The authors have no Acknowledgements.

1. Preparación de la célula <ol><li> Las células que crecen <ol><li> Crecer D. discoideum células en medio AX a 23 ° C bajo luz en placas de cultivo de tejidos. Evitar mantener las células a altas densidades superiores a 75% de confluencia. NOTA: Para obtener una respuesta óptima al estrés térmico, las células necesitan estar en la fase de crecimiento exponencial y no deberían haber alcanzado la fase estacionaria. </li><li> El día antes de exponer, las células se dividieron en medio de fluorescencia baja (LFM) a 1 x 10 4 células / ml. NOTA: Este paso es necesario para reducir la fluorescencia de fondo causado por el medio de AX. El tiempo de incubación puede ser reducido a un mínimo de 2 horas. Sin embargo, las vesículas se recogió en medio AX todavía puede generar un poco de señal de fondo después de 2 horas. </li></ol></li><li> Las células se preparan para la microscopía <ol><li> Antes de imágenes, las células de la cosecha de la placa en el tejido LFM y la transferencia de un número adecuado de células en placas de fondo de cristal. NOTA: Por lo general,1 x 10 5 células / ml es suficiente; Sin embargo, si la configuración experimental requiere periodos largos de formación de imágenes (más de 8 horas), el número de células necesitan ser ajustados cuidadosamente, como D. discoideum células pasará al ciclo de desarrollo y empezar a transmitir y global si el número de células son altos mientras que los nutrientes son bajos. </li><li> Permitir que las células se asienten durante 20 minutos. Eliminar las células no resueltos por la sustitución con cuidado el medio utilizado con medio fresco. </li></ol></li></ol> 2. Imaging NOTA: El protocolo se puede utilizar en sistemas de gran campo, así como en las configuraciones de microscopía confocal. El uso de una caja de incubación de temperatura controlada que cubre los objetivos y la platina del microscopio es útil, sin embargo, no es esencial para el control de la temperatura. La temperatura de la caja de incubación se ajusta a la temperatura más alta utilizada en el experimento, por ejemplo, a 40 ° C si no se realiza el estrés por calor. De lo contrario, la temperatura se establece en 256; C. Los cambios de temperatura deben hacerse con anticipación para permitir que el sistema se adapte, como los cambios de temperatura durante la exploración pueden afectar el enfoque. NOTA: Durante la formación de imágenes, la temperatura se controla mediante una cámara de enfriamiento. La temperatura predeterminada para obtener imágenes de células no estresado es de 23 ° C. Para las condiciones de estrés por calor, la temperatura se aumenta en consecuencia al nivel deseado. El elemento piezoeléctrico en la cámara de enfriamiento puede responder muy rápidamente a la cambio de temperatura. Sin embargo, el enfoque de las imágenes va a cambiar ligeramente (que puede desviarse a un máximo de 20 micras dependiendo del cambio de temperatura). Por lo tanto se requiere reorientación manual de dentro de los primeros minutos de adquisición de imágenes, a menos que el microscopio usado está equipado con un hardware de enfoque automático. <ol><li> La adquisición de imágenes en condiciones no estresadas <ol><li> celdas de imagen en condiciones sin estrés a 23 ° C, adquieren un mínimo de 6 campos de visión (FOV). NOTA: condición no el estrés puede ser visualized mediante la grabación de un corto lapso de tiempo (5-30 min) o la adquisición de imágenes fijas representativas. Para cada línea celular condición o adquirir un mínimo de 6 campos de visión (FOV). NOTA: En el caso de las células individuales son de interés, la posición de las respectivas células en el medio de la FOV y grabar una serie de baldosas 3 x 3 con el campo de visión que contiene las células de interés en el medio D.. discoideum células son móviles y pueden migrar fuera del campo de visión. Sin embargo, la serie de baldosas de 3 x 3 aumenta el área potencialmente explorado por la célula de interés y sigue siendo detectable por períodos de lapso de tiempo de ~ 6 horas. </li><li> Adquirir z-pilas de máximo 7 micras de 1-0.25 m pasos para capturar todo el volumen de la célula. </li><li> Adquirir una imagen de referencia de campo claro para evaluar el número total de células. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes de estrés por calor <ol><li> Ajustar la temperatura de la cámara de enfriamiento a 30 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. &lt;/ Li&gt; <li> Después de la exhibición de la temperatura ha alcanzado el valor deseado, vuelva a enfocar manualmente en el canal de campo claro y se les presentarán todas las FOV registrados antes de iniciar el lapso de tiempo. </li><li> Iniciar un lapso de tiempo de 4 horas de estrés por calor con un intervalo de tiempo de 5-10 minutos entre los puntos de tiempo. Compruebe el correcto enfoque durante la adquisición de los dos primeros puntos de tiempo. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes durante la recuperación <ol><li> Después de estrés por calor, reducir la temperatura de nuevo a 23 ° C, esperar a que el indicador de temperatura para ajustar y reorientar manualmente. </li><li> Grabar películas a intervalos en la fase de recuperación de 8-10 horas en intervalos de tiempo de 10-20 min. Compruebe el correcto enfoque durante la adquisición del primer punto de tiempo. </li></ol></li></ol> Análisis 3. Imagen NOTA: Para cuantificar el número de células que albergan focos citosólica, evaluar el número total de células y el número de células con focos citosólica en cada momentomarco. Debido a la dificultad de la segmentación de las células a partir de imágenes de campo claro, la cuantificación que hay que hacer manualmente. En lo que sigue, se describe el análisis de datos para el paquete libre de procesamiento de imagen ((http://fiji.sc/Fiji). Se requiere el plugin &quot;Cell Counter&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Evaluar número total de células <ol><li> Cargar la pila brillante imagen de campo (XYT) haciendo clic en &quot;Archivo&quot; y &quot;Abrir&quot;. </li><li> Abra el &quot;Cell Counter&quot; plug-in ( &quot;plugins&quot; - &quot;Cell Counter&quot;). Cargar la pila de la imagen haciendo clic en &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Elegir el tipo adecuado de contadores, marcando la casilla correspondiente. NOTA: El uso de tipo 1 como contador para el número total de células y tipo 2 como contador de células con focos citosólica. Contar todas las células. </li><li> Guardar los marcadores haciendo clic en &quot;Guardar&quot; marcadores. </li></ol></li><li> Evaluar el número de células con focos citosólica <ol> &lt;li&gt; Carga la HyperStack imagen de fluorescencia (XZYT) ( &quot;Archivo&quot; - &quot;Open&quot;) y hacer una proyección de intensidad máxima con el &quot;Z-proyector&quot; (Imagen / Pilas). </li><li> Abrir el plugin &quot;Cell Counter&quot;. Cargar la pila de la imagen resultante (XYT) haciendo clic en &quot;Inicializar&quot;. </li><li> Cargar los marcadores haciendo clic en &quot;Marcadores de carga&quot;. PRECAUCIÓN: Los nombres de archivo de la imagen de referencia y la pila de fluorescencia deben ser idénticos. Si es necesario, cambiar el nombre en consecuencia antes de inicializar la pila de imágenes. </li><li> Elegir el tipo de marcador apropiado (véase 3.1.3) y contar las células con focos citosólica. Los marcadores existentes se pueden utilizar como guía para la posición de las células individuales. </li><li> Recuperar el número de cuentas por rebanada haciendo clic en &quot;Resultados&quot; y guardar los recuentos en otro lugar para otros cálculos. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

El protocolo descrito aquí se puede utilizar para estudiar el comportamiento de una proteína particular de interés en respuesta al estrés inducida por calor. Aumento de la temperatura a 30 ° C ha sido reportado para desencadenar la respuesta de estrés de calor y bajo estas condiciones, la viabilidad de D. discoideum se reduce notablemente. modificaciones El protocolo puede ser modificado para comparar el comportamiento de diferentes proteínas en las mismas condiciones de estrés. Para esto, las células que expresan diferentes proteínas con la misma etiqueta fluorescente se transfieren en placas de múltiples pocillos, tal como cuatro platos de cámara (sección 1.3.1). El protocolo también se puede aplicar sobre las células proteínas con diferentes marcadores, tales como GFP o RFP co-expresan. Esto puede ser por ejemplo utilizado para monitorear el comportamiento de los diferentes componentes del sistema de control de calidad de la proteína (PQC). Las células que expresan el marcador agregación BPA de etiquetado y diferentes componentes PCQ RFP-etiquetados se pueden observar utilizando múltiples pocillosen forma de plato para la imagen. Esto asegura las mismas condiciones de estrés (velocidad de aumento de la temperatura / disminución, la duración de la temperatura de aumento / disminución) y permite estudios comparativos. Además, el protocolo se puede utilizar para estudiar la influencia del sistema de PQC en la respuesta al estrés de calor. La actividad de los componentes puede ser modulado por cambios en los niveles de expresión utilizando herramientas genéticas tales como knock-out o sobreexpresión o mediante el uso de inhibidores específicos disponibles en el mercado 6. El proteasoma puede ser inhibida por la adición de MG132 (100 M) o lactacistina (10 M) al medio de crecimiento. La chaperona Hsp90 puede ser inhibida usando geldanamicina (6 M) o radicicol (10 M). La chaperona Hsp70 puede inhibirse con VER-155 088, aunque no pudimos confirmar la eficacia de la inhibición en nuestras condiciones experimentales hasta ahora. Los inhibidores se deben añadir un día antes de formación de imágenes y las células se incuban durante 14 hr. Criti<html> Cal pasos dentro del Protocolo El paso crítico para la evaluación de la perturbación inducida por calor es el estado de las células antes del experimento de formación de imágenes. Los estudios en levadura mostraron que las células adquieren resistencia a una variedad de problemas ambientales durante la fase estacionaria 13. También se observó la capacidad de respuesta mínima al estrés térmico aplicado si D. discoideum células habían alcanzado la fase estacionaria antes de la imagen. Por lo tanto, el mantenimiento de un número constante de celda &lt;5 x 10 5 células / ml es crítica. Por otra parte, el número de células altas pueden inducir la transición del ciclo vegetativo de D. discoideum con el ciclo de desarrollo, lo que desencadena vías de hambre, lo que podría dar lugar a una respuesta diferente al estrés por calor. Si se alcanzan altos números de células en la fase de recuperación después de estrés por calor, streaming y células de agregación pueden interferir con el análisis de datos como las células se mueven fuera de foco (véase la Figura 4). contenido &quot;&gt; limitación de la técnica La pérdida de enfoque es el cuello de botella del protocolo. Durante los cambios de temperatura, el plano focal puede cambiar drásticamente, lo que requiere reorientación manual en un período de tiempo inmediatamente después de cambiar la temperatura. El salto en el enfoque a veces puede ser demasiado extrema para ser vencido por el enfoque automático de software, especialmente si el tiempo entre los puntos de tiempo es alta. Sin embargo, si el microscopio usado está equipado con un enfoque automático hardware, este cuello de botella puede ser evitado. Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes En comparación con las configuraciones existentes, tales como el uso de habitaciones con aire acondicionado, cajas de incubación a temperatura controlada relativas a los objetivos y las etapas platina del microscopio o con control de temperatura y collares objetivos, el uso de una cámara de enfriamiento proporciona un control más preciso del ambiente temperatura. El elemento Peltier en la cámara de refrigeración puede mantener una tem constante y uniformetura a lo largo de la configuración experimental. En configuraciones clásicas, las diferencias de temperatura locales podrían dar lugar a resultados diferentes de observación. Además, se puede responder de forma rápida y rápidamente a los cambios inducidos en la temperatura, mientras que las configuraciones clásicas se adaptan muy lentamente a los cambios inducidos por la temperatura, especialmente la reducción de la temperatura. El elemento Peltier en la cámara de enfriamiento también puede cubrir una gama más amplia de temperatura (15-40 ° C) que las configuraciones clásicas, con el que las temperaturas que alcanzan tales como 15 ° C o 40 ° C es muy difícil. Dictyostelium discoideum es particularmente sensible a la foto-toxicidad. Estudios previos han usado ascorbato como eliminador para reducir la fototoxicidad. Sin embargo, los períodos de formación de imágenes largas requieren suplementos adicionales. Por otra parte, el uso de ascorbato se limita a estudios en los que el mecanismo de interés no se ve afectada por el suplemento antioxidante. Proponemos que la imagen de temperatura controlada se puede utilizar como una alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidad y se podría combinar con la adición de ascorbato para disminuir aún más la toxicidad. efectos fototóxicas pueden minimizarse proporcionando una temperatura constante y uniforme de 23 ° C usando una cámara de enfriamiento. Las células imágenes utilizando el control de temperatura muestran menos signos de foto-toxicidad, tal redondeo celular, por un período de tiempo más largo. Esto también permite obtener imágenes con intensidades más altas, intervalos de tiempo más cortos o más campos de visión (FOV). Aplicacion General El estrés por calor a temperaturas más altas se ha demostrado para desencadenar una respuesta de estrés diferente de calor 14. Por lo tanto, aumentando la temperatura hasta 34 ° C o 37 ° C podría inducir una respuesta diferente. Además del estrés temperatura aplicada, la duración de una situación de estrés en particular puede ser modificado para estudiar la respuesta inmediata o adaptación a largo plazo al estrés por calor. En general, el protocolo descrito puede serexpandido a una amplia gama de aplicaciones. Dado que el control preciso de la temperatura reduce considerablemente efectos de foto-tóxico, el protocolo se puede utilizar en entornos que requieren altos tiempos de exposición y / o intensidades de luz de excitación más altos, por ejemplo, para la visualización de las proteínas con un bajo nivel de expresión, o en combinación con intervalos de tiempo cortos entre las imágenes, por ejemplo, cuando se toman imágenes de lapso de tiempo. También puede ser ventajoso para obtener imágenes de objetos que abarcan toda la célula, por ejemplo, los microtúbulos, ya que estos ajustes requieren un alto número de z secciones ópticas.

Dictyostelium discoideum amebas son solitarios la vida del suelo que se alimentan de bacterias y otros microorganismos, que son absorbidos por fagocitosis. Tiene un ciclo de vida única y singular que ha sido un área importante de la investigación desde su descubrimiento 1. El interés en el desarrollo temprano multicelular 2 y la base molecular de la quimiotaxis 3 pronto se complementa con estudios centrados en la motilidad celular, la polaridad celular, la inmunidad innata. Además, D. discoideum se introdujo como un sistema modelo para la investigación biomédica 4,5. Recientemente, hemos establecido D. discoideum como un nuevo sistema para estudiar el sistema de control de 6,7 calidad de la proteína (PQC). Su proteoma está enriquecida en proteínas priónicas-como agregación propensos, lo que plantea un reto al control de calidad de las proteínas 8. Para investigar si D. discoideum ha desarrollado mecanismos moleculares especiales para controlar su muy agproteoma congregación propensas, se estudió el comportamiento de las proteínas marcadoras agregación propensos tanto en condiciones de crecimiento normales y durante el estrés. Condiciones de estrés, tales como el estrés por calor, se pueden utilizar para aumentar la tasa de proteínas misfolding 9. Por lo tanto, se buscó un sistema en el que podríamos inducir cambios de temperatura y al mismo tiempo seguir el comportamiento de las proteínas marcadoras. Para este propósito, se combinaron imágenes de células vivas con calefacción controlada por sistema Peltier utilizando una (cámara de enfriamiento) inserto etapa térmica. Este método nos permitió mantener una temperatura constante y uniforme, así como para inducir un cambio rápido, pero precisa de la temperatura. Imágenes de células vivas se utiliza para estudiar una variedad de procesos biológicos en D. discoideum. Sin embargo, este enfoque se enfrenta a dos limitaciones importantes. En primer lugar, las células muestran un alto motilidad y tienden a migrar fuera del campo de visión, el seguimiento tanto de las células individuales a menudo requiere de formación de imágenes de un área grande. La movilidad celular puedereducirse en agar de recubrimiento 10, sin embargo, estas condiciones no son adecuadas para formación de imágenes a largo plazo debido a una disminución de la viabilidad. En segundo lugar, D. discoideum células muestran una particularmente alta sensibilidad a la foto-toxicidad, lo que resulta en el redondeo celular y detención mitótica 11. Protocolos anteriores abordan este problema mediante la adición de ascorbato como un eliminador de radicales y reducción de los tiempos de exposición 12. Este último puede ser crítica si la proteína de interés se expresa en niveles bajos y muestra una señal de fluorescencia débil. Los autores también sugieren para proporcionar una temperatura constante de 21 ° C, ya sea por formación de imágenes en una habitación con aire acondicionado o mediante el uso de cajas de incubación a temperatura controlada, que cubren la etapa objetiva y microscopio 12. A continuación, describimos un método con control de temperatura mejorado mediante el uso de una cámara de enfriamiento ajustado a 23 ° C. Durante una imagen nuestra puesta a punto mejora significativamente la resistencia a la fototoxicidad. Esopermite el uso de los tiempos de exposición superiores e intensidades de luz de excitación más altos. Esto es de particular importancia cuando se toman imágenes de lapso de tiempo, ya que los intervalos de tiempo tienen que ser sopesado frente a la cantidad de puestos fotografiados y el tiempo de exposición utilizado. La posibilidad de aumentar el número de posiciones fotografiadas también permite la cobertura de un área de imagen más ancho y facilita el seguimiento de las células individuales en un periodo de tiempo más largo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AX Medium</td>
			<td style="width:85px;">ForMedium</td>
			<td style="width:119px;">AXM0102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LoFlo medium</td>
			<td>ForMedium</td>
			<td>LF1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MG132</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lactacystin</td>
			<td style="width:85px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L6785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Geldanamycin</td>
			<td style="width:85px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-200617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Radicicol</td>
			<td style="width:85px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-200620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MatTek disch 35 mm</td>
			<td style="width:85px;">MatTek corporation</td>
			<td style="width:119px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>glass bottom imaging dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CellViell cell culture dish</td>
			<td style="width:85px;">Greiner</td>
			<td align="right" style="width:119px;">627870</td>
			<td>4-compartments glass bottom imaging dish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td>
			<td style="width:85px;">Warner Istruments</td>
			<td style="width:119px;">TB-3/CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:85px;">Warner Istruments</td>
			<td style="width:119px;">CL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid cooling System</td>
			<td style="width:85px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;">LCS-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

El protocolo de formación de imágenes descrito se puede utilizar para analizar el comportamiento de las proteínas priónicas como agregación propensos en la ameba D. discoideum durante el estrés por calor. La Figura 1 muestra la distribución de poliglutamina Q103 proteína GFP-etiquetado en las células en condiciones de crecimiento normales (Figura 1A), después de 2 horas de estrés por calor a 30 ° C (Figura 1B) y después de 6 horas de recuperación estrés y crecimiento en condiciones de crecimiento normales (Figura 1C). Al aumento de la temperatura desde 23 ° C a 30 ° C, el marcador Q103-GFP se une de una distribución difusa a punctata estructuras. Tras la liberación del estrés y el crecimiento a temperatura normal, estas estructuras se disuelven. La redistribución de Q103-GFP y la formación de estrés inducido por calor focos citosólica se pueden cuantificar usando análisis de imágenes. La figura 2A muestra el análisis de FOV individuales utilizando Fiji y el plugin &quot;Cell mostrador &quot;. La figura 2B muestra la cuantificación de la respuesta al estrés de calor. Esto demuestra que el aumento de focos Q103-GFP citosólico en serie con la continuación de estrés por calor. Durante el estrés por calor, el sistema (CMC) de control de calidad de la proteína es abrumado, por tanto, agregación- proteínas propensas como el Q103 proteína prión-como no se pueden mantener en un estado soluble y cada vez agregada en focos citosólica. las células también muestran un redondeo característica, como se muestra en la Figura 1B. la reducción de focos citosólica después de la eliminación del estrés sugiere que el agregado proteínas se disuelven. La calidad de la imagen es sensible a la densidad celular inicial. Figura 3 muestra un ejemplo de las células después de la recuperación de estrés, la comparación de la densidad adecuada inicial de células (Figura 3A) y la densidad celular inicial alta (Figura 3B). Si la densidad celular inicial era demasiado alto, las células estrellated para formar corrientes como se muestra en la Figura 3b. Este que impone dificultades en la posterior cuantificación medida que las células se han trasladado fuera del plano focal. El método descrito se puede utilizar para controlar los cambios inducidos por la temperatura como se describe anteriormente. También se puede utilizar para reducir la foto-toxicidad cuando la formación de imágenes a temperatura crecimiento fisiológico. Figura 4 muestra una comparación de células fotografiado a 23 ° C en una cámara (Figura 4A) enfriar y células fotografiado sin control de temperatura en una habitación con aire acondicionado, establece a 25 ° C (Figura 4B). Tras la exposición constante a la luz de excitación, las células completan cuando no está reflejado en las condiciones de temperatura controlada. Este cambio en la forma de la célula es lo que indica el estrés. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Figura 1: <strong&gt; proteínas priónicas-como agregación propensos a cambiar su distribución celular durante el estrés por calor. GFP-etiquetados poliglutamina ricos huntingtina exón 1 (Q103) se expresa constitutivamente en AX2-214 D. discoideum células (señal de GFP se muestra en la tabla de búsqueda de escala de grises invertida). (A) En condiciones normales de crecimiento a 23 ° C, Q103-GFP se distribuye de manera difusa en el citoplasma. (B) Después de 2 horas de estrés por calor a 30 ° C, Q103-GFP se une en focos citosólica (flechas rojas). Las células muestran un cambio de forma característica y completan. (C) Después de la liberación del estrés y el crecimiento a 23 ° C, los focos citosólica se disuelven. Después de 6 horas, se puede observar no focos citosólica. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 2: Cuantificación de la formación de focos citosólico inducida por calor (A) Análisis de las células utilizando el paquete de procesamiento de imágenes libre de Fiji y el &quot;Cell Counter&quot; plug-in.. La cantidad total de células (tipo 1, marcadores contador azul) se determina la imagen de campo claro en. Los marcadores son cargados en el GFP-canal y el número de células con focos citosólica (tipo 2, los marcadores de contador rojo) se determina. (B) Cuantificación de los focos después de 3 h de estrés por calor a 30 ° C y 3 horas de recuperación de estrés a 23 ° C (n = 4 campos de visión, el error bar = SD). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figura 3: Efecto de la densidad celular en las imágenes de lapso de tiempo a largo plazo Las células (A) fotografiados en densidades celulares iniciales &lt;10 5 células / ml.. Después de 3 horas de estrés por calor a 30 ° C y 6 h de recuperación de la tensión a 23 ° C, las células todavía permanecen en el ciclo vegetativo y se dividen. Sólo pocas células salen del plano focal. (B) Las células de captación de imagen a densidades celulares iniciales&gt; 10 6 células / ml. Después de 9 horas de formación de imágenes (ajustes como en a), las células han entrado en el ciclo de desarrollo y comenzó el streaming y la agregación. Las células en los agregados no pueden distinguirse claramente. Una gran parte de las células sale del plano focal y no puede ser analizada. Barra de escala = 10 micras. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Figura 4:. Efecto de control de la temperatura sobre los efectos fototóxicas células (A) de captación de imagen para 10 min con control de temperatura a 23 ° C: 6 campos de visión, z-stack (espaciado de 0,5 M, espesor de la muestra 8 M), lapso de tiempo (en total tiempo 10 min, lapso de 1 min), el canal de GFP (0,07 mseg tiempo de exposición, 10% la intensidad del láser), el canal de RFP (0,1 mseg tiempo de exposición, la intensidad del láser 10%). Las células no muestran signos de los cambios morfológicos característicos asociados con el estrés fototóxico. (B) Las células de captación de imagen para 10 min sin control de temperatura (mismas condiciones que en A). Las células presentan signos de fototoxicidad inducida por redondeo, lo que indica el estrés. Barra de escala = 10 micras. Las células fueron imágenes en un sistema basado en un microscopio con un objetivo 100x / 1,4 apertura numérica (NA). Las imágenes fueron recolectados con una cámara CCD como 1.024 x 1.024 píxeles, utilizando los archivos de 1 x 1 hurgar en la basura.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.1K vistas.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Video: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Investigación

Biología

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1. This guided cell migration is referred as chemotaxis, which is essential for various cells to carry out their functions such as trafficking of immune cells and patterning of neuronal cells 2, 3. A large family of G-protein coupled receptors (GPCRs) detects variable small peptides, known as chemokines, to direct cell migration in vivo 4. The final goal of chemotaxis research is to understand how a GPCR machinery senses chemokine gradients and controls signaling events leading to chemotaxis. To this end, we use imaging techniques to monitor, in real time, spatiotemporal concentrations of chemoattractants, cell movement in a gradient of chemoattractant, GPCR mediated activation of heterotrimeric G-protein, and intracellular signaling events involved in chemotaxis of eukaryotic cells 5-8. The simple eukaryotic organism, Dictyostelium discoideum, displays chemotaxic behaviors that are similar to those of leukocytes, and D. discoideum is a key model system for studying eukaryotic chemotaxis. As free-living amoebae, D. discoideum cells divide in rich medium. Upon starvation, cells enter a developmental program in which they aggregate through cAMP-mediated chemotaxis to form multicullular structures. Many components involved in chemotaxis to cAMP have been identified in D. discoideum. The binding of cAMP to a GPCR (cAR1) induces dissociation of heterotrimeric G-proteins into G&gamma; and G&beta;&gamma; subunits 7, 9, 10. G&beta;&gamma; subunits activate Ras, which in turn activates PI3K, converting PIP2 into PIP3 on the cell membrane 11-13. PIP3 serve as binding sites for proteins with pleckstrin Homology (PH) domains, thus recruiting these proteins to the membrane 14, 15. Activation of cAR1 receptors also controls the membrane associations of PTEN, which dephosphorylates PIP3 to PIP2 16, 17. The molecular mechanisms are evolutionarily conserved in chemokine GPCR-mediated chemotaxis of human cells such as neutrophils 18. We present following methods for studying chemotaxis of D. discoideum cells. 1. Preparation of chemotactic component cells. 2. Imaging chemotaxis of cells in a cAMP gradient. 3. Monitoring a GPCR induced activation of heterotrimeric G-protein in single live cells. 4. Imaging chemoattractant-triggered dynamic PIP3 responses in single live cells in real time. Our developed imaging methods can be applied to study chemotaxis of human leukocytes.

Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Here, we describe detailed live cell imaging methods for investigating chemotaxis. We present fluorescence microscopic methods to monitor spatiotemporal dynamics of signaling events in migrating cells. Measurement of signaling events permits us to further understand how a GPCR-signaling network achieves gradient sensing of chemoattractants and controls directional migration of eukaryotic cells.

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

Ensayo de absorción de colesterol LDL utilizando celular directo imágenes análisis con células control de salud

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...