Ringraziamo Yohei Yamauchi e Roberta Mancini per averci fornito i reagenti. Il laboratorio AH è stato sostenuto dalle reti di formazione iniziale Marie Curie (ITN), il Consiglio europeo della ricerca (CER), e dal Fondo Nazionale Svizzero (Sinergia).

1. Preparazione di Tamponi e soluzioni madre <ol><li> Preparare tampone MNT (20 mm MES, 30 mM Tris e 100 mm NaCl) sciogliendo 470 mg Tris cloridrato, 390 mg MES idratare e 580 mg di NaCl in 80 ml ​​di DDH 2 O. Regolare il buffer a pH 7,4 e portarlo ad un volume finale di 100 ml con DDH 2 O. </li><li> Preparare tre soluzioni identiche di 500 tampone mM MES sciogliendo 9,76 g MES idrato in 80 ml ​​di dH 2 O ciascuno. Regolare i buffer a pH 5.8, 5.4 e 5.0, rispettivamente per titolazione con NaOH concentrato. Portare ogni buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O. </li><li> Preparare due soluzioni identiche di 500 tampone Tris mM sciogliendo 7.88 g Tris cloridrato in 80 ml ​​dH 2 O ciascuno e regolare il pH a rispettivamente 7,4 e 6,4,, per titolazione con HCl concentrato. Portare il buffer ad un volume finale di 100 ml con dH 2 O. </li><li> Preparare la soluzione di glicerolo al 50% in DH 2 O e mescolare bene fino a quando il GLYCErol è omogeneamente misto. Filtrare la soluzione attraverso un gruppo di filtraggio Steritop (0,22 micron dimensioni dei pori) in una bottiglia di vetro. </li><li> Preparare soluzione al 10% NP-40 e 1 M NaCl in DH 2 O. </li><li> Preparare 25x inibitore della proteasi concentrata sciogliendo due compresse in 4 ml DDH 2 O. </li></ol> 2. Preparazione di glicerolo gradienti <ol><li> Preparare 5 ml di detersivo maestro tampone mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x concentrata inibitori della proteasi) soluzione per ogni condizione di pH a prova (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). A questo scopo, mescolare 9 ml di 1 M NaCl, 6 ml di 10% NP-40, 2,4 ml di inibitore della proteasi archivio 25x e 9 ml DDH 2 0. </li><li> Per ogni condizione di pH pipetta 4,4 ml di master mix in un tubo conico da 50 ml. </li><li> Per i valori di pH superiori a 5.8 aggiungere 0,6 ml del rispettivo pH aggiustato soluzione 500 mM Tris magazzino al tubo. Per pH 5,8 ed inferiore aggiungere 0,6 ml della rispettiva soluzione stock di 500 mm MES pH modificato. </li><li> Fare 5ml di soluzione tampone contenente 300 mM NaCl, inibitore della proteasi 2x, 60 mM Tris a pH 7,4 e DDH 2 O. Questo servirà come il buffer di controllo del gradiente senza detersivo. </li><li> Se necessario, fine-regolare il pH delle soluzioni a pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 e 5.0 aggiungendo soluzioni HCI o NaOH concentrati rispettivamente. </li><li> Aggiungere 5 ml di stock di glicerolo 50% a 5 ml della miscela tampone detergenti contenenti e senza detergenti risultanti in sei diverse soluzioni di glicerolo 25%. Verificare i valori di pH utilizzando strisce indicatrici pH. NOTA: Nel caso in cui il pH misurato differisce significativamente dal valore desiderato, le rispettive soluzioni dovrebbero essere preparate di nuovo. </li><li> Preparare la soluzione di glicerolo al 15% mescolando 50% stock di glicerolo con dH 2 O in un rapporto 3: 7. </li></ol> 3. Ultracentrifugazione di IAV <ol><li> Aggiungere 3 ml di soluzione di glicerolo al 15% in tubi centrifugazione ultra chiare (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) utilizzando una siringa da 5 ml e una neeDLE (21 G, 9 cm di lunghezza). Non lasciare gocce alla parete interna del tubo in quanto questo potrebbe disturbare l&#39;integrità del gradiente. Ripetere questo per un totale di sei tubi centrifugazione, uno per ciascuna delle cinque condizioni di pH per testare e uno per il campione di controllo. </li><li> Posizionare con cura soluzione di glicerolo 3,4 ml di 25% sotto il livello di glicerolo 15% utilizzando una siringa da 5 ml e un lungo ago. Fare attenzione a non mescolare i due strati. Ripetere questa operazione per tutte le sei condizioni per testare con le rispettive soluzioni di glicerolo pH regolato. NOTA: Il lavoro in classe II biosicurezza cabinet per i seguenti passaggi. </li><li> sovrapporre delicatamente i gradienti di glicerolo con 30 ml chiarito liquido allantoico contenente IAV (X31, H3N2) diluito in 1 ml MNT tampone (corrisponde a circa 20-30 mg di proteina virale totale) per ogni sfumatura. </li><li> Equilibrio opposte tubi e metterli in un rotore ultracentrifugazione SW41. Centrifugare per 150 min, a 55.000 xg, e 12 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, accuratamenteRimuovere il surnatante, cioè, entrambi gli strati glicerolo utilizzando una pipetta Pasteur pulita e un aspiratore. Risospendere il pellet in 40 microlitri (1x) non riducenti tampone campione LDS. E &#39;importante pipettare su e giù più volte per sciogliere completamente il pellet. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li></ol> 4. SDS-PAGE di pellet frazioni e Coomassie colorazione <ol><li> Riscaldare tutti i campioni a 95 ° C per 10 min. A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 ° C finché non vengono analizzati mediante SDS-PAGE. </li><li> Carico 20 ml di pellet disciolti SU UN gradiente di pre-cast (4-12%) mini gel Bis-Tris e corrono per 1 ora a 200 V in 1x MOPS SDS tampone di corsa. </li><li> Fai la soluzione fissazione con il 40% di metanolo e acido acetico glaciale al 10% in DDH 2 O. </li><li> Incubare il gel in soluzione di fissaggio per 1 ora e macchiare notte in un 15 centimetri piatto di coltura cellulare con un volume sufficiente di soluzione colloidale Coomassie mentre delicatamenteagitazione a temperatura ambiente. NOTA: È importante chiudere il piatto in modo da evitare l&#39;evaporazione della soluzione colorante. </li><li> Decolorare il gel in DDH 2 O. Sostituire il DDH 2 O ogni 15-20 minuti fino a quando il fondo del gel diventa chiaro. Conservare il gel in DDH 2 O a 4 ° C fino a quando non viene sottoposto a scansione per la banda quantificazione. </li><li> Eseguire la scansione del gel ad alta risoluzione e di utilizzare il software disponibile o su misura commercialmente per la quantificazione di intensità di banda proteine. Sottrarre il segnale di fondo da una regione vicino alle rispettive bande e normalizzare questi valori per i campioni di controllo senza detergente (a pH 7,4). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

capsids virali sono metastabili complessi macromolecolari. Durante il montaggio del virioni richiede l&#39;incapsidamento e condensazione del genoma del virus, l&#39;inizio del prossimo ciclo di infezione dipende lo smontaggio di tale struttura capside compatta. I virus sono evoluti per sfruttare vari meccanismi cellulari per controllare il ciclo di verniciatura-uncoating, inclusi recettori cellulari, accompagnatori, enzimi proteolitici, forze fisiche fornite da proteine ​​motrici o helicases nonché pH e interruttori ionici 26,27. Qui, descriviamo un metodo in vitro sulla base di una centrifugazione glicerolo sfumatura per testare specificamente l&#39;effetto dei fattori che promuovono il disassemblaggio del nucleo IAV. La tecnica può essere potenzialmente adattato per sezionare i processi uncoating di altri virus con involucro. Utilizzando colloidale Coomassie, le principali proteine ​​strutturali IAV M1, NP, e HA può essere chiaramente individuato in SDS-PAGE anche con una relativamente piccola partic virusnumero di Le. Tuttavia, una caratterizzazione più approfondita della struttura capside sedimentato e la sua composizione richiederebbe follow-up analisi, ad esempio microscopia elettronica (come precedentemente presentata 28), Western blotting, light scattering dinamico o spettrometria di massa. Ulteriore estensione del protocollo potrebbe includere frazionamento (25%) Fase glicerolo inferiore e l&#39;analisi dei componenti principali specifici. Regolazione dello strato glicerolo inferiore per la fusione pH ottimale di 5,0 (per X31) ha portato ad una dissociazione quasi completa dello strato di matrice (Figura 2) 16. Tuttavia, circa il 30% del segnale NP ingresso può essere rivelato a questo pH. E &#39;possibile che a causa della assenza di fattori uncoating cellulari in questa configurazione, come recentemente identificato istone deacetilasi 6 (HDAC6) 18, si verifica lo smontaggio incompleta. All&#39;interno della cellula, lenta acidificazione del nucleo virale e l&#39;esposizione ad un interruttore da Na + a K + </sup&gt; innesca il virus per la completa liberazione vRNP controllata da uncoating Fattori 16. Non possiamo escludere che nel nostro setup, il detergente non ionico interrompe parzialmente il nucleo acido-esposti e destabilizzato. Tuttavia, nessun effetto sul nucleo sedimenta a pH neutro è osservata indicato da simili intensità di banda proteica rispetto ai campioni non solubilizzato (Figura 2A, confrontare corsie 1 e 2). Sebbene, il saggio qui presentato dimostrato di essere altamente riproducibili e (come tale è) abbastanza robusto per banda quantificazione, potrebbe essere osservato un certo campo di variazione. L&#39;uso di glicerolo in questo protocollo è fondamentale per il risultato dell&#39;esperimento. Come precedentemente riportato 17, ultracentrifugazione attraverso un gradiente di saccarosio destabilizza il nucleo IAV, che è probabilmente dovuto ad una elevata forza osmotica creato da saccarosio. Purificazione di IAV tramite gradienti di saccarosio potrebbe esercitare effetti simili. Perciò abbiamo confrontato uovo-grown X31 derivato da cl<html> arified liquido allantoico e le scorte di saccarosio-purificata. Nessuna differenza importante potrebbe essere osservato rispetto alla influenza del pH acido sulla stabilità di base (dati non mostrati). Tuttavia, al fine di escludere i potenziali effetti collaterali del saccarosio osmoticamente attiva, si consiglia di eseguire il test in vitro uncoating con chiarito allantoidea supernatanti di coltura cellulare fluidi o concentrati. Inoltre la scelta del materiale di gradiente, è importante mantenere l&#39;integrità del gradiente di non influenzare il comportamento sedimentazione dei nuclei virali lisati e garantire risultati riproducibili. Inoltre, risospensione incompleta della frazione pellet dopo ultracentrifugazione probabile conduce a risultati diversi. Infine, suggeriamo vivamente regolando il pH delle soluzioni tampone detergenti contenenti idealmente lo stesso giorno dell&#39;esperimento come piccoli cambiamenti nella concentrazione ionica potrebbero avere un effetto drastico sulla stabilità nucleo virale. content &quot;&gt; E &#39;importante notare che a seconda del ceppo particolare IAV, efficienze diverse smontaggio potrebbero verificarsi in base alle proprietà del rispettivo M1 e NP varianti. Ciò può valere anche per virus mutanti. Quindi, soglie pH per strato di matrice e vRNP la dissociazione devono essere determinati per la rispettiva ceppo IAV prima di testare ulteriori influenze. per l&#39;analisi delle condizioni specifiche in materia di stabilità del nucleo virale suggeriamo la regolazione del livello di glicerolo inferiore per un valore di pH in modo da ottenere lo smontaggio della metà-massimale di M1. E &#39;possibile per studiare l&#39;influenza degli ioni specifici o agenti riducenti modificando il livello di detergente contenente conseguenza. putativi fattori uncoating cellulari possono essere aggiunti direttamente al gradiente di glicerolo. In caso di fattori citoplasmatici, un terzo strato di glicerolo al fondo del gradiente potrebbe essere introdotto, che viene portata a pH neutro, contiene il fattore cellulare di interesse, ed è libero di detersivo. In questo modo, the tre strati gradiente sarebbe ancora più strettamente imitare il passaggio del virus attraverso il sistema endocitico e rilascio di segmenti genici nel citoplasma neutra. Nel loro insieme, vi presentiamo un semplice ma robusto test in vitro per studiare IAV adescamento e uncoating, che ha il potenziale per modifiche versatili al fine di affrontare diverse questioni nel contesto di entrata IAV. Inoltre, può essere applicato per studiare processi di ingresso di altri virus incapsulati con meccanismi uncoating correlate.

Virus influenzale A (IAV) è un virus con involucro e appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae. I suoi geni sono codificati su un segmentato, negativo-senso e di genoma a singolo filamento di RNA. Negli esseri umani, IAV provoca infezioni respiratorie, che si verificano in epidemie stagionali e porta il potenziale di pandemie globali 1. Al legame con residui di acido sialico sulla superficie della cellula ospite 2, IAV è internalizzata per endocitosi clatrina-dipendente e le vie clatrina-indipendenti 3-8. L&#39;acido ambiente (pH &lt;5,5) nei vacuoli endocitici innesca un importante cambiamento conformazionale della IAV picco glicoproteina emoagglutinina (HA), che si traduce in fusione del virale e la fine della membrana 9 endosomal. Una volta che il capside IAV (qui noto anche come &quot;core&quot; virale) è sfuggito da endosomi ritardo (LES), è non rivestito nel citosol seguito dal trasporto dei ribonucleoproteine ​​virali (vRNPs) nel nucleo - il sito oreplicazione del virus F e trascrizione 10-13. Prima all&#39;attivazione acido HA del virus subisce una progressiva diminuzione del pH nel sistema endocitico, che innesca il nucleo per il suo successivo smontaggio 14-16. In questo &quot;priming&quot; passo i canali ionici M2 nella membrana virale mediare l&#39;afflusso di protoni e K +10,14,16. La variazione della concentrazione ionica nell&#39;interno virus disturba le interazioni costruire dal virale proteine ​​della matrice M1 e gli otto vRNP fascio, e facilita IAV uncoating nel citoplasma seguente fusione della membrana 10,14-17. Analisi diretta e quantitativa della fase di caricamento è stata ostacolata dal fatto che endosomi sono di difficile accesso sperimentalmente. Il processo di inserimento è inoltre altamente non sincrono. Inoltre, i test end-point, come qRT-PCR di misure di RNA o di infettività virale rilasciate, non forniscono un quadro dettagliato sullo stato biochimico del Capsi viraled in qualsiasi punto di entrata. Mentre perturbazione di endosomi di siRNA o trattamento farmacologico ha contribuito in modo significativo alla comprensione della IAV ingresso 18-20, messa a punto è difficile e soggetta a effetti collaterali non specifici nel programma endosome maturazione strettamente controllato. Per evitare questi problemi, abbiamo adattato un protocollo precedentemente sviluppato in vitro basato sull&#39;uso di gradiente di velocità di centrifugazione 17. A differenza di altri tentativi di 21,22, 23,24, che sono stati in gran parte basati su combinazioni di taglio proteolitico e il trattamento detergente seguita da analisi EM, questo approccio ha consentito un risultato facilmente quantificabile. Centrifugazione attraverso diversi strati gradiente permette alle particelle di sedimentazione per essere esposti e reagiscono con mutevoli condizioni in modo controllato. Nel protocollo presentato, IAV derivato dal liquido allantoico chiarito o particelle virali purificate sedimentate in una glicerolo a due stratigradiente in cui lo strato inferiore contiene il detergente non ionico NP-40 (Figura 1). Come il virus entra nel secondo strato, detergenti contenenti, i lipidi busta e busta glicoproteine ​​virali sono delicatamente solubilizzate e lasciati alle spalle. Il nucleo, composto da otto vRNP fascio e circondato da uno strato di matrice, sedimenti come una struttura stabile nella frazione pellet. proteine ​​essenziali virali, quali M1 e nucleoproteina vRNP-associato (NP), possono essere identificati in pellet mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie. In particolare, approfittando di gel gradiente disponibili in commercio e colorazione con l&#39;colloidale altamente sensibile Coomassie 25, permette alta precisione e rilevamento di quantità anche minime di proteine ​​essenziali associate virali. Questo pone le basi per testare se le condizioni diverse, come il pH, la concentrazione di sale, e fattori uncoating putativi avere effetto sul comportamento di sedimentazione delle componenti di base e il nucleo stabil<html> lità. A questo scopo, solo il strato detergenti contenenti più bassa nel gradiente di glicerolo viene modificato introducendo il fattore o condizione di interesse. La tecnica è stata particolarmente prezioso nelle indagini l&#39;effetto di differenti valori di pH e concentrazioni saline sull&#39;integrità del nucleo IAV 16. Passi intermedi di IAV uncoating potrebbero essere monitorati compresa dissociazione dello strato di matrice a pH leggermente acido (&lt;6.5) seguita da vRNP dissociazione a pH 5,5 ed inferiore 16,17 (figura 1). Quest&#39;ultima fase è stata ulteriormente potenziata dalla presenza di alta K + concentrazione nello strato di glicerolo, riflettendo un ambiente ritardo endocytic 16. Così, come il virus e il nucleo sedimentate attraverso il gradiente hanno sperimentato un ambiente che cambia che imita le condizioni in endosomi. Il risultato è stato uno smontaggio graduale del nucleo virale in vitro, integrando i risultati derivati ​​da test di biologia cellulare. t &quot;&gt; Il metodo presentato qui ha permesso veloce e analisi altamente riproducibile di IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) uncoating innescato da pH acido e aumentando K +16,17 così come lo smontaggio di core paramyxovirus su esposizione pH alcalino 17. Non si può escludere che l&#39;approccio può essere adattato ad altri virus con involucro di acquisire conoscenze in proprietà biochimiche della struttura del capside virale e capside smontaggio durante l&#39;immissione delle cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1103">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">cOmplete&#8482;, EDTA-free protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">11873580001</td>
			<td style="width:473px;">The stock solution can be stored at 2 to 8 &#176;C for 1 to 2 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol anhydrous BioChemica</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Now commercially available as IGEPAL&#174; CA-630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; LDS sample buffer (4X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; MOPS SDS running buffer (20X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH indicator strips, pH 4.0 - 7.0</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodiumhydroxide</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steritop&#8482; filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid</td>
			<td>Virapur</td>
			<td></td>
			<td>Freshly thawed on 4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro disassembly of influenza a virus capsids by gradient centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Come già discusso, adescamento in endosomi è necessario per rendere il nucleo IAV uncoating competente. Protonazione del nucleo indebolisce interazione di M1 e vRNPs (composto di RNA virale, NP, e la polimerasi PB1 complesso / PB2 / PA). è iniziato questo processo quando il virus in arrivo è esposto ad un pH di 6,5 (o inferiore) in endosomi precoci (SEO) e continua fino a quando i fusibili virus in giro pH 5.0 a Les. Per simulare la diminuzione del pH, lo strato inferiore dei gradienti di glicerolo sono stati adeguati valori compresi tra pH 7,4 e 5,0 ad una concentrazione di sale costante. X31 derivato dal liquido allantoico chiarificato è stato sottoposto a gradiente di velocità di centrifugazione e analizzati mediante SDS-PAGE (Figura 2A, B). Senza detersivo presenti nel gradiente (Figura 2A, lane1) virioni intatti sono in pellet, come risulta dal pattern caratteristicobande rappresentano HA (HA1 e HA2, 63 kDa), NP (56 kDa), e M1 (27 kDa) nella Coomassie macchiati gel. Dal momento che il gel è stato eseguito in condizioni di non ridurre, HA1 proteolytically spaccati e HA2 sono ancora collegati da legami disolfuro e corrono a circa 64 kDa. In condizioni riducenti la banda della HA1 e HA2 apparirebbero molto vicino alle bande NP e M1 rispettivamente, rendendo difficile interpretare fedelmente e determinare intensità di banda che sono esclusivamente derivate dal nucleo virale (Figura 2B). Dopo aggiunta di NP-40 verso il basso (25%) di glicerolo strato dell&#39;involucro virale compreso HA, NA e M2 sono stati solubilizzati e il nucleo virale sola sedimentato nel pellet durante ultracentrifugazione (Figura 1; la figura 2, corsia 2). Partendo con un pH inferiore a 6,5, M1 è progressivamente perso dalla frazione pellet, raggiungendo un minimo tra pH 5.8 e 5.4 (Figura2A, B). Sotto pH 5.8 vRNPs erano dissociate e quindi hanno perso dal pellet. In precedenza, è stato dimostrato che, di fatto, vRNPs interi vengono rilasciati nello strato superiore, come loro rilascio correlata con la perdita di PB2 dalla frazione pellet 16. Intensità banda proteica sono stati determinati, rivelando due soglie distinte pH per lo smontaggio dello strato M1 e la dissociazione dei fasci vRNP, rispettivamente (figura 2). bande addizionali potrebbero essere osservati sul gel, che potrebbe corrispondere alla proteine ​​polimerasi PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa), e M2 (11 kDa). Grazie alla loro numero di copie inferiori all&#39;interno virioni IAV non siamo riusciti a determinare in modo affidabile la loro identità e non erano di conseguenza preso in considerazione per la quantificazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig1.jpg" /> Figura 1: Rappresentazione schematica del IAV <em&gt; in vitro lo smontaggio di base. Brevemente, le particelle virali purificate vengono caricati su un gradiente di glicerolo due fasi. Lo strato inferiore contiene il detersivo NP-40 ed è regolato alla concentrazione pH e sale desiderato mentre lo strato superiore, privo di detergente viene mantenuta ad una concentrazione pH e sale costante. A seconda della condizione nello strato glicerolo inferiore, core virale completa sedimentare sul fondo (1) o sono dissociate e rimangono nello strato glicerolo (2). pH neutro porta alla sedimentazione dei nuclei virali intatte composti da M1 e vRNPs. Condizioni favorevoli per uncoating, come pH acido (5.0), si traduce in dissociazione dei componenti fondamentali virali e quindi la perdita dalla frazione pellet. Dopo ultracentrifugazione, surnatanti glicerolo vengono rimossi e pellet vengono analizzati mediante SDS-PAGE. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53909/53909fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </<html> p&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig2.jpg" /> Figura 2: IAV nucleo smontaggio in vitro su acidificazione (A) In vitro smontaggio di core X31 in diverse condizioni di pH nello strato glicerolo inferiore.. Come controllo, NP-40 è stato omesso dallo strato inferiore glicerolo (prima corsia). I campioni sono stati separati mediante SDS-PAGE in condizioni non riducenti seguite da Coomassie colorazione. bande di proteine ​​virali sono indicati sulla destra. (B) densitometrica quantificazione delle intensità delle bande proteiche virali indicate in (A). intensità banda proteica per M1 e NP sono stati normalizzati a quelli a pH 7.4 senza NP-40. I dati sono rappresentati come mezzo di esperimenti duplicati ± deviazione standard (SD). Adattato da Stauffer et al. 2014 16.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

8.9K Views.  ETH Zurich. Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Generazione di influenza da virus ricombinante del DNA plasmidi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizzando Imaging Bioluminescent per Indagare il sinergismo tra Streptococcus pneumoniae E Influenza A virus in topi neonati

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Propagazione in embrionate di pollo Uova

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Panni nasale per l&#39;influenza A rilevazione antivirus e isolamento da Suina

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

Misurazione Attaccamento e internalizzazione del virus A in cellule A549 mediante citometria di flusso

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.

In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

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