Deferirti è supportato da NIH grant (R01 AI076457) e dei fondi forniti da Stony Brook University. Z.Q. è supportato da NIH concedere (K12 GM102778).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono state condotte secondo le linee guida del National Institute of Health e approvati dal comitato di uso e Stony Brook University istituzionale Animal Care.
Nota: Assicurarsi che tutte le autorizzazioni sono concesse prima di eseguire le procedure.
1. soluzione preparazione
<ol><li>
HGPG (HEPES, L-Glutammina, penicillina/streptomicina e gentamicina), 100 ×
	<ol>
<li>Mescolare 59,6 g HEPES (500 mM finale), 14,6 g L-Glutammina (finale 200 mM), 1 × 106 U penicillina (2.000 U/mL finale), streptomicina 1 g (2 mg/mL finale) e gentamicina 2,5 mg (5 µ g/mL finale). Aggiungere RPMI 1640 a 500 mL. Aggiustare il pH a 7,5 usando NaOH (prima della regolazione, il buffer è giallo/arancio con un pH di circa 6.0). Filtro sterilizzare usando un filtro da 0,45 µm. Aliquotare e conservare a-20 ° C fino a 1 anno o a 4 ° C per 1 mese.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampone HEPES-bicarbonato, 10x
	<ol>
<li>
Mescolare 23,8 g HEPES (100 mM finale), 21 g NaHCO3 (250 mM finale) e aggiungere acqua a 1.000 mL. Aggiustare il pH a 7,2 con HCl. filtro sterilizzare usando un filtro di 0,45 μm. Conservare a temperatura ambiente. Il pH cambia nel tempo. Ri-regolare il pH periodicamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta multimediale (~ 1 bottiglia/2 topi)
	<ol>
<li>A 500 mL RPMI 1640, aggiungere 25 mL inattivati siero bovino fetale (5% finale) e 5 mL 100 × HGPG. Memorizzare fino a 6 mesi a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluzione dithioerythritol (DTE) (40 mL/piccolo intestino)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × soluzione salina bilanciata di Hanks e Ca2+- Mg2+-gratis, 50 mL 10 × bicarbonato-HEPES buffer e 50ml inattivati siero bovino fetale (10% finale). Aggiungere 350 mL H2O e 15,4 mg dithioerythritol/100 mL (1 mM finale). Preparare questo fresco prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluzione di acido etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) (50 mL/piccolo intestino)
	<ol>
<li>Mix 50 mL 10 × soluzione salina bilanciata di Hanks e Ca2+- Mg2+-gratuito con 5 mL 100 × HGPG. Aggiungere mL 445 H2O. aggiungere 260 µ l 0,5 M EDTA/100 mL (1,3 mM finale). Preparare questo fresco prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluzione della collagenosi (30 mL/LP)
	<ol>
<li>500 mL RPMI, aggiungere 50 mL FBS (10% FBS finale), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (finale 1 mM) e 1 mL 0,5 M CaCl2 (1mm finale). Aggiungere collagenosi, tipo I (100 U/mL finale). Preparare questo fresco prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluzioni (DG) gradiente di densità
	<ol>
<li>Preparare 1 × DG stock soluzione mescolando 90 mL DG di soluzione madre (fare riferimento alla Tabella materiali) con 10 mL di 10 × PBS. Mantenere sterile a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare soluzione di 44% DG (8 mL/IEL, 8 mL/LP) con 44 mL di soluzione madre 1 × DG e 56 mL RPMI 1640. Preparare questo fresco prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare soluzione DG 67% (5 mL/IEL, 5 mL/LP) con 67 mL di soluzione madre 1 × DG e 33 mL RPMI 1640. Preparare questo fresco prima dell'uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento dei linfonodi mesenterici, intestini e placche di Peyer Patches
<ol><li>Eutanasia il mouse usando anidride carbonica narcosi e dislocazione cervicale secondaria. Posizionare il mouse sul dorso e spruzzare con etanolo al 70%. Usare le forbici per fare un'incisione del midline e aprire la pelle e la parete addominale per esporre la cavità peritoneale.</li>
	<li>Individuare l'intestino cieco e utilizzare il forcipe per estrarre delicatamente l'intestino cieco verso il basso. Utilizzare pinze per muovere con cautela l'intestino tenue a destra, esponendo l'intera catena MLN, che è allineata con i due punti. Nota: Una mappa dei linfonodi mesenterici catena e il drenaggio linfatico dell'intestino era precedentemente raffigurato13.</li>
	<li>Identificare il nodo di fondo della catena, situato più vicino al cieco. Utilizzare un set di pinze per afferrare il mesentere/grasso intorno ad esso e rimuovere delicatamente la catena MLN dal basso verso l'alto di tweezing il grasso da intorno il linfonodo con un altro set di pinze.</li>
	<li>Posare la catena MLN su un tovagliolo di carta inumidito con media di raccolta. Rimuovere il mesentere/grasso facendo rotolare la catena sulla Torre carta e tirando il grasso fuori con due set di pinze. Posto il MLN in media freddo raccolto per i passaggi successivi di isolamento. Nota: (i) diretta gestione dei nodi è scoraggiata. Invece, afferrare il mesentere/grasso intorno a loro. (ii) è fondamentale per rimuovere tanto mesentere/grasso possibile per migliorare la vitalità cellulare.</li>
	<li>Tagliare l'intestino tenue sotto lo sfintere pilorico e sopra l'intestino cieco con le forbici. Estrarre l'intestino lentamente dall'ileo duodeno tramite un set di pinze mentre si rimuove il mesentere/grasso allegato usando un'altra serie di pinze.</li>
	<li>Posizionare l'intestino su un tovagliolo di carta inumidito con media raccolto e stuzzicare qualsiasi mesentere/grasso residuo fuori con due set di pinze. Nota: (i) assicurarsi di rimuovere tanto mesentere/grasso possibile per cellulare ottimale rendimento e redditività. (ii) mantenere l'intestino inumidito in tutto questo e i seguenti passaggi applicando periodicamente la raccolta multimediale.</li>
	<li>Raccogliere di Peyer rimuovendoli dall'intestino con forbici curve. Utilizzare un ambito di dissezione o lente d'ingrandimento se necessario (principianti); la maggior parte delle placche di Peyer dovrebbe essere visibile per l'occhio allenato. Raccogliere 5-11 (tipico) placche di Peyer dal piccolo intestino. Posto placche di Peyer patches in media freddo raccolto per i passaggi successivi di isolamento. Nota: Placche di Peyer patches sono piccole, principalmente rotondo rigonfiamenti nella parete intestinale esterna fronte alla linea di attacco del mesentere.</li>
	<li>Utilizzare il lato piatto del forcipe e delicatamente diapositiva dal duodeno verso ileo per espellere il muco e contenuto fecale. Ripetere l'operazione una volta per rimuovere la maggior parte del muco. Nota: La rimozione incompleta del muco può diminuire la vitalità cellulare e resa. Tuttavia, assicurarsi di far scorrere l'intestino delicatamente per evitare di spogliatura villi o danneggiare la membrana dello scantinato.</li>
	<li>Usare le forbici bene con una punta smussata su un punto, inserire l'estremità smussata nell'intestino e tagliare l'intestino aperto longitudinalmente dal duodeno al ileo. L'intestino aperto di lateralmente tagliate a pezzi di ~ 2 cm. Posto i pezzi intestinali in una provetta conica da 50 mL con media freddo raccolto 25 mL per i passaggi successivi di isolamento. Nota: Tenendo le forbici inumidite con media li aiuterà a scorrimento senza sforzo attraverso l'intestino.</li>
</ol>3. isolamento dei linfociti dai siti induttivi
<ol><li>Isolare i linfociti da MLN dissociando delicatamente attraverso un colino di cella di 70 µm utilizzando lo stantuffo della siringa da 3 mL. Lavare il filtro cella con 5 mL di media raccolto freddo.</li>
	<li>Pellet MLN-cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in media raccolto freddo 1 mL. Conteggio di cellule vitali con esclusione del blu di trypan. Nota: buffer di lisi di globuli rossi consente di rimuovere le cellule di anima rosse se lo spurgo ha accaduto durante la rimozione.</li>
	<li>Isolare i linfociti da placche di Peyer incubando di Peyer in un tubo conico di 15 mL contenente soluzione della collagenosi 5ml preriscaldato a 37 ° C e 220 giri/min per 30 min.</li>
	<li>Vortex per 15 s all'impostazione massima e filtro digerito tessuto e surnatante in una provetta conica da 50 mL attraverso un colino di cella di 70 µm. Delicatamente dissociare i restanti pezzi di tessuto utilizzando lo stantuffo della siringa da 3 mL e lavare il filtro cella con 5 mL di media raccolto freddo.</li>
	<li>Pellet di cellule toppa di Peyer mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C e risospendere il pellet cellulare in media raccolto freddo 1 mL. Conteggio di cellule vitali con esclusione del blu di trypan. Nota: Isolamento di toppe di Peyer possono avere alcuni contaminanti linfociti della lamina propria e linfociti intraepiteliali.</li>
</ol>4. isolamento dei linfociti Intraepithelial dal piccolo intestino
<ol><li>Lavare i pezzi di piccolo intestino tre volte con 25 mL di media raccolto freddo capovolgendo il tubo 10 volte, lasciando i pezzi intestinali stabilirsi, e versando il sovranatante. Nota: Pezzi di tessuto devono prontamente depositano alla parte inferiore del tubo. Se non lo fanno, è un'indicazione che troppi mesentere/grassi rimane attaccato o sono associati con una bolla d'aria.</li>
	<li>Aggiungere 20 mL della soluzione DTE preriscaldata a tubo conico da 50 mL contenente pezzi dell'intestino e trasferimento in un matraccio di Erlenmeyer siliconato da 50 mL contenente un'ancoretta. Mescolare a 37 ° C e 220 giri/min su un agitatore magnetico per 20 min. utilizzare un grande magnete sulla parte esterna della muffola per tenere l'ancoretta e trasferire il tessuto e la soluzione torna a tubo conico da 50 mL.</li>
	<li>Vortice del tubo al massimo l'impostazione per 10 s. trasferimento il surnatante in una nuova provetta conica 50 mL attraverso un colino di cella di 70 µm avendo cura di tenere i pezzi di tessuto nel tubo originale. Non scartare il surnatante; il surnatante contiene linfociti intraepiteliali. Pellet di cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in media freddo raccolto 10 mL e memorizzare sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 20 mL della soluzione DTE preriscaldata a tubo conico da 50 mL contenente pezzi dell'intestino e trasferire il matraccio di Erlenmeyer siliconato da 50 mL contenente un'ancoretta. Mescolare a 37 ° C e 220 giri/min su un agitatore magnetico per 20 min. utilizzare un grande magnete sulla parte esterna della muffola per tenere l'ancoretta e trasferire il tessuto e la soluzione torna a tubo conico da 50 mL. Nota: DTE è un agente riducente che arricchisce di linfociti intraepiteliali.</li>
	<li>Vortice del tubo al massimo l'impostazione per 10 s. trasferimento il surnatante attraverso un colino di cella di 70 µm nella provetta precedente contenente cellule dal surnatante del primo trattamento DTE (dal punto 4.3). Nota: I restanti pezzi intestinali sono utilizzati per isolare i linfociti da lamina propria. Controllo di qualità: Un pezzo di tessuto può essere rimosso e controllato istologicamente per garantire che le cellule epiteliali sono presenti e la membrana basale è intatta.</li>
	<li>Pellet di cellule mediante centrifugazione il supernatante a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 8 mL di soluzione DG del 44% a temperatura ambiente (TA).</li>
	<li>Trasferire la sospensione di 8 mL 44% DG soluzione/cellulare in un ø 17 mm x 100 mm stile tubo tondo-fondo in polipropilene 14 mL. Sottofondo con 5 mL di soluzione di RT 67% DG. Centrifugare a 1600 × g per 20 min a RT senza utilizzare il freno. Nota: I tubi possono essere pretrattati con siero bovino per impedire che le cellule aderiscano alle pareti del tubo.</li>
	<li>Si noti che cellule vitali formano una band (buffy-coat) all'interfaccia del 44% al 67%, le cellule morte e alcune cellule epiteliali sono in un film mocoso nella parte superiore della sfumatura e i globuli rossi sono nel pellet. Rimuovere lo strato superiore della sfumatura all'interno di ~ 2 cm dell'interfaccia tramite aspirazione a vuoto. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere il buffy-coat all'interfaccia e trasferirli in una provetta conica da 50 mL contenente 40 mL freddo raccolto media.</li>
	<li>Pellet di cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in media raccolto freddo 1 mL. Conteggio di cellule vitali con esclusione del blu di trypan.</li>
</ol>5. isolamento dei linfociti della Lamina Propria dal piccolo intestino
<ol><li>Rimuovere le cellule epiteliali da pezzi di tessuto intestinale aggiungendo 25 mL di soluzione di EDTA preriscaldati il matraccio contenente i pezzi rimanenti intestinali. Boccetta di mescolare a 37 ° C e 220 giri/min su un agitatore magnetico per 30 min. utilizzare un grande magnete sulla parte esterna della muffola per tenere l'ancoretta e attentamente scartare il surnatante mantenendo pezzi intestinale entro il pallone. Nota: (i) EDTA è un chelante del calcio che gli obiettivi di giunzioni calcio-dipendente e promuove il distacco delle cellule epiteliali intestinali. (ii) il surnatante dovrebbe essere nuvoloso e può essere utilizzato per isolare IEC se loro collezione è desiderata.</li>
	<li>Ripetere il punto 5.1. Nota: Il surnatante dovrebbe essere meno nuvoloso seguendo questa incubazione. Controllo di qualità: Un pezzo di tessuto può essere rimosso e controllato istologicamente per garantire che le cellule epiteliali intestinali sono stati rimossi e la membrana basale è intatta. Un campione dal surnatante può essere valutato anche tramite flusso cytometry per confermare che leucociti (CD45+ cellule) sono assenti.</li>
	<li>Aggiungere 50 mL di media raccolto RT al pallone. Mescolare brevemente con un magnete. Lasciare pezzi intestinale stabilirsi e attentamente scartare il surnatante. Nota: Questo passaggio garantisce la rimozione di EDTA prima della digestione della collagenosi come EDTA inattiva la collagenosi chelatando il calcio che è critico per la funzione di collagenasi.</li>
	<li>Aggiungere 30 mL di soluzione preriscaldata collagenosi al pallone e mescolare intestinale pezzi a 37 ° C e 220 giri/min su un agitatore magnetico per 45 min.</li>
	<li>Trasferimento digerito tessuto e surnatante in una provetta conica da 50 mL filtrando attraverso un colino di cella di 70 µm. Delicatamente dissociare pezzi rimanenti del tessuto utilizzando lo stantuffo della siringa da 3 mL di mash attraverso il filtro. Lavare il filtro con 10 mL di media raccolto freddo.</li>
	<li>Pellet di cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 8 mL di soluzione DG 44% temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la sospensione di 8 mL 44% DG soluzione/cellulare in un ø 17 mm x 100 mm stile tubo tondo-fondo in polipropilene 14 mL. Sottofondo con 5 mL di soluzione DG 67% temperatura ambiente. Centrifugare le pendenze a temperatura ambiente e 1600 × g per 20 minuti con nessun freno.</li>
	<li>Rimuovere lo strato di grasso sulla parte superiore tramite aspirazione a vuoto. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere il buffy-coat all'interfaccia e trasferirlo in una provetta conica da 50 mL contenente 40 mL freddo raccolto media.</li>
	<li>Pellet di cellule mediante centrifugazione a 400 × g per 5 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in media raccolto freddo 1 mL. Conteggio di cellule vitali con esclusione del blu di trypan.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Un protocollo dettagliato è presentato per l'isolamento dei linfociti da intestinale mucosi induttivo (MLN e PP) e siti effettrici (LP e IEL vano). Il protocollo è stato sviluppato per bilanciare l'ingresso (tempo) e uscita (vitalità e rendimento) per massimizzare la produttività e risultati. Il protocollo assicura anche minima contaminazione trasversale compartimentali tra LP e IEL compartimenti.
Diversi protocolli per l'isolamento delle cellule immuni dall'intestino tenue del mouse sono stati pubblicati3,4,5,6,7. La maggior parte di questi protocolli concentrarsi su isolando le cellule immuni dal LP. L'epitelio intestinale è un compartimento distinto dal LP che è direttamente esposto all'ambiente esterno e costituito da una composizione unica di linfociti. Approcci recenti hanno cercato un'analisi più globale della funzione immune nell'intestino esaminando distinti compartimenti intestinale simultaneamente per comprendere gli aspetti unici della risposta immunitaria che accadono in questi compartimenti e le relazioni tra di loro. Di conseguenza, un protocollo affidabile per l'isolamento delle cellule immuni da tutti questi compartimenti è desiderato. Sono sufficienti per isolare due DTE trattamenti > 95% di IEL e alcuni IEC. EDTA rivolge giunzioni calcio-dipendente ed è efficiente per staccare IEC. Di conseguenza, il surnatante dai successivi trattamenti di EDTA comprendono principalmente IEC. Un numero molto piccolo di linfociti può essere trovato nel surnatante dopo trattamento di EDTA; Tuttavia, circa 20 volte più linfociti sono ottenuti dalla frazione DTE. Inoltre, i linfociti dal trattamento EDTA assomigliano a popolazione mista di linfociti IEL e LP (Figura 4), che suggerisce la contaminazione di LP dai villi e cripta danni. Pertanto, nel presente protocollo, IEL sono raccolti dal trattamento DTE prima del trattamento di EDTA, massimizzando la purezza riducendo la contaminazione trasversale-vano. Utilizzano altri protocolli sequenziale ditiotreitolo (DTT)-trattamenti di EDTA o trattamento combinato DTT-EDTA per l'isolamento di IEL5,6,7. DTT è un epimero di DTE ed entrambi agiscono come agenti riducenti. In questi protocolli, DTT è segnalato solo rimuovere muco ed EDTA è utilizzato per isolare IEL. Anche se l'effetto del DTT ed il DTE non è stato confrontato direttamente, è stata valutata IEL dopo trattamento di DTE o trattamento combinato di DTE-EDTA. Non sorprendentemente, trattamento combinato di DTE-EDTA aumenta la contaminazione di IEC nella preparazione IEL (Figura 5) e la presenza di un numero elevato di IEC diminuita IEL rendimenti dopo centrifugazione in gradiente di densità. Come EDTA può danneggiare alcuni villi e cripte, trattamento combinato di DTE-EDTA può anche provocare contaminazione dei linfociti LP nella preparazione IEL o perdita di cellule di LP dall'isolamento LP. Inoltre, come > 95% di IEL sono stati isolati dalla frazione DTE, trattamenti separati di DTE ed EDTA sono preferibili. Alcuni protocolli di isolano i linfociti senza mediante centrifugazione in gradiente di densità per arricchire le cellule immuni6. Centrifugazione in gradiente di densità richiede più tempo e potrebbe verificarsi una perdita di alcune cellule. Tuttavia, rimuove le cellule morte, cellule epiteliali e muco, che conduce a popolazioni linfocitarie altamente arricchito (Figura 6), che aiuta a migliorare la rilevazione di piccole popolazioni di cellule e sostanzialmente riduce il tempo di acquisizione per il flusso cytometry. Centrifugazione in gradiente di densità ha riferito che nel rapporto alterato di fagociti mononucleari sottoinsiemi7; Tuttavia, la composizione di sottoinsieme del linfocita appare normale. È particolarmente utile eseguire centrifugazione in gradiente di densità per l'isolamento di IEL. Nel complesso, un protocollo completo è presentato per isolare i linfociti altamente arricchiti e ottimamente praticabile da tutti i tessuti intestinali tra cui il LP e IEL con minima contaminazione trasversale-compartimentale.
Cura e consistente lasso di tempo deve adottare durante le fasi di isolamento del tessuto per limitare la contaminazione tra le preparazioni. Rimozione incompleta del PP può inclinare notevolmente i linfociti LP. ILF possono contaminare anche preparazioni di LP. Tuttavia, ILF non può essere visto ad occhio nudo e pertanto non possono essere rimossi chirurgicamente prima della digestione. Diversi ceppi di topi diversi hanno un diverso numero di ILF14, che possono notevolmente contribuire alla composizione variabile dei linfociti LP tra diversi ceppi di topi. Durante la rimozione di muco, assicuratevi di scorrere delicatamente l'intestino per evitare di danneggiare la membrana dello scantinato e LP, che potrebbe provocare una contaminazione di LP di IEL. Un indizio di contaminazione è la presenza di un gran numero di cellule di B nella preparazione IEL. IEL contengono poche cellule di B (~ 1% o meno), mentre LPL può avere fino a 60% B cellule a seconda del ceppo del mouse. CD19 ma non B220 deve essere utilizzato per identificare le cellule di B nel vano LP e IEL, come cellule T intestinali possono anche esprimere B22015. Inoltre, molte cellule T intestinali possono esprimere marcatori DC come CD11b e CD11c, rispettivamente16e tradizionale del macrofago. Di conseguenza, corretto dump gating strategie dovrebbero essere utilizzate per garantire adeguate analisi.
Passaggi possono essere modificati per soddisfare le esigenze dei ricercatori. Digestione meccanica può essere sufficiente per l'isolamento dei linfociti PP allo stato stazionario o digestione della collagenosi dei linfonodi può facilitare l'isolamento di alcuni sottoinsiemi di leucociti durante l'infiammazione. Il tipo della collagenosi utilizzato può avere un impatto sostanziale sulla espressione di superficie dell'indicatore delle cellule e vitalità e purezza di LP linfociti5,17. L'intestino può essere tagliato in piccoli pezzi per la digestione della collagenosi, che può aumentare il rendimento delle celle. Tuttavia, si riduce anche la redditività. Il tempo di incubazione con collagenasi può essere ottimizzato per massimizzare il rendimento riducendo al minimo la morte delle cellule, che porta al massimo recupero di cellule vive. Laboratori diversi utilizzano gradienti di densità leggermente diverso per isolare i linfociti. Una consolidata 44/67% densità gradiente protocollo è presentato qui. I ricercatori possono testare gradienti di densità diverse per meglio soddisfare le loro esigenze individuali. Se un numero maggiore di linfociti è desiderato, due piccoli intestini possono essere combinati per DTE trattamenti, trattamenti di EDTA e digestione della collagenosi. Se più di due intestini sono necessari per l'esame di eventi estremamente rari, quindi è consigliabile che le sospensioni delle cellule singole sono riunite dopo isolamento.
Linfociti isolati possono essere utilizzati per ulteriori analisi fenotipica e funzionale genomica. Quando si esegue l'analisi cytometric di flusso, è altamente consigliabile sempre utilizzare che una vitalità coloranti e anticorpo anti-CD45 per escludere le cellule morte e cellule non-emopoietici, che potranno di migliorare notevolmente l'analisi. Se sono necessari popolazioni linfocitarie puro, cella ordinamento di CD45+ cellule insieme ad altri marcatori di scelta possono essere eseguite. Panoramica sulle piastre anti-CD8α-rivestito utilizzabile anche per isolare cellule T pure dalla preparazione IEL come maggior parte di questi T cellule CD8α express. Panning o ordinamento delle cellule è generalmente richiesto per la coltura di IEL come contaminando le cellule epiteliali possa inibire la crescita di IEL. Le cellule di alimentatore come ingenuo splenocytes possono essere aggiunti anche a promuovere la sopravvivenza di IEL nella cultura. Se gli alimentatori sono usati, è importante utilizzare le cellule congenically mal adattato per distinguere le popolazioni. Contaminazione batterica è raramente un problema in questi studi funzionali a breve termine come raccolta multimediale contiene penicillina, streptomicina e gentamicina. Inoltre, numerosi passaggi del lavaggio e centrifugazione in gradiente di densità rimuovere la maggior parte dei batteri.
Il processo di isolamento è che richiede tempo e richiede un equilibrio di cura, precisione e velocità per ottenere risultati ottimali. Deve essere speso abbastanza tempo per assicurare la corretta manipolazione di ogni passo mentre minimizzando il tempo tra sacrificio del mouse e ottenere una sospensione di singola cellula per massimizzare la resa e la vitalità cellulare. Si tratta di un delicato equilibrio che è anche un collo di bottiglia per i principianti cercando di ottenere coerenza nell'isolamento dei linfociti con resa e alta redditività. Un processo di isolamento intero a partire da eutanasia del mouse per ottenere una sospensione di contato singola cella prende un ricercatore esperto circa 8 h per 8 topi. Si consiglia di ottenere assistenza per più di 8 topi generare alta qualità e riproducibilità dei risultati. È importante fare attenzione quando si confrontano i linfociti da questi tessuti con i linfociti da milza, sangue o altri tessuti linfoidi come le incubazioni vaste può portare a cambiamenti artificiali connessi con la procedura di isolamento17. Sistematiche comparazioni di LP e IEL popolazioni allo stesso modo trattati tessuti linfoidi valuterà se l'indicatore di interesse è modulata durante l'isolamento dei linfociti dai tessuti intestinali. Problemi simili sono anche delle principali preoccupazioni quando si confrontano i profili di RNA da intestini con quelli provenienti da tessuti linfoidi.

Il tratto gastrointestinale (GI) ha molte pieghe e sporgenze che rappresenta l'interfaccia più grande che separa il corpo interno e ambiente esterno. Il sistema immunitario intestinale svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della funzione di barriera del tratto di GI. È costantemente esposta ad antigeni alimentari, batteri commensali e microbi patogeni. Come tale, deve rimanere tollerante per gli antigeni alimentari e batteri commensali, preservando la capacità di generare rapidamente una risposta immunitaria efficace a microbi enteropatogeni1. Il sistema immunitario intestinale può essere anatomicamente diviso in siti induttivi, dove i linfociti naive sono attivati da cellule che trasportano gli antigeni da mucosa intestinale presentanti l'antigene, ed effettrici, dove esercitano specifici linfociti attivati effector funzioni2. I siti induttivi comprendono la struttura linfoide organizzata di placche di Peyer (PP) che sorveglia il lume intestinale direttamente attraverso l'azione delle cellule M specializzate e regionali drenanti linfonodi mesenterici (MLN). I siti dell'effettore consistono della lamina propria (LP), che è il tessuto connettivo sotto la membrana dello scantinato e l'epitelio intestinale, uno strato unicellulare si trova sopra la membrana dello scantinato che contiene linfociti intraepiteliali (IEL). I linfociti sono giocatori importanti dell'immunità adattativa che mediano protezione contro infezioni e tumori e possono anche contribuire all'immunopatologia nelle malattie infiammatorie. È importante e altamente pertinenti per lo studio dei linfociti in questi distinti compartimenti anatomici mucosi per meglio capire le loro funzioni di induzione ed effettrici.
Un protocollo relativamente semplice e unificato per l'isolamento dei linfociti da questi compartimenti è necessario in quanto il numero di investigatori esplorare immuni eventi che si verificano nell'intestino stanno accelerando. Diversi gruppi di ricerca hanno pubblicato protocolli che condividono diversi processi simili per isolare le cellule immuni dal mouse piccoli scomparti intestinale3,4,5,6,7 . Tuttavia, ci sono parecchie differenze tecniche fra loro a seconda lo stato attivo del protocollo individuale. Ad esempio, con l'attenzione per isolare le cellule immuni dal LP, un protocollo esamina l'impatto di vari digestioni enzimatiche sulla vitalità cellulare, espressione del marcatore di superficie delle cellule e la composizione delle cellule immunitarie isolato5. Un altro protocollo evidenzia un metodo rapido e riproducibile per l'isolamento dei linfociti senza densità centrifugazione6. Infine, specifici protocolli esistono anche allo scopo di isolare i fagociti mononucleari dagli strati differenti del tessuto del piccolo intestino7. Qui, un protocollo altamente riproducibile che consente l'isolamento sequenza delle popolazioni del linfocita dal vano MLN, PP, LP e IEL di piccolo intestino è presentato.
Ci concentriamo su isolare popolazioni altamente purificate dai comparti LP e IEL, che sono in gran parte privi di contaminanti da altri compartimenti intestinale. Questo ampiamente utilizzato protocollo produce un'alta resa dei linfociti al massimo puri e praticabile entro tempi accettabili vincoli4,8,9,10,11,12. Questo protocollo garantisce anche l'isolamento dei linfociti dal vano LP e IEL con minima contaminazione compartimentali, permettendo una buona fede opportunità studiare i linfociti in questi compartimenti distinti. I linfociti isolati possono essere sottoposti a ulteriori manipolazioni come analisi cytometric di flusso o analisi funzionale. Questo protocollo è applicato con successo per l'isolamento dei linfociti da mouse piccolo intestino e del colon durante infezioni batteriche come la Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriume Yersinia pseudotuberculosis infezioni e patologie infiammatorie come la colite indotta da chimica e patogeno. Questo protocollo è utilizzabile anche per isolare cellule dell'immunità innata quali le cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili e monociti da mouse piccolo intestino e del colon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:712px;" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G3126-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15710-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">21870-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">10x Hanks&#39; balanced salt solution</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4641-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9680-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calsium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>21108-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase, Type I</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>17100-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">DG gradient stock solution (Percoll)&#160;</td>
			<td style="width:123px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Biolegend</td>
			<td style="width:119px;">420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70-&#181;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erlenmeyer flask&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Kimble</td>
			<td style="width:119px;">26500R-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Magnetic stirrer</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50094596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Stir bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-512-148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating lymphocytes from the mouse small intestinal immune system

Il sistema immunitario intestinale svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della funzione di barriera del tratto gastrointestinale generando tollerante responses to antigeni dietetici e batteri commensali durante il montaggio efficaci risposte immunitarie a enteropatogeni microbi. Inoltre, è diventato chiaro che l'immunità intestinale locale ha un impatto profondo sull'immunità distanti e sistemica. Pertanto, è importante studiare come viene indotta una risposta immunitaria intestinale e qual è il risultato immunologico della risposta. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per l'isolamento dei linfociti dal piccolo intestino induttivo siti come il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer e il drenaggio dei linfonodi mesenterici ed effettrici siti come la lamina propria e la epitelio intestinale. Questa tecnica garantisce un isolamento di un gran numero di linfociti dai tessuti intestinali piccole con ottima purezza e vitalità e minima contaminazione trasversale compartimentale all'interno dei vincoli di tempo accettabile. La capacità tecnica per isolare i linfociti e altre cellule immuni da tessuti intestinali permette la comprensione della risposta immunitaria a infezioni gastrointestinali, tumori e malattie infiammatorie.

Una rappresentazione schematica del protocollo è raffigurata (Figura 1). Linfociti all'interno della mucosa intestinale induttivo e siti effettrici distintamente sono organizzati. Peyer di patch (PP) e linfonodi mesenterici (MLN) contengono linfociti nelle aree di cellula T ben organizzate e follicoli di cellule B, mentre l'epitelio intestinale contiene linfociti che sono distribuiti più diffuso. La lamina propria (LP) contiene sia i linfociti diffusamente distribuiti e linfociti contenuti all'interno di strutture linfoidi organizzate come follicoli linfoidi isolati (ILF) e cryptopatches. Ogni compartimento immunitario intestinale è anche caratterizzata da una composizione unica di sottopopolazioni linfocitarie (Figura 2). Il MLN è prevalentemente composto da cellule T αβ (~ 70%), mentre i linfociti PP sono principalmente cellule di B (~ 80%). Composizione del linfocita LP è in gran parte dipendente dalla deformazione ma principalmente composto di cellule T αβ e linfociti B. Distinto da altri comparti intestinale, i linfociti che risiedono nell'epitelio sono principalmente cellule T γδ (~ 60%) e le cellule di T αβ con essenzialmente nessun cellule di B. Proporzioni distinte di sottoinsiemi a cellula T αβ esistono anche all'interno di distinte posizioni anatomiche dell'intestino. Le cellule di T αβ nel LP sono principalmente CD4+ T cellule (~ 70%), mentre CD8α+ T cellule (~ 85%) predominano nel vano di linfociti intraepiteliali (IEL). CD8α+ αβ T cellule entro i compartimenti LP e IEL esprimono l'omodimero di CD8αα o l'eterodimero CD8αβ considerando che induttivo sito CD8α+ αβ T cellule prevalentemente esprimere l'eterodimero CD8αβ (Figura 3). La maggior parte delle cellule T γδ nel vano IEL esprime anche CD8α, mentre T γδ cellule trovate nella mancanza MLN CD8α (Figura 3). Indipendentemente dalla generalità, la composizione delle sottopopolazioni linfocitarie può variare tra diversi ceppi di topi e può diventare alterata con l'età o la malattia. Come tale, deve essere eseguita un'attenta analisi delle popolazioni linfocitarie all'interno della mucosa intestinale allo steady-state nel ceppo di sfondo utilizzato per le manipolazioni sperimentali.
Rendimento delle celle può variare notevolmente a seconda del ceppo e l'età dei topi e condizioni sperimentali utilizzate. Cellule singole, dal vivere possono essere contate su un emocitometro o una macchina per contare cella automatizzata usando l'esclusione del blu di trypan. Il numero dei linfociti è calcolato come: Cell count × CD45+ celle (%) in Gate 3 × linfociti (%) in Gate 4 (Figura 2). Circa 15 × 106 MLN i linfociti, i linfociti di 5-10 × 106 PP, 2-5 × 106 LP linfociti e 3-6 × 106 IEL possono essere ottenuti da un mouse C57Bl/6 o Balb/c di 8 a 12-week-old ingenuo. In alternativa, basata su flusso di conteggio perline può essere utilizzato per quantificare le popolazioni delle cellule con l'avvertenza che la perdita delle cellule si verifica durante il processo di colorazione. In definitiva, coerenza nella tecnica di conteggio deve essere mantenuta all'interno del laboratorio per garantire che i paragoni adeguati possono essere fatta attraverso esperimenti.
In questo protocollo, DTE trattamento viene utilizzato per arricchire IEL, che è seguita da trattamento di EDTA per rimuovere IEC per isolamento ottima dei linfociti altamente arricchiti. Sono sufficienti per isolare due DTE trattamenti > 95% di IEL. Un numero molto piccolo di linfociti può anche essere trovato nel trattamento EDTA. Questi linfociti assomigliare ad una miscela dei linfociti IEL e LP (Figura 4). Inoltre è stato effettuato un confronto del trattamento di DTE e trattamento combinato di DTE-EDTA per isolare IEL. Trattamento combinato di DTE-EDTA aumenta la contaminazione di IEC nella preparazione IEL (Figura 5) e riduce la resa finale delle cellule immuni dal vivo dopo centrifugazione in gradiente di densità. Centrifugazione in gradiente di densità è consigliabile isolare i linfociti dai comparti intestinali. Rimuove le cellule morte, molte cellule epiteliali e muco, promuovere l'isolamento dei linfociti altamente arricchiti e diminuendo drasticamente il flusso cytometry acquisizione volte (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig1.jpg"> Figura 1 . Diagramma di flusso del protocollo di isolamento. DTE, dithioerythritol. EDTA, acido etilendiamminotetraacetico. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig2.jpg"> Figura 2 . Un flusso cytometry gating strategia per popolazioni linfocitarie da tessuti intestinali. Sospensioni di cellule singole preparate dai linfonodi mesenterici (MLN), propria di lamina (LP), patch (PP) di Peyer e vano linfociti intraepiteliali (IEL) erano macchiate con tintura di attuabilità risolvibile (ad es. Live/Dead) e le seguenti gli anticorpi fluorescenti-etichetta: cellule CD45 per l'identificazione delle cellule ematopoietiche, CD19 per le cellule B, CD3ε per T, T-cell receptor (TCR) β per cellule αβ T, TCRδ per le cellule T γδ, CD8α per CD8α+ αβ T cellule e CD4 per CD4+ cellule αβ T. Porta 0 ha mostrato avanti scatter (FSC) - A/side scatter (SSC) - A proprietà. Cancello 1 identificato cellule singole. Cancello 2 identificato cellule vive. Gate 3 identificato cellule ematopoietiche. Linfociti cancello 4 identificato in base alle proprietà di FSC-A/SSC-A. Cancello 5 identificato le cellule di T e linfociti B. Cancello 6 identificati αβ T cellule e cellule T γδ tra cellule di T totali. Gate 7 identificato CD8α+ e CD4+ T cellule nella popolazione delle cellule T αβ. Percentuali (in carattere di colore rosso) all'interno di trame pseudocolor corrispondono alla frequenza di cellule all'interno del cancello indicato nella precedente popolazione parentale. Porta 0 e porta 1 visualizzare eventi totali. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig3.jpg"> Figura 3 . Il fenotipo ofCD8α+ αβ T cellule e T γδ cellule in tessuti intestinali. L'espressione di CD8β di CD8α+ αβ T cellule e l'espressione di CD8α dalle cellule T γδ sono raffigurati. Percentuali (in carattere di colore rosso) all'interno di istogrammi corrispondono alla frequenza di cellule che esprimono il marcatore indicato tra la popolazione parentale indicato. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig4.jpg"> Figura 4 . La composizione dei linfociti dai trattamenti DTE, EDTA e della collagenosi. La strategia di gating parentale è lo stesso come in Figura 2. Cancello 5 identificato le cellule di T e linfociti B. Cancello 6 identificati αβ T cellule e cellule T γδ tra cellule di T totali. Gate 7 identificato CD8α+ e CD4+ T cellule nella popolazione delle cellule T αβ. Percentuali (in carattere di colore rosso) all'interno di trame pseudocolor corrispondono alla frequenza di cellule all'interno del cancello indicato nella precedente popolazione parentale. Linfociti dall'isolamento di EDTA hanno somiglianza con una miscela di IEL e LP linfociti isolati da trattamenti DTE e la collagenosi, rispettivamente. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig5.jpg"> Figura 5 . Un confronto del trattamento di DTE e trattamento combinato di DTE-EDTA per l'isolamento di IEL. DTE trattamento è stato effettuato secondo questo protocollo. IEL sono stati raccolti dopo trattamenti di DTE e prima del trattamenti di EDTA. Trattamento combinato di DTE-EDTA è stato effettuato alle stesse concentrazioni utilizzate in questo protocollo, ma allo stesso tempo. Le proprietà di FSC-A/SSC-A, redditività e la percentuale di CD45+ cellule ematopoietiche sono mostrate. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57281/57281fig6.jpg"> Figura 6 . L'impatto della centrifugazione di pendenza di densità sulla purezza delle preparazioni dei linfociti IEL e LP. Sospensioni di singola cellula isolate secondo questo protocollo sono sottoposto a centrifugazione in gradiente di densità o l'analisi mediante citometria a flusso direttamente. Le proprietà di FSC-A/SSC-A, redditività e la percentuale di CD45+ cellule ematopoietiche sono mostrate. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57281/57281fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

Isolando i linfociti del sistema immunitario intestinale piccolo per Mouse

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti dai siti induttivi tra cui il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer ed i linfonodi mesenterici drenanti e i siti di effettrici tra la lamina propria e la epitelio intestinale del piccolo sistema immunitario intestinale.

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

52.3K Views.  Stony Brook University. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento dei linfociti dai siti induttivi tra cui il tessuto linfoide associato all'intestino di Peyer ed i linfonodi mesenterici drenanti e i siti di effettrici tra la lamina propria e la epitelio intestinale del piccolo sistema immunitario intestinale.

Video: Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

Isolamento e caratterizzazione citometria a flusso di Murine Piccolo intestinale Linfociti

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has a broad spectrum of applications. Detection of antigens allows for characterization and identification of multiple cell types. Located above the kidneys and encapsulated by a layer of mesenchymal cells, the adrenal gland is an endocrine organ composed by two different tissues with different embryological origins, the mesonephric intermediate mesoderm-derived outer cortex and the neural crest-derived inner medulla. The adrenal cortex secretes steroids (i.e., mineralocorticoids, glucocorticoids, sex hormones), whereas the adrenal medulla produces catecholamines (i.e., adrenaline, noradrenaline). While conducting adrenal research, it is important to be able to distinguish unique cells with different functions. Here we provide a protocol developed in our laboratory that describes a series of sequential steps required for obtaining immunofluorescence staining to characterize the cell types of the adrenal gland. We focus first on the dissection of the mouse adrenal glands, the microscopic removal of periadrenal fat followed by the fixation, processing and paraffin embedding of the tissue. We then describe sectioning of the tissue blocks with a rotary microtome. Lastly, we detail a protocol for immunofluorescent staining of adrenal glands that we have developed to minimize both non-specific antibody binding and autofluorescence in order to achieve an optimal signal.

Here we present a method to isolate adrenal glands from mice, fix the tissues, section them, and perform immunofluorescence staining.

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;