Name: reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets at JoVE.com

We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

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The authors declare that they have no competing financial interests.

I metodi descritti sforzi qui presenti recenti per ricostituire fusi mitotici di base in acqua-in-olio di goccioline di emulsione. Studiando l&#39;assemblaggio del fuso all&#39;interno dei confini geometrici offre numerosi vantaggi. meccanismi importanti di feedback esistono tra microtubuli del fuso mitotico ei vincoli geometrici in cui sono assemblati. I microtubuli possono generare forze di spinta quando crescono in confini geometrici, che può risultare in spostamento fuso mitotico. Inoltre, cresce in una barriera fisica può indurre catastrofi microtubuli. Inoltre, del fuso entro una geometria confinato può portare ad un progressivo esaurimento delle singole componenti, come tubulina, che a sua volta influisce direttamente sulla velocità di crescita dei microtubuli 36. Questi sono tutti fattori determinanti essenziali di assemblaggio del fuso, che possono essere studiati utilizzando i saggi descritti qui. I saggi descritti sono molto sensibili alla piccola differe concentrazioneNCEs dei componenti di una goccia. Questo è il caso per la tubulina, in cui le differenze di concentrazione minori possono risultare in crescita troppo lento o troppo rapido microtubuli. In questo caso, i tassi di crescita microtubuli spesso possono ancora essere corrette regolando la temperatura durante il primo ~ 30 min dell&#39;esperimento. del fuso mitotico e posizionamento è anche molto sensibile alle variazioni della concentrazione di generatori (corticale) di forza. Questo è probabilmente dipende dalla concentrazione, la purezza e l&#39;attività dei componenti purificati e deve essere titolato con attenzione per ogni nuova proteina purificata. Inoltre, alcuni compromessi devono essere effettuate in ambienti di imaging, a seconda della natura del saggio. Inizialmente, alti livelli di dimeri di tubulina fluorescenti solubili rendono difficile immagine singoli microtubuli. Come microtubuli si allungano e tubulina solubile è esaurito lentamente, il rapporto segnale-rumore diventa gradualmente più elevata e permette l&#39;imaging del individuAl microtubuli. In contrasto con configurazioni con sistemi aperti, il confinamento geometrico impedisce lo scambio di molecole fluorescenti e componenti di sistema assorbitore di ossigeno all&#39;interno di un serbatoio di massa, con conseguente sbiancamento significativo. Soprattutto per monitorare assemblaggio del fuso e posizionamento nel tempo, si richiede di immagine con basse intensità di luce, anche in presenza di un potente sistema di ossigeno scavenger. Questi metodi consentono la ricostituzione bottom-up di semplificate strutture mandrino simili in vitro. Oltre ai componenti introdotti qui, molti altri fattori sono stati descritti da influenzare la formazione bipolare mandrino, posizionamento, orientamento, sagomatura, ecc 3. Questo sistema può essere ulteriormente ampliato per studiare gli effetti individuali e combinati di generatori di forza aggiuntivi. contributori importanti per la formazione del fuso che sono attualmente assente da questo sistema sono i cromosomi mitotici. cromatina mitotico ha dimostrato diformazione diretta mandrino (1) chromokinesins che possono generare la cosiddetta &#39;forze polari-espulsione&#39; 3, (2) la formazione di un gradiente RanGTP dalla cromatina-bound RanGEF RCC1 38, (3) cinetocori che possono interagire con (depolimerizzante ) microtubuli 39 e (4) la cromatina stessa, che può funzionare come una molla meccanica in-tra microtubuli opposte 40. Infine, il sistema descritto fornisce attualmente limitato controllo temporale e spaziale sull&#39;attività e localizzazione di forza generatori introdotte. Nelle cellule, molti fattori di assemblaggio del fuso localizzano a compartimenti specifici o sono attivi all&#39;interno di una finestra temporale limitata. Un esempio lampante è l&#39;attività di dineina, che è specificamente arricchito sul lato posteriore del C. elegans una cellula embrionale per promuovere il posizionamento del mandrino asimmetrica e la divisione cellulare. In questo sistema, stiamo esplorando la possibilità di imitare tale tattività utilizzando metodi emporal e asimmetrici presi in prestito dalle tecniche opto-genetiche. Inoltre, come è il caso per la C. elegans embrione e cellule con una parete cellulare rigida, molte cellule non completano in mitosi. La forma del confinamento geometrica avrà un impatto fondamentale sulle forze che agiscono sul mandrino 41. Sarà quindi importante ricostituire assemblaggio del mandrino e posizionamento nelle goccioline non sferiche e, potenzialmente utilizzando sistemi microfluidici più complessi che permettono di plasmare e la memorizzazione di emulsione di goccioline di 42,43. Infine, nei tessuti, cellula-cellula e cellula-segnalazione substrato e attaccamento forniscono stimoli esterni che possono essere tradotti in orientamento del mandrino diretto, come spesso osservato in cellule epiteliali e le cellule staminali. Tutti questi aspetti specialistici non sono stati presi in considerazione in questo studio e potrebbe fornire le sfide del futuro per costruire verso più in vivo -come ricostruzioni di mitotico assemb mandrinoly e posizionamento.

Durante la mitosi, i cromosomi del genoma replicato sono organizzati all&#39;equatore cella per garantire la parità di distribuzione di cromatidi fratelli negli cellule figlie di nuova formazione. il posizionamento e la segregazione dei cromosomi è mediato da loro attaccamento ai microtubuli del fuso provenienti da due centrosomi opposte. Oltre a garantire la distribuzione cromosomica fedeli, l&#39;orientamento del fuso mitotico detta anche il piano divisione cellulare 1. Orientamento coordinato di divisione cellulare è essenziale durante molte fasi di sviluppo e per il tessuto omeostasi 2. In particolare, regolata posizionamento fuso mitotico può comportare la distribuzione asimmetrica del contenuto cellulare o anche produrre cellule figlie di diverse dimensioni 2. Assemblaggio del fuso mitotico e l&#39;orientamento inizia in profase e è orchestrato da una complessa interazione tra cooperazione e inimicarsi forza-generatori 3,4. Le forze generate consistono btirando e spingendo le forze di OTH. Queste forze provengono sia dai contatti mandrino con la corteccia cellule così come all&#39;interno del mandrino, e possono essere generati da dinamica dei microtubuli e da motori molecolari e reticolanti (Figura 1). spinte possono essere generati quando microtubuli crescono contro strutture rigide come la corteccia cellulare. A seconda della forza resistente totale generato all&#39;interno del sistema, questo può portare a riposizionamento del fuso mitotico (forze inferiori) o innescare instabilità microtubuli o catastrofi (elevate forze) 5-8. La quantità di forza che può essere generato premendo dipende dalla lunghezza dei microtubuli, poiché la lunghezza è un forte determinante di microtubuli buckling 9. Inoltre, microtubuli che hanno origine da uno dei centrosomi possono spingere contro l&#39;altro centrosoma, un meccanismo che è stato suggerito di guidare la separazione centrosome nei primi mesi del profase 3,10. in annunciocondizione per spingere le forze generate da microtubuli in crescita, microtubuli che tocca la corteccia cellula può anche mediare forze di trazione 11. Studi di molteplici laboratori hanno mostrato che l&#39;attività controllata di generatori di forza corticali è necessaria per il posizionamento asimmetrico dei fusi mitotici in vivo 1. Essenziale per queste forze di trazione è Cortex-localizzato dynein citoplasmatica (di seguito denominato &#39;dynein&#39;), un meno-end microtubuli diretto proteine ​​motore 8,12,13. Ad esempio, in il lievito, interazioni laterali di dynein corticale con il risultato lattice microtubuli in microtubuli base al motore scorrevole lungo la corteccia 14. Tuttavia, le forze di trazione corticali possono essere generati anche dalla capacità di dynein di formare raccordi di estremità-a depolimerizzante microtubuli 8. L&#39;energia generata dal restringimento microtubuli può portare a forze che sono generalmente di un ordine di grandezza superiore (~ 50 pN (riferimento 15 </sup&gt;)) che le forze generate dai singoli proteine ​​motrici (~ 7-8 pN (rif. 16)). Attaccamento Fine-in di dynein corticale ai microtubuli depolimerizzante promuove posizionamento del mandrino in erba lievito 17 e C. elegans 13. Sia che sia in base al motore scorrevole e microtubuli depolimerizzazione guidato forze di trazione corticali possono cooperare o si escludono a vicenda in vivo è attualmente sconosciuto. Oltre a spinta forze microtubuli e forze di trazione corticali dynein-mediata, posizionamento centrosoma è controllata all&#39;interno del fuso mitotico da numerose altre proteine. Kinesin-5 motori, ad esempio, esistono come tetrameri che può reticolare antiparalleli microtubuli interpolari, con conseguente generazione di forze di scorrimento verso l&#39;esterno 18-20. I membri della famiglia del motore chinesina-5 sono necessari per la separazione centrosome e montaggio fuso bipolare in tutti gli eucarioti studiati, con l&#39;eccezione di C. elegans<html> (recensito in riferimento 21). Inoltre, sono anche noti diffusibili reticolanti della famiglia / PRC1 Ase1 localizzare per sovrapposizione delle regioni microtubuli di microtubuli interpolari in vivo e in vitro 22-27. Le forze generate dalla espansione Ase1-driven del microtubulo-regione di sovrapposizione sono grandi abbastanza per controbilanciare kinesin-14 delle forze di scorrimento in vitro mediata 28,29. Nelle cellule, Ase1 / PRC1 è necessario per la formazione stabile di sovrapposizione regioni microtubuli nella zona mediana del mandrino 25-27,30, il che suggerisce che le forze generate da diffusibili reticolanti possono contribuire in modo significativo alla organizzazione del mandrino. Infine, le forze della cromatina mitotico e cinetocori influenzano assemblaggio del fuso mitotico e il posizionamento attraverso vari percorsi 3. Dal momento che questi componenti non sono parte dei saggi ricostituzione qui descritte, non saranno discussi in dettaglio. jove_content &quot;&gt; Diverse teorie esistono su come le diverse componenti molecolari e forze sopra descritte cooperano nel montaggio e posizionamento del mandrino, ma siamo ancora lontani da una comprensione quantitativa. Oltre a esperimenti nelle cellule viventi, gli esperimenti in vitro con componenti purificati forniscono un potente percorso per aiutare raggiungere questo obiettivo. presentiamo qui una guida visiva per una versione adattata ed estesa dei metodi pubblicati recentemente (Roth et al. 31), in cui mandrini base sono ricostituiti in acqua-in-olio di goccioline di emulsione, iniziando con un numero minimo di componenti. Utilizzando tecniche di microfluidica, goccioline sferiche vengono generati con i formati che sono paragonabili alle cellule in mitosi. All&#39;interno di queste goccioline, centrosomi purificati e tubulina possono essere combinati al fine di studiare la dinamica aster microtubuli, forzare le interazioni generazione e Aster-Aster. di introducendo corticali (come dineina) e inter-polari (come ad esempio kinesin-5 / Ase1) forza-generatori, abbiamoricostituire strutture sempre più complesse mandrino-like che iniziano ad assomigliare alla situazione in vivo.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Preparation of microfluidic chips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Photomask on film substrate)</td><td>Selba S.A. Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &amp;lt;1-0-0&gt;10-20 &amp;Omega;-cm, 500-550 &amp;mu;m, SSP, with 2 flats)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater&amp;nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Electro-technic products</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Microfluidic setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipets</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Kartell</td><td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, thickness 1.5</td></tr><tr><td>Glass-slides</td><td></td><td></td><td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Puncher</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory sealing film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td><td></td><td></td><td>Home made</td></tr><tr><td>Brightfield Microscope</td><td>Leica</td><td>PMIRB&amp;nbsp;</td><td>Any inverted brightfield would suffice</td></tr><tr><td>Pressure controler</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td><td>VWR, The Netherlands</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Reconstituting spindle formation and positioning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-dithioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosine-&#039;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&amp;kappa;-casein (&amp;kappa;-casein from bovine serum milk)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. Introducing spindle-assembly factors&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosine-&#039;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &amp;ge;97% (enzymatic))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

I metodi presentati nelle sezioni precedenti permettono la ricostituzione di strutture mandrino-come al crescere della complessità utilizzando il confinamento geometrico di acqua-in-olio di goccioline di emulsione. Questa sezione descrive i risultati rappresentativi che qualitativamente dimostrare la capacità di questi test. Durante la mitosi, quando il fuso bipolare è assemblato, cellule completano a formare sfere con un diametro di circa 15 micron, come misurato per le cellule umane. Questa caratteristica forma cellulare mitotico fornisce un confine geometrico che sia limita e dirige le dimensioni del mandrino e l&#39;orientamento 35,36. Tecniche di microfluidica, forniscono un livello di confinamento geometrica che ricorda con precisione la situazione osservata nelle cellule viventi, e quindi permette la ricostruzione bottom-up di mandrini mitotico in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-Pagina = &quot;1&quot;&gt; astri di microtubuli sono di per sé già in grado di comportamento complesso quando la crescita dei microtubuli è limitato da confini geometrici. Come microtubuli crescono, forze che spingono generate dalla incorporazione di nuovi dimeri di tubulina guidano i due centrosomi a lati opposti delle goccioline di emulsione. Dapprima, centrosomes liberamente diffondono all&#39;interno del volume confinato (Figura 4a, pannello di sinistra). Dopo circa 20-30 minuti, i primi microtubuli diventano visibili diffusione e centrosome diventa limitato come microtubuli crescono contro la corteccia in tutte le direzioni. Asters con microtubuli di lunghezza intermedia (circa il 50% del diametro delle gocce) possono (stericamente) respingono un&#39;altra, con microtubuli spingendo contro l&#39;altro, gli altri centrosomi e la corteccia. Ciò si traduce in una tipica disposizione mandrino come &#39;bipolare&#39; con i due centrosomes opposti tra loro (figura 4a, pannello centrale). Quando microtubuli crescono più di ~ 50% della goccia-diametro, i centrosomi ottenere spinto ulteriormente al opposti confini della gocciolina, con microtubuli che crescono lungo la corteccia delle gocce (Figura 4a, pannello di destra). È importante notare che i tassi di crescita dei microtubuli in questi test sono molto sensibili alla temperatura e tubulina concentrazioni. Questi parametri saranno quindi influenzare fortemente il momento in cui nucleazione viene prima osservato e quando si raggiungono posizioni di aster steady-state. Nelle cellule, le forze di trazione corticali sono generati attraverso la formazione di collegamenti portanti tra microtubuli plus-end e dynein Cortex-associata. In cellule animali, questa associazione dipende dal complesso Gαi / LGN / NuMA, che si rivolge alla membrana plasmatica tramite myristoylation N-terminale della Gαi 1. In questi saggi ricostituzione, il requisito del complesso Gαi / LGN / NuMA viene bypassato accoppiando direttamente dynein di lipidi biotinilati attraverso laformazione di complessi biotina-streptavidina-biotina. Questi legami sono relativamente stabili (K D ~ 10 -14 M) 37 e formano rapidamente (di solito entro 10 min dopo la formazione dell&#39;emulsione gocciolina, prima microtubuli nucleazione diventa evidente) (Figura 4b). In presenza di dineina corticale, centrosomes tipicamente mantengono una posizione più centrale, mentre in assenza di dineina, centrosomi sono spinti ai lati opposti della corteccia goccia (figura 4c). Abbiamo ragione per cui questo è il risultato di due effetti, che prevenire e contrastare le forze di microtubuli spingere. (1) Dynein promuove direttamente catastrofi microtubuli, limitando in tal modo la lunghezza dei microtubuli e prevenendo eccessiva deformazione dei microtubuli, e (2) forze di trazione corticali portare alla forza risultante di centraggio sulle singole astri 8, che contrastano le forze di repulsione Aster-Aster. Il diffusibile cross-linker Ase1 induce forces che tendono ad aumentare la regione di sovrapposizione dei microtubuli anti-parallele 29. Coerentemente con questo, in presenza di Ase1 (e l&#39;assenza di dineina) centrosomi si trovano vicini tra loro con Ase1 localizzazione di bundle microtubuli interpolari (Figura 4D). I membri della famiglia kinesin-5 auto separazione dei centrosomi, fornendo forze che spingono dall&#39;interno del mandrino (vedi introduzione). In presenza di Cut7 (S. pombe chinesina-5 ortologo), centrosomi sono spinti a lati opposti delle goccioline di emulsione, anche in presenza di Ase1 (figura 4e). Grazie alla combinazione di generatori di forza corticali e inter-polari, il livello di complessità può essere ulteriormente aumentata in questi esperimenti, alla fine portano a una comprensione globale del montaggio mitotico fuso bipolare. Una descrizione quantitativa dettagliata di questi risultati saranno disponibili in futuro (Roth et al., Manoscritto in preparazione). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Oltre ad osservare la posizione dei centrosomi in momenti fissi nel tempo, e relative loro comportamento alle lunghezze osservati dei microtubuli, preziose informazioni possono essere ottenute seguendo il processo di posizionamento sopra tempo. Riducendo i tempi di esposizione e intensità del laser, è ora possibile seguire il posizionamento aster ad intervalli di 2 min per almeno 1 ora con solo il 30% ~ sbiancamento. Questo consente il monitoraggio di assemblaggio aster e posizionamento di centrosomi liberamente diffondenti (0 min.) Via centralizzata (12 min.) Di astri decentrate (36 min e oltre) (Figura 5C). Questo facilita lo studio del comportamento sia stato stazionario e cinetica di montaggio del mandrino. Combinando goccioline con diversi contenuti nello stesso campione, è, ad esempio, possibile confrontare direttamente centrosoma posizionamento e montaggio del mandrino cinetica in goccioline con e senza generatori di forza corticali (Figura 5b). Figura 1: forze agenti sul mitotica mandrino diverse molecole genera forza agiscono sui microtubuli del fuso mitotico per promuovere la formazione del fuso e posizionamento.. I microtubuli che crescono nella corteccia delle cellule generano una forza di spinta sul centrosoma. dineina corticale (viola) cattura microtubuli depolimerizzante e genera una forza di trazione sulle centrosomi. All&#39;interno del mandrino, kinesin-5 proteine ​​motrici / Cut7 forniscono una forza di scorrimento verso l&#39;esterno microtubuli anti-parallele, mentre cross-linkers della famiglia PRC1 / Ase1 generano un avversario verso l&#39;esterno forza di scorrimento. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Figura 2:. Microfluidic Chip Design (A) Progettazione di fotomaschere 4 pollici contenente 4 chip microfluidica. (B) Rappresentazione dettagliata di un singolo chip. Chips contengono un canale di uscita e tre canali di entrata seguita da una polvere filtro. canale di ingresso 1 contiene l&#39;acqua-fase canale 2 lipide / fase oleosa e il canale 3 può essere utilizzato per diluire le goccioline formate con ulteriori lipidi / fase oleosa. (C) Rappresentazione dettagliati di giunzione in cui il lipide / fase oleosa (proveniente dalla parte superiore e inferiore) incontra con l&#39;acqua-fase (proveniente da sinistra). Al bivio, goccioline formeranno e fluire verso il canale di uscita a destra. (D) la rappresentazione dettagliata di un polvere filtro con 2 micron canali. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Figura 3:. Metodologia per la formazione di acqua-in-olio Emulsione gocciolina (A) chip microfluidico e tubi microfluidica su un microscopio in campo chiaro. Entrambi i tubi di acqua e lipidi / olio-fase sono collegate agli ingressi di chip 1 e 2 rispettivamente. (B) Restrizioni sul chip microfluidica in cui l&#39;acqua e lipidi / olio-fasi si incontrano. Cambiando le pressioni, goccioline formato può essere controllato. (C) Design di portate cellule PDMS rivestite. Dopo aver caricato le goccioline nella cella a flusso, le estremità aperte vengono chiuse con ulteriori Valap. (D) Schema di formazione di goccioline. Goccioline vengono utilizzati per incapsulare centrosomi, tubulina e componenti aggiuntivi necessari per la formazione del fuso mitotico. (E) Schema del targeting corticale-dynein. Biotinilato (Bio) dynein si rivolge a lipidi biotinilati attraverso streptavidina (Strp). <ahref = &quot;https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Figura 4:. Risultati rappresentativi di mandrini-Reconstitutions con complessità crescente (A) proiezioni di massima intensità di goccioline contenenti due centrosomi che mostrano esempi di brevi, intermedi, e lungo i microtubuli. Centrosomi e microtubuli sono visualizzate con l&#39;aggiunta di 10% HiLyte-488 marcato tubulina. Barre di scala = 10 micron. (B) Localizzazione di GFP-biotina-dynein-TMR in assenza (-, a sinistra) e la presenza (+, a destra) di streptavidina (Strp). Posizionamento (C) Microtubulo aster in assenza (-, a sinistra) o la presenza (+, a destra) della corticale GFP-biotina-dynein-TMR. (D) Microtubulo aster (pannello di sinistra, green) posizionamento in presenza di Ase1 (pannello centrale, rosso). (E) Microtubulo aster (pannello di sinistra, verde) il posizionamento in presenza di Ase1 e Cut7 (kinesin-5) (pannello centrale, rosso). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Figura 5: Imaging Aster Posizionamento Dynamics in vitro (a) Progettazione di una tazza PDMS che permette l&#39;imaging delle gocce per diverse ore.. (B) generazione, lo stoccaggio e l&#39;imaging di goccioline (trasmessa) che contiene diversi contenuti, illustrate da assenza (a sinistra) inclusione (a destra) di destrano fluorescente (Alexa 647). (C) le immagini solo piano di un 60 min time-lapse (2 min intervalli) tratto da un z-stack (2 micron distanze) di annuncioroplet contenente un singolo centrosome. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

Ricostituzione di base Mitotic mandrini sferici Emulsione goccioline

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

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Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological materials. Such approaches have received considerable attention in research on the boundary between living and nonliving matter and have been used to construct artificial cells over the past two decades. In particular, Giant Vesicles (GVs) have often been used as artificial cell membranes. In this paper, we describe the preparation of GVs encapsulating highly packed microspheres as a model of cells containing highly condensed biomolecules. The GVs were prepared by means of a simple water-in-oil emulsion centrifugation method. Specifically, a homogenizer was used to emulsify an aqueous solution containing the materials to be encapsulated and an oil containing dissolved phospholipids, and the resulting emulsion was layered carefully on the surface of another aqueous solution. The layered system was then centrifuged to generate the GVs. This powerful method was used to encapsulate materials ranging from small molecules to microspheres.

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

Preparazione di giganti Vescicole Encapsulating microsfere mediante centrifugazione di una emulsione acqua-in-olio

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

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Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

La ricostituzione delle oscillazioni del ciclo cellulare in microemulsioni di uovo senza cellula Xenopus estrae

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

Fabbricazione di nanocristalli micellare sferica e a forma di verme combinando Electrospray, auto-assemblaggio e controllo di struttura a base di solvente

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

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Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

Ricostituzione dell'attività estrattiva msp1 con componenti completamente purificati

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is especially the case during mitosis or meiosis, where the microtubules form the spindle during cell division. The spindle is the machinery used to segregate genetic material during cell division. Toward creating self-organized spindles in vitro, we recently developed a technique to reconstitute microtubules into spindle-like assemblies with a minimal set of microtubule-associated proteins and crowding agents. Specifically, MAP65 was used, which is an antiparallel microtubule crosslinker from plants, a homolog of Ase1 from yeast and PRC1 from mammalian organisms. This crosslinker self-organizes microtubules into long, thin, spindle-like microtubule self-organized assemblies. These assemblies are also similar to liquid crystal tactoids, and microtubules could be used as mesoscale mesogens. Here, protocols are presented for creating these microtubule tactoids, as well as for characterizing the shape of the assemblies using fluorescence microscopy and the mobility of the constituents using fluorescence recovery after photobleaching.

This article presents a protocol for the formation of microtubule assemblies in the shape of tactoids using MAP65, a plant-based microtubule crosslinker, and PEG as a crowding agent.

Auto-assemblaggio di microtubuli tactoidi

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell deformation, division, migration, and adhesion. However, studying the dynamics and structure of the actin network in vivo is complicated by the biochemical and genetic regulation within live cells. To build a minimal model devoid of intracellular biochemical regulation, actin is encapsulated inside giant unilamellar vesicles (GUVs, also called liposomes). The biomimetic liposomes are cell-sized and facilitate a quantitative insight into the mechanical and dynamical properties of the cytoskeleton network, opening a viable route for bottom-up synthetic biology. To generate liposomes for encapsulation, the inverted emulsion method (also referred to as the emulsion transfer method) is utilized, which is one of the most successful techniques for encapsulating complex solutions into liposomes to prepare various cell-mimicking systems. With this method, a mixture of proteins of interest is added to the inner buffer, which is later emulsified in a phospholipid-containing mineral oil solution to form monolayer lipid droplets. The desired liposomes are generated from monolayer lipid droplets crossing a lipid/oil-water interface. This method enables the encapsulation of concentrated actin polymers into the liposomes with desired lipid components, paving the way for in vitro reconstitution of a biomimicking cytoskeleton network.

In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

In this manuscript, we demonstrate the experimental techniques to encapsulate the F-actin cytoskeleton into giant unilamellar lipid vesicles (also called liposomes), and the method to form a cortex-biomimicking F-actin layer at the inner leaflet of the liposome membrane.

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

The actin cytoskeleton, the principal mechanical machinery in the cell, mediates numerous essential physical cellular activities, including cell ...

Bioingegneria

Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the requirement of microfluidics to form controlled droplets imposes a barrier to non-experts, limiting their use. Here, we describe particle templated emulsification, an approach to generate monodisperse droplets without microfluidics. Using templating hydrogel spheres, we encapsulate samples in monodispersed droplets by simple vortexing. We demonstrate the approach by using it to perform microfluidic-free digital PCR.

Water-in-oil droplet assays are useful for analytical chemistry, enzyme evolution, and single cell analysis, but typically require microfluidics to form the droplets. Here, we describe particle templated emulsification, a microfluidic-free approach to perform droplet assays.

L'emulsione con modellazione di particelle consente saggi di goccioline prive di microfluidi

Reactions performed in monodispersed droplets afford enhanced accuracy and sensitivity compared to equivalent ones performed in bulk. However, the ...

Biologia

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Impatto del citoscheletro sulla forma nucleare e sulla dinamica del condensato negli ovociti di topo

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named oocytes. Their development is marked by cell growth and subsequent divisions, two critical phases that prepare the oocyte for fusion with sperm to initiate embryogenesis. During growth, oocytes reorganize their cytoplasm to position the nucleus at the cell center, an event predictive of successful oocyte development in mice and humans and, thus, their embryogenic potential. In mouse oocytes, this cytoplasmic reorganization was shown to be driven by the cytoskeleton, the activity of which generates mechanical forces that agitate, reposition, and penetrate the nucleus. Consequently, this cytoplasmic-to-nucleoplasmic force transmission tunes the dynamics of nuclear RNA-processing organelles known as biomolecular condensates. This protocol provides an experimental framework to document, with high temporal resolution, the impact of the cytoskeleton on the nucleus across spatial scales in mouse oocytes. It details the imaging and image analysis steps and tools necessary to evaluate i) cytoskeletal activity in the oocyte cytoplasm, ii) cytoskeleton-based agitation of the oocyte nucleus, and iii) its effects on biomolecular condensate dynamics in the oocyte nucleoplasm. Beyond oocyte biology, the methods elaborated here can be adapted for use in somatic cells to similarly address cytoskeleton-based tuning of nuclear dynamics across scales.

Autore in primo piano: Chiarire le dinamiche della meccano-trasduzione e dell'agitazione nucleare negli ovociti di topo

This protocol provides an experimental framework to document the physical impact of the cytoskeleton on nuclear shape and the internal membrane-less organelles in the mouse oocyte system. The framework can be adapted for use in other cell types and contexts.

Cattura dell'agitazione basata sul citoscheletro del nucleo dell'ovocita di topo su scale spaziali

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...