와 조합 될 수있다. 광독성 효과는 냉각 실을 사용하여 23 ° C의 일정하고 균일 한 온도를 제공함으로써 최소화 될 수있다. 온도 조절 장치를 이용하여 묘화 셀들은 긴 시간 동안 광 독성, 휴대 라운딩 적은 징후를 나타낸다. 이것은 또한 높은 강도, 작은 시간 간격 또는 뷰 (영상 범위)의 더 필드 이미징을 할 수 있습니다. 일반 응용 프로그램 고온에서 열 스트레스가 다른 열 스트레스 반응 (14)을 트리거하기 위해 도시되었다. 따라서, 34 ℃ 이상 37 ℃로 온도를 증가시키는 것은 다른 반응을 유도 할 수있다. 적용된 온도 응력에 더하여, 특정 응력 상태의 지속 기간은 열 응력 즉각적인 응답 또는 장기 적응 학습하도록 변형 될 수있다. 일반적으로, 설명 된 프로토콜이 될 수있다응용 프로그램의 다양한 세트로 확대했다. 정확한 온도 제어는 상당히 광 독성을 감소시키기 때문에, 프로토콜은, 또는 짧은 시간 간격과 함께 낮은 발현 수준으로 단백질을 가시화 등 높은 노출 시간 및 / 또는 더 높은 여기 광 강도를 요구 설정에 사용될 수있다 시간 경과 이미징 동안 이미징, 예를 들어, 사이. 또한 전체 셀에 걸쳐 물체를 이미징하는 것이 유리할 수있다, 예를 들어, 미세 소관, 이러한 설정은 광학 Z 섹션 높은 번호를 필요로.

Dictyostelium의 discoideum은 식균 작용에 의해 촬영 박테리아 및 기타 미생물에 먹이 독방 토양 생활 아메바입니다. 그것은 그것의 발견 1 일 이후 연구의 주요 영역을했습니다 독특하고 놀라운 수명주기를 가지고있다. 다세포 개발 2과 화성 3의 분자 기준에 초기 관심은 곧 세포 운동성, 세포 극성, 선천성 면역에 초점을 맞춘 연구에 의해 보완되었다. 또한, D. discoideum는 생물 의학 연구 4,5를위한 모델 시스템으로 도입되었다. 최근에, 우리는 D. 설립 discoideum 단백질 품질 관리 (PQC) -6,7- 시스템을 연구하기위한 새로운 시스템이있다. 그 프로테옴 단백질 품질 관리 8에 도전을 제기 응집 경향 프리온과 같은 단백질이 풍부한된다. D. 여부를 조사하려면 discoideum은 매우 AG를 제어하는 특별한 분자 메커니즘을 개발했다회중하기 쉬운 프로테옴 우리는 정상적인 성장 조건 하에서 스트레스 동안 모두 응집 경향 마커 단백질의 거동을 연구 하였다. 이러한 열 응력 등의 응력 조건은, 단백질 미스 폴딩 (9)의 속도를 증가시키기 위해 사용될 수있다. 따라서, 우리는 온도 변화를 유도하고, 동시에 마커 단백질의 동작을 수행 할 수있는 시스템을 찾았다. 이를 위해, 우리는 열 단 삽입 (냉각 실)를 사용하여 펠티에 제어형 가열 라이브 세포 이미징을 조합. 이 방식은 우리가 일정하고 균일 한 온도를 유지하기 위해뿐만 아니라 신속하면서도 정확한 온도 변화를 유도 할 수 있었다. 라이브 세포 이미징 D. 생물학적 다양한 공정을 연구하는 데 사용되는 discoideum. 그러나,이 방법은 두 가지 한계에 직면 해있다. 첫째, 세포 따라서 개별 셀의 추적, 높은 운동성을 표시하고 시야에서 마이그레이션하는 경향이 종종 넓은 지역의 영상을 필요로한다. 세포 이동성 수한천 오버레이 (10)에 의해 감소 될 수 있지만, 이러한 조건으로 인해 생존의 감소로 장기 촬상에는 적합하지 않다. 둘째, D. discoideum 세포는 세포 라운딩과 유사 분열 체포 (11) 결과 사진 독성에 특히 높은 감도를 보여줍니다. 이전 프로토콜은 라디칼 스 캐빈 및 노출 시간 (12)의 감소와 같은 아스 코르 빈산을 첨가하여이 문제를 해결. 관심의 단백질이 낮은 수준으로 발현과 약한 형광 신호를 표시하는 경우 후자는 중요 할 수 있습니다. 저자는 또한 에어컨의 영상 또는 목적 및 현미경 스테이지 (12)을 포함 온도 조절 배양 상자를 사용하여 하나 21 ° C의 온도를 일정하게 제공하는 것이 좋습니다. 여기에서는 23 ℃로 설정된 냉각 실을 사용하여 개선 된 온도 제어 방법을 설명한다. 우리 셋업 촬상 동안 상당히 광 독성에 대한 저항성을 향상시킨다. 이것높은 노출 시간 및 더 높은 여기 광 강도의 사용을 허용한다. 시간 간격은 묘화 위치의 수 및 사용되는 노광 시간에 대한 균형 잡힌해야 이것은, 저속 촬상 중에 특히 중요하다. 결상 위치의 수를 증가시킬 가능성이 넓은 묘화 영역의 범위를 허용하고 더 긴 시간 동안 각 셀의 추적을 용이하게한다.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

상술 한 촬상 프로토콜 아메바 D. 응집하기 쉬운 형상의 프리온 단백질의 거동을 분석하는데 사용될 수있다 열 응력시 discoideum.도 1은 30 ° C (도 1b) 및 응력 회복 후 6 시간에서의 열 스트레스 2 시간 후 정상적인 성장 조건 (도 1A)하에 세포에서 GFP 표지 된 폴리 글루타민 단백질 Q103의 분포를 도시 정상적인 성장 조건 (그림 1C)에서 성장. 30 ° C에 23 ° C의 온도 상승시, Q103-GFP 마커 구조를 반점에 확산 분포 합체. 상온에서 스트레스 릴리스과 성장에 따라, 이러한 구조는 용해. Q103-GFP의 재분배 및 열 응력 - 유도 세포질 병소 형성 이미지 분석을 이용하여 정량화 할 수있다.도 2a는 피지 플러그인 &quot;C를 사용하여 각각의 영상 범위의 분석을 도시엘 카운터 &quot;.도 2b는 열 스트레스 반응의 정량화를 도시한다.이 계속 열 응력 수가 세포질 Q103-GFP의 초점은 증가. 열 스트레스 중에는 단백질 품질 관리 (PQC) 시스템 따라서 aggregation- 압도 것을 보여준다 이러한 프리온과 같은 단백질 Q103 같은 경향 단백질이 세포질 초점 점점 집계 가용성 상태로 유지 될 수 없다. 세포는 특징 라운딩 표시,도 1b에 도시 된 바와 같이. 응력 제거 후 세포질 병소의 감소 응집 제안 단백질 용해시킨다. 이미징 품질은 초기 셀 밀도에 민감하다. (3)도 적절한 초기 세포 밀도 (도 3A) 및 높은 초기 세포 밀도 (도 3b)을 비교하여, 응력 복구 후에 셀의 예를 도시한다. 초기 셀 밀도가 너무 높게 된 경우 셀 스타도 3b에 도시 된 바와 같이 테드 스트림을 형성한다. 세포와 이후의 정량화에 어려움을 부과하는이 초점면 밖으로 이동했다. 설명 된 방법은 전술 한 바와 같이 온도 - 유도 변화를 모니터링하는데 사용될 수있다. 또한,도 4. 생리적 성장 온도에서 묘화시 광 독성을 감소시키기 위해 사용되는 공기 조절 실에서 온도 제어없이 묘화 냉각 실 (도 4A)에서 23 ° C에서 묘화 셀과 셀 비교를 나타내고, 설정 될 수있다 25 ° C (그림 4B)에. 온도 제어 조건 묘화하지 않을 경우, 여기 광에 지속적으로 노출되면, 세포를 모아. 세포 모양의 변화는 스트레스를 나타내는한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> 그림 1 : <strong&gt; 집계가 발생하기 쉬운 프리온 같은 단백질은 열 스트레스 동안 자신의 휴대 분포를 변경합니다. GFP - 태그 폴리 글루타민이 풍부한 헌팅 엑손 1 (Q103)은 구조적으로 AX2-214 D.로 표현된다 discoideum 셀 (반전 계조 룩업 테이블에 도시 GFP 신호). 23 ° C, Q103-GFP의 정상적인 성장 조건에서 (A)이 확산 세포질에 분포한다. 30 ° C에서 열 스트레스의 2 시간 후 (B)는, Q103-GFP가 세포질 초점 (빨간색 화살표)로 합체. 세포는 특징 형상 변화를 보여 반올림. 23 ° C에서 스트레스 릴리스과 성장시 (C)는 세포질 초점 용해된다. 6시간 이후에는 세포질 초점이 관찰 될 수 없다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 그림 2 : 열 유도 세포질 병소 형성의 정량 무료 이미지 프로세싱 패키지 피지 및 플러그인 &quot;셀 카운터&quot;를 사용하여 세포의 (A) 분석.. 세포의 총량 (유형 1, 블루 이의 마커)는 시야 화상으로 결정된다. 마커는 GFP 채널 및 결정 세포질의 초점과 세포 (제 2 형, 빨간색 카운터 마커)의 수에로드됩니다. (B) 초점의 정량 30 ° C에서 열 스트레스의 3 시간, 23 ° C에서 스트레스 복구의 3 시간 후. (N =보기, 오차 막대 = SD의 4 분야) <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오이의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 그림.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt;도 3 : 장기간 경과 촬상에 세포 밀도의 영향 초기 세포 밀도 &lt;105 세포 / ㎖로 묘화 (A) 세포를 포함한다.. 30 ° C에서 열 스트레스의 3 시간, 23 ° C에서 스트레스 회복의 6 시간 후, 세포는 여전히 식물주기 분할에 남아 있습니다. 단지 몇 세포는 초점면을 종료합니다. (B) 세포 초기 세포 밀도&gt; 106 세포 / ml로 묘화. 이미징 (A에서와 같이 설정) 9 시간 후, 세포는 발달주기를 입력하고 스트리밍 집계 시작했다. 집계의 세포는 명확하게 구별 할 수 없습니다. 세포의 많은 부분은 초점면이 종료되고 분석 될 수 없다. 스케일 바 = 10 μm의. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> .JPG &quot;/&gt; 그림 4 :. 광독성 효과에 온도 제어의 효과 (A) 세포는 23 ° C에서 온도 제어와 10 분 동안 몇 군데 (0.5 μM, 샘플 두께 8 μm의 간격)보기, Z-스택, 시간 경과의 6 분야 (총 시간이 10 분 경과 한 분), GFP 채널 (0.07 msec의 노출 시간, 10 %의 레이저 강도) RFP 채널 (0.1 msec의 노출 시간, 10 %의 레이저 강도). 세포는 광독성 스트레스와 관련된 특성 형태 학적 변화의 징후를 표시하지 않습니다. (B)는 전지 (A와 동일한 조건) 온도 제어없이 10 분 동안 묘화. 세포는 스트레스를 나타내는, 광독성 유도 라운딩의 증상을 나타낸다. 스케일 바는 10 μm의 =. 세포는 100X / 1.4의 개구 수 (NA)를 가진 대물 현미경에 기초하여 시스템에 묘화 하였다. 이미지는 1 × 1 비닝을 사용하여 1024 X 1024 픽셀 파일로서 CCD 카메라로 수집 하였다.4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

단백질의 품질 관리 시스템을 공부<em&gt; D. discoideum</em&gt; 온도 제어 라이브 셀 이미징을 사용하여

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.2K 조회수.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

연구

발생학

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

배양 된 초파리 계란 챔버의 시간 경과 영화를 사용하여 로컬 세포 및 조직 저울에서 Actomyosin 역학분석

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis elegans is a well-established model organism that has been widely used in the field to study protein aggregation and toxicity. Its optical transparency enables the direct visualization of protein aggregation by fluorescence microscopy. Moreover, the fast reproductive cycle and short lifespan make the nematode a suitable model to screen for genes and molecules that modulate this process.
However, the quantification of aggregate load in living animals is poorly standardized, typically performed by manual inclusion counting under a fluorescence dissection microscope at a single time point. This approach can result in high variability between observers and limits the understanding of the aggregation process. In contrast, amyloid-like protein aggregation in vitro is routinely monitored by thioflavin T fluorescence in a highly quantitative and time-resolved fashion.
Here, an analogous method is presented for the unbiased analysis of aggregation kinetics in living C. elegans, using a high-throughput confocal microscope combined with custom-made image analysis and data fitting. The applicability of this method is demonstrated by monitoring inclusion formation of a fluorescently labeled polyglutamine (polyQ) protein in the body wall muscle cells. The image analysis workflow allows the determination of the numbers of inclusions at different timepoints, which are fitted to a mathematical model based on independent nucleation events in individual muscle cells. The method described here may prove useful to assess the effects of proteostasis factors and potential therapeutics for protein aggregation diseases in a living animal in a robust and quantitative manner.

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Here, a method is presented for the analysis of protein aggregation kinetics in the nematode Caenorhabditis elegans. Animals from an age-synchronized population are imaged at different time points, followed by semiautomated inclusion counting in CellProfiler and fitting to a mathematical model in AmyloFit.

Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

생화학

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

신경과학

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

생물학

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

자극 라만 산란 현미경을 사용한 타임랩스 라이브 셀 이미징을 위한 유연한 챔버

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...

생체공학

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

단백질의 품질 관리 시스템을 공부

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