Wir danken Yohei Yamauchi und Roberta Mancini für uns mit Reagenzien bereitstellt. Das AH-Labor durch die Marie-Curie Initial Training Networks (ITN), dem European Research Council (ERC), und von der Schweizerischen National Science Foundation (Sinergia) unterstützt wurde.

1. Herstellung von Puffer und Stammlösungen <ol><li> Bereiten MNT - Puffer (20 mM MES, 30 mM Tris und 100 mM NaCl) durch Auflösen von 470 mg Tris - Hydrochlorid, 390 mg MES - ​​Hydrat und 580 mg NaCl in 80 ml ​​ddH 2 O. Stellen Sie den Puffer auf pH 7,4 und bringt es auf ein Endvolumen von 100 ml mit ddH 2 O. </li><li> Bereiten Sie drei identische Lösungen von 500 mM MES - ​​Puffer durch Auflösen von 9,76 g MES - ​​Hydrat in 80 ml ​​dH 2 O je. Stellen Sie die Puffer pH 5,8, 5,4 und 5,0 jeweils durch mit konzentrierter NaOH titriert. Bringen jeder Puffer auf ein Endvolumen von 100 ml mit dH 2 O. </li><li> Bereiten zwei identische Lösungen von 500 mM Tris - Puffer durch Lösen von 7,88 g Tris - Hydrochlorid in 80 ml ​​dH 2 O und jeweils den pH - Wert auf 7,4 und 6,4 jeweils durch mit konzentrierter HCI titriert. Bringen Sie den Puffer zu einem Endvolumen von 100 ml mit dH 2 O. </li><li> Bereiten Sie 50% Glycerin - Lösung in dH 2 O und gut umrühren , bis die glycerol ist homogen vermischt. Filtern der Lösung durch eine Steritop Filtereinheit (0,22 um Porengrße) in eine Glasflasche. </li><li> Herstellung von 10% NP-40 - Lösung und 1 M NaCl in dH 2 O. </li><li> Bereiten 25x konzentrierter Protease - Inhibitor durch Auflösen von zwei Tabletten in 4 ml ddH 2 O. </li></ol> 2. Herstellung von Glycerol Gradients <ol><li> Bereiten 5 ml Detergenspuffer Master Mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x konzentrierte Proteaseinhibitor) -Lösung für jeden pH Zustand Test (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 und 5,0). Zu diesem Zweck mischen 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml des 25x - Protease - Inhibitor Lager, und 9 ml ddH 2 0. </li><li> Für jeden pH Zustand Pipette 4,4 ml der Master-Mix in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Für die pH-Werte über 5,8 addieren 0,6 ml des jeweiligen pH-Wert eingestellten 500 mM Tris-Stammlösung in das Röhrchen. Für pH 5,8 und niedriger 0,6 ml des jeweiligen pH-Wert eingestellten 500 mM MES-Stammlösung hinzufügen. </li><li> Machen 5ml Pufferlösung , enthaltend 300 mM NaCl, 2x - Protease - Inhibitor, 60 mM Tris 7,4 und ddH 2 O auf pH Dies wird als Waschmittel freie Steuerung Gradientenpuffer dienen. </li><li> Falls erforderlich, Feineinstellung der pH der Lösungen auf einen pH von 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 und 5,0 durch Zugabe von konzentrierter HCl oder NaOH Lösungen, respectively. </li><li> 5 ml 50% Glycerin-Stamm bis 5 ml der Waschmittelhaltigen und waschmittelfreie Puffergemische was zu sechs verschiedenen 25% Glycerinlösungen. Überprüfen Sie die pH-Werte von pH-Indikatorstreifen verwendet wird. HINWEIS: Falls der gemessene pH-Wert signifikant von dem Sollwert abweicht, sollten die jeweiligen Lösungen wieder hergestellt werden. </li><li> Vorbereitung 15% Glycerin - Lösung von 50% Glycerin - Vorrats Mischen mit dH 2 O in einem 3: 7 - Verhältnis. </li></ol> 3. Ultrazentrifugation von IAV <ol><li> 3 ml 15% Glycerin-Lösung in extrem klar Zentrifugenröhrchen (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) durch eine 5 ml-Spritze und ein neeDLE (21 G, 9 cm lang). Nicht Tropfen an der Innenwand des Rohres lassen, da dies die Integrität des Gradienten stören. Wiederholen Sie dies für insgesamt sechs Zentrifugenröhrchen, eine für jede der fünf pH-Bedingungen zu testen, und eine für die Kontrollprobe. </li><li> Vorsichtig 3,4 ml 25% Glycerin-Lösung unter der Schicht 15% Glycerin durch eine 5-ml-Spritze und eine lange Nadel. Achten Sie darauf, nicht auf die beiden Schichten mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle sechs Bedingungen mit den jeweiligen pH-Wert eingestellten Glycerinlösungen zu testen. HINWEIS: Die Arbeit in der Klasse II Biosicherheitswerkbank für die folgenden Schritte. </li><li> Overlay sanft die Glycerol-Gradienten mit 30 ul geklärten Allantoisflüssigkeit enthält IAV (X31, H3N2) in 1 ml MNT-Puffer verdünnt (entspricht etwa 20-30 ug Gesamt-Virusprotein) für jeden Gradienten. </li><li> Gleichgewicht gegenüberliegenden Röhren und legen Sie sie in einen SW41 Ultrazentrifugation Rotor. Zentrifuge für 150 min bei 55.000 xg und 12 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation sorgfältigÜberstand verwerfen, dh sowohl Glycerol Schichten durch eine saubere Pasteur - Pipette und eine Saugvorrichtung verwendet. Das Pellet in 40 &amp; mgr; l (1x) nicht reduzierende Puffer LDS Probe. Es ist wichtig zu pipettieren und mehrmals über das Pellet vollständig aufzulösen. Übertragen Sie die Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 4. SDS-PAGE von Pelletfraktionen und Coomassie-Färbung <ol><li> Erhitzen alle Proben bei 95 ° C für 10 min. An diesem Punkt können die Proben bei -20 ° C gelagert werden, bis sie durch SDS-PAGE analysiert. </li><li> Last 20 ul der gelösten Pellets auf einen vorgegossenen Gradienten (4-12%) Bis-Tris-Gel mini und laufen für 1 Stunde bei 200 V in 1x SDS MOPS Laufpuffer. </li><li> Machen Fixierungslösung mit 40% Methanol und 10% Eisessig in ddH 2 O. </li><li> Inkubieren Sie das Gel in Fixierungslösung für 1 Stunde und über Nacht in einer 15 cm Zellkulturschale mit einem ausreichenden Volumen von kolloidalem Coomassie Lösung färben, während sanftSchütteln bei Raumtemperatur. HINWEIS: Es ist wichtig, die Schale zu vermeiden, um die Verdampfung des Färbelösung zu schließen. </li><li> Entfärben des Gels in ddH 2 O. Tauschen Sie die ddH 2 O alle 15-20 min , bis das Gel Hintergrund deutlich wird. Lagern Sie das Gel in ddH 2 O bei 4 ° C bis zur Band Quantifizierung abgetastet wird. </li><li> Scannen Sie das Gel mit hoher Auflösung und verwenden im Handel erhältlich oder maßgeschneiderte Software für die Quantifizierung von Proteinbandenintensitäten. Subtrahieren des Hintergrundsignals von einem Bereich nahe den jeweiligen Bändern und normalisieren diese Werte an die detergensfreien Kontrollproben (bei pH 7,4). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Virale Capside sind metastabile makromolekularer Komplexe. Während Zusammenbau von Virionen, die Einkapselung und Kondensieren des Virusgenoms erfordert, hängt Einleitung der nächsten Runde der Infektion auf die Demontage dieser kompakten Kapsidstruktur. Viren entwickelt haben verschiedene zelluläre Mechanismen zu nutzen , um die Beschichtung-uncoating Zyklus zu steuern, einschließlich der zellulären Rezeptoren, Chaperone, proteolytischen Enzymen, physikalische bereitgestellt Kräfte , die durch Motorproteine ​​oder Helikasen sowie pH und Ionen Schalter 26,27. Hier beschreiben wir ein in vitro - Ansatz basiert auf einem Glycerol - Gradientenzentrifugation spezifisch die Wirkung von Faktoren zu testen , die Demontage des Kerns IAV fördern. Die Technik kann potentiell zum Präparieren uncoating Prozesse anderer umhüllten Viren angepasst sein. Durch die Verwendung von kolloidalem Coomassie, die wichtigsten strukturellen IAV Proteine ​​M1, NP und HA deutlich sogar mit einem relativ kleinen Virus partic in SDS-PAGE nachgewiesen werdenle Nummer. Noch eine weitergehende Charakterisierung der sedimentierten Kapsidstruktur und seine Zusammensetzung erfordern würde Follow-up - Analysen, wie beispielsweise Elektronenmikroskopie (wie zuvor 28 dargestellt), Western Blotting, dynamische Lichtstreuung oder Massenspektrometrie. Weitere Erweiterung des Protokolls könnte Fraktionierung des unteren (25%) Glycerinphase und Analyse der spezifischen Kernkomponenten umfassen. Einstellung der unteren Glycerinschicht auf die optimale Fusions pH von 5,0 (für X31) führte zu einer fast vollständigen Dissoziation der Matrixschicht (2) 16. Jedoch etwa 30% des Eingangs NP Signal kann immer noch bei diesem pH nachgewiesen werden. Es ist möglich , dass aufgrund des Fehlens von zellulärer uncoating Faktoren in dieser Konfiguration wie kürzlich identifizierten Histon - Deacetylase 6 (HDAC6) 18, unvollständige Demontage auftritt. Langsame Ansäuerung des viralen Kern und der Exposition gegenüber einem Wechsel von Na + Innerhalb der Zelle zu K + </sup&gt; Primzahlen das Virus für eine vollständige vRNP kontrollierte Freisetzung von uncoating 16 Faktoren. Wir können nicht ausschließen, daß in unserem Aufbau, der nichtionische Detergens stört teilweise die Säure-exponierten und destabilisiert Kern. Keine Wirkung auf den Kern jedoch bei neutralem pH sedimentierenden wird durch ähnliche Proteinbandenintensitäten auf nicht-solubilisierten Proben im Vergleich angegeben beobachtet (2A, vergleiche Spuren 1 und 2). Obwohl stellte der Test hier erwies sich als sehr gut reproduzierbar und (als solche) robust genug für Band Quantifizierung, eine gewisse Variationsbreite beobachtet werden konnte. Die Verwendung von Glycerin in diesem Protokoll ist für das Ergebnis des Experimentes kritisch. Wie zuvor berichtet , 17, Ultrazentrifugation durch einen Saccharosegradienten destabilisiert das IAV - Kern, der durch Saccharose erzeugt aufgrund eines hohen osmotischen Kraft wahrscheinlich ist. Reinigung von IAV über Saccharosegradienten könnten ähnliche Effekte ausüben. Daher verglichen wir-Ei gewachsen X31 von cl abgeleitet<html> arified Allantoisflüssigkeit und Saccharose-gereinigte Aktien. Keinen großen Unterschied in Bezug auf den Einfluss von saurem pH-Wert auf die Kernstabilität beobachtet werden konnte (Daten nicht gezeigt). Um jedoch mögliche Nebenwirkungen des osmotisch aktive Saccharose auszuschließen, empfehlen wir die Durchführung der in vitro uncoating Assay mit geklärter Allantoisflüssigkeit oder konzentrierten Zellkulturüberstand. Neben der Auswahl der Gradientenwerkstoff ist es wichtig, die Integrität des Gradienten zu halten, um nicht das Sedimentationsverhalten der lysierten viralen Kerne beeinflussen und reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen. Außerdem führt unvollständig Resuspension der Pelletfraktion nach Ultrazentrifugation wahrscheinlich zu unterschiedlichen Ergebnissen. Schließlich empfehlen wir den pH-Wert der Detergenz-haltigen Pufferlösungen idealerweise am selben Tag des Experiments als kleine Änderungen der Ionenkonzentration Anpassung könnte eine drastische Wirkung auf die Viruskernstabilität aufweisen. content &quot;&gt; Es ist wichtig, dass abhängig von der speziellen IAV-Stamm, unterschiedliche Demontage Effizienzen auf die Eigenschaften des jeweiligen M1 und NP-Varianten auftreten. Grundlage beachten Dies könnte auch für die mutanten Viren anzuwenden. So pH Schwellenwerte für die Matrixschicht und vRNP Dissoziation haben vor der Prüfung zusätzliche Einflüsse bestimmt für die jeweilige IAV-Stamm werden. für die Analyse der spezifischen Bedingungen auf viralen Kernstabilität wir den Boden Glycerinschicht auf einen pH-Wert Einstellung vorschlagen, so dass die Hälfte der maximalen Abbau von M1 erreicht wird. Es ist möglich, den Einfluss von spezifischen Ionen oder Reduktionsmitteln zu untersuchen, indem die Reinigungsmittel enthaltende Schicht entsprechend zu modifizieren. Putative zellulären uncoating Faktoren direkt an den Glycerin Gradienten zugegeben werden. im Falle einer cytoplasmatischen Faktoren eine dritte Glycerinschicht am Boden des Gradienten könnte eingebracht, die auf einen neutralen pH-Wert eingestellt ist, enthält das zelluläre Faktor von Interesse, und von Detergens frei. auf diese Weise the dreischichtige Gradienten würde sogar nachahmen enger die Passage des Virus über die endozytischen System und Freisetzung von Genabschnitten in den neutralen Zytoplasma. Zusammengenommen stellen wir eine robuste und dennoch einfach in - vitro - Test IAV - Grundierung und uncoating zu untersuchen, die das Potenzial für vielfältige Modifikationen , um diverse Fragen zu beantworten im Zusammenhang mit der IAV - Eintrag hat. Darüber hinaus kann es Eintrag Prozesse anderer umhüllte Viren mit damit verbundenen uncoating Mechanismen zu untersuchen, werden angewendet.

Influenza - A - Virus (IAV) ist ein umhülltes Virus und gehört zur Familie der Orthomyxoviridae. Seine Gene codiert sind auf einem segmentierten, Negativ-sense und einzelsträngige RNA-Genom. Beim Menschen verursacht IAV Infektionen der Atemwege, die 1 für die globale Pandemien saisonalen Epidemien und trägt das Potential auftreten. Nach Bindung an Sialinsäure-Reste auf der Zelloberfläche 2 wird IAV internalisiert von Clathrin-abhängige Endozytose und Clathrin-unabhängige Wege 3-8. Das saure Milieu (pH &lt;5,5) in den endozytischen Vakuolen löst eine große Konformationsänderung des IAV - Spike - Glykoprotein - Hämagglutinin (HA), die in Fusion des viralen Ergebnisse und die späten endosomalen Membran 9. Sobald die IAV Kapsid (hier auch als virale &quot;Kern&quot; bezeichnet) wurde von späten Endosomen (LEs) entkommen, es in das Cytosol unbeschichtet wird durch den Transport der viralen Ribonukleoproteine ​​gefolgt (vRNPs) in den Kern - die Seite of Virus - Replikation und Transkription 13.10. Vor der Säureaktivierung von HA erfährt das Virus eine allmähliche Abnahme der pH - Wert im endozytischen System, das den Kern für seine spätere Demontage 14-16 Primzahlen. In dieser &quot;Priming&quot; die M2 - Ionenkanäle in der viralen Membran Schritt vermitteln den Zustrom von Protonen und K +10,14,16. Die Veränderung der Ionenkonzentration in dem Virus Innenraum stört die Wechselwirkungen durch das virale Matrix - Protein aufbauen M1 und dem acht vRNP Bündel und erleichtert IAV uncoating im Zytoplasma folgende Membranfusion 10,14-17. Direkte und quantitative Analyse des Priming-Schritt wurde durch die Tatsache erschwert, dass Endosomen schwer experimentell zuzugreifen. Der Eingabeprozess ist außerdem stark nichtsynchron. Zusätzlich Endpunktassays, wie qRT-PCR von freigesetzten viralen RNA oder Infektiosität Messungen bieten nicht ein genaues Bild über die biochemischen Zustand des viralen capsid zu einem bestimmten Schritt des Eintrages. Während Störung von Endosomen durch siRNA oder medikamentöse Behandlung wesentlich zum Verständnis der IAV Eintrag beigetragen hat 18-20, Feinabstimmung ist schwierig und anfällig für unspezifische Nebenwirkungen in der streng kontrollierten endosome Reifung Programm. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine bisher entwickelten in vitro - Protokoll auf der Verwendung von Geschwindigkeits Gradientenzentrifugation 17 basierend angepasst. Im Gegensatz zu anderen Versuchen , 21,22, 23,24, die auf Kombinationen von proteolytischen Spaltung und Detergens - Behandlung meist auf Basis wurden von EM - Analyse verfolgt, ermöglicht dieser Ansatz eine leicht quantifizierbar Ergebnis. Zentrifugation durch verschiedene Gradientenschichten ermöglicht die sedimentierenden Teilchen ausgesetzt werden und reagieren mit den Bedingungen in einer kontrollierten Weise zu verändern. In dem vorgestellten Protokoll IAV abgeleitet von geklärten Allantoisflüssigkeit oder gereinigter Viruspartikel werden in einer zweischichtigen Glycerin sedimentiertGradienten in dem die untere Schicht enthält den nicht-ionischen Detergens NP-40 (Abbildung 1). Da das Virus das zweite, Waschmittel enthaltende Schicht ein, so werden die viralen Lipidhülle und Hüll-Glycoproteine ​​sanft löslich gemacht und hinter sich gelassen. Der Kern, der sich aus den acht vRNP Bündels und durch eine Matrixschicht, Sedimenten als eine stabile Struktur, in der Pelletfraktion umgeben. Virale Kernproteine, wie beispielsweise M1 und vRNP assoziiertes Nukleoprotein (NP), können in dem Pellet durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung identifiziert werden. Insbesondere Vorteil handelsüblichen Gradientengelen unter und Färbung mit dem hochempfindlichen kolloidalen Coomassie 25, ermöglicht eine hohe Genauigkeit und Erfassung von sogar kleinen Mengen der viralen Core-assoziierten Proteinen. Dies stellt die Grundlage für die Prüfung, ob verschiedene Bedingungen wie pH-Wert, Salzkonzentration und mutmaßliche uncoating Faktoren haben Auswirkungen auf das Sedimentationsverhalten von Kernkomponenten und Kern stabil<html> keit. Zu diesem Zweck nur die untere, waschmittelhaltigen Schicht in dem Glycerol-Gradient wird durch die Einführung des Faktors oder der Zustand von Interesse modifiziert. Die Technik ist besonders wertvoll, die Wirkung von verschiedenen pH - Werten und Salzkonzentrationen auf die Integrität des IAV Kern 16 in die Untersuchung. Zwischenschritte des IAV uncoating könnte einschließlich Dissoziation der Matrixschicht anschließend bei leicht sauren pH (&lt;6,5) bei einem pH von 5,5 vRNP Dissoziation überwacht und unteren 16,17 (Abbildung 1). Der letztere Schritt wurde durch die Anwesenheit von hohen K + -Konzentration in der Glycerinschicht verstärkt, einen späten endozytotischen Umgebung widerspiegelt 16. Somit ist, wie das Virus, und der Kern durch den Gradienten sedimentiert erfahren sie einen wechselnden Milieu, das nachahmt Bedingungen in Endosomen. Das Ergebnis war eine schrittweise Demontage des viralen Kern in vitro als Ergänzung Ergebnisse abgeleitet von der Zellbiologie - Assays. t &quot;&gt; Das hier dargestellte Verfahren hat sich schnell aktiviert und hoch reproduzierbare Analyse von IAV (X31 und A / WSN / 33) und IBV (B / Lee / 40) durch sauren pH - Wert ausgelöst uncoating und K +16,17 sowie Demontage zu erhöhen von Paramyxovirus Kerne bei alkalischen pH - Exposition 17. Es ist denkbar, dass der Ansatz kann auch auf andere umhüllte Viren angepasst werden Einblicke in die biochemischen Eigenschaften des viralen Kapsids Struktur und Kapsid Demontage während Zelleintritt zu gewinnen.

<table><tbody><tr><td>cOmplete&amp;trade;, EDTA-free protease inhibitor tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>The stock solution can be stored at 2 to 8 &amp;deg;C for 1 to 2 weeks</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol anhydrous BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Long injection needle (21&amp;nbsp;G, 9 cm, bevel or blunt-end)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Now commercially available as IGEPAL&amp;reg; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10&amp;nbsp;wells, 1.0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS sample buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>pH indicator strips, pH 4.0-7.0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Colloidal Coomassie Stain</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>Sodiumhydroxide</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Steritop filter unit</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2&amp;nbsp;ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid</td><td>Virapur</td><td></td><td>Freshly thawed on 4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

in vitro disassembly of influenza a virus capsids by gradient centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Wie bereits diskutiert, in Endosomen Grundierung erforderlich, um die IAV Kern uncoating kompetent zu machen. Protonierung des Kerns schwächt Wechselwirkung von M1 und vRNPs (zusammengesetzt aus den viralen RNA, NP und die Polymerase-Komplex PB1 / PB2 / PA). Dieser Prozess wird eingeleitet, wenn ankommende Virus zu einem pH-Wert von 6,5 ausgesetzt (oder niedriger) in frühen Endosomen (EBS) und wird fortgesetzt, bis die Virus-Sicherungen bei etwa pH 5,0 in LEs. Um zwischen pH 7,4 und 5,0 bei einer konstanten Salzkonzentration die Abnahme des pH-Werts, die untere Schicht des Glycerins Gradienten wurden auf Werte eingestellt nachzuahmen. X31 von geklärten Allantoisflüssigkeit abgeleitet wurde einer Geschwindigkeit Gradientenzentrifugation und durch SDS-PAGE (2A, B). Ohne Reinigungsmittel , die in dem Gradienten (2A, lane1) sind intakte Virionen pelletiert, wie durch die Kennmuster reflektiert vonBands repräsentieren HA (HA1 und HA2; 63 kDa), NP (56 kDa) und M1 (27 kDa) in der Coomassie gefärbten Gel. Da das Gel unter nicht-reduzierenden Bedingungen laufen gelassen wurde, proteolytisch gespalten HA1 und HA2 noch durch Disulfidbrücken verbunden ist, und bei etwa 64 kDa laufen. Unter reduzierenden Bedingungen würden die Bänder zu HA1 und HA2 entsprechenden erscheinen sehr nahe an den NP und M1 Bands bzw. es schwierig macht , zu treu interpretieren und Bandenintensitäten bestimmen , die allein aus dem viralen Kern (2B) abgeleitet werden. Bei Zugabe von NP-40 auf den Grund (25%) Glycerin Schicht der Virushülle einschließlich HA, NA und M2 wurden solubilisiert und die viralen Kern allein sedimentiert in das Pellet während Ultrazentrifugation (Abbildung 1, Figur 2, Spur 2). Beginnend mit einem pH - Wert unter 6,5, wird M1 allmählich von der Pelletfraktion verloren, die mindestens zwischen pH 5,8 und 5,4 (Abbildung Erreichen2A, B). Unterhalb von pH 5,8 wurden vRNPs dissoziiert und so vom Pellet verloren. Zuvor wurde gezeigt , dass in der Tat, sind ganze vRNPs in die obere Schicht gelöst, da ihre Freisetzung 16 mit dem Verlust von PB2 von der Pelletfraktion korreliert. Proteinbandenintensitäten wurden bestimmt und enthüllt zwei unterschiedliche pH - Schwellenwerte für die Demontage der M1 - Schicht und Dissoziation von vRNP Bündel, bzw. (Abbildung 2). Zusätzliche Bänder können auf dem Gel beobachtet werden, die mit der Polymerase-Proteine ​​PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa) und M2 (11 kDa) entsprechen könnte. Aufgrund ihrer geringeren Kopienzahlen innerhalb der IAV Virionen konnten wir nicht zuverlässig ihre Identität festzustellen und sie wurden daher nicht in Betracht für die Quantifizierung genommen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung des IAV <em&gt; In - vitro - Kern Abbau - Test. Kurz gesagt, werden gereinigte Viruspartikel auf einem zweistufigen Glycerol-Gradienten geladen. Die untere Schicht enthält das Detergens NP-40 und wird auf den gewünschten pH-Wert und Salzkonzentration eingestellt, während die obere, waschmittelfreien Schicht auf einem konstanten pH-Wert und Salzkonzentration gehalten. Je nach dem Zustand in der unteren Schicht Glycerin, vollständige virale Kerne sedimentieren auf den Boden (1) oder dissoziiert werden und verbleiben in der Glycerinschicht (2). Neutralen pH-Wert führt zu einer Sedimentation von intakten viralen Kernen besteht aus M1 und vRNPs. Günstige Bedingungen für uncoating, wie saure pH-Wert (5,0), resultiert in der Dissoziation der viralen Kernkomponenten und damit Verlust aus der Pelletfraktion. Nach Ultrazentrifugation werden Glycerin Überstände entfernt und Pellets durch SDS-PAGE analysiert werden. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53909/53909fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53909/53909fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> </<html> p&gt; <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig2.jpg" /> Abbildung 2: IAV Kern Zerlegung in vitro auf die Versauerung (A) In - vitro - Demontage von X31 Kerne bei verschiedenen pH - Bedingungen in der unteren Schicht Glycerin.. Als Kontrolle NP-40 wurde von der unteren Glycerinschicht (erste Spur) weggelassen. Proben wurden durch SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen, gefolgt von Coomassie-Färbung aufgetrennt. Virale Proteinbanden sind auf der rechten Seite angegeben. (B) Densitometrische Quantifizierung der Intensitäten der viralen Proteinbanden in (A) gezeigt ist . Proteinbandenintensitäten für M1 und NP wurden bei pH 7,4 auf diejenigen normalisierten ohne NP-40. Die Daten werden als Mittel von doppelten Experimenten ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Angepasst von Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

8.9K Aufrufe.  ETH Zurich. Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Serie: In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

Einfach und robust In-vivo- Und In-vitro- Ansatz für das Studium Virusassemblierung

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biologie

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

Montage und Reinigung der Prototyp schaumig Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

Eine effiziente Methode für die Adenovirus-Produktion

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Biotechnik

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

A Streamlined and Standardized Procedure for Generating High-Titer, High-Quality Adeno-Associated Virus Vectors Utilizing a Cell Factory Platform

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. Traditional approaches in research laboratories often involve extensive use of cell culture dishes to cultivate HEK293T cells, a process that can be both laborious and problematic. Here, a unique in-house method is presented, which simplifies this process with a specific cell factory (or cell stacks, CF10) platform. An integration of polyethylene glycol/aqueous two-phase partitioning with iodixanol gradient ultracentrifugation improves both the yield and purity of the generated AAV vectors. The purity of the AAV vectors is verified through SDS-PAGE and silver staining, while the ratio of full to empty particles is determined using transmission electron microscopy (TEM). This approach offers an efficient cell factory platform for the production of AAV vectors at high yields, coupled with an improved purification method to meet the quality demands for in vivo studies.

Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production

As the field of gene therapy continues to evolve, there is a growing need for innovative methods that can address these challenges. Here, a unique method is presented, which streamlines the process of generating high-yield and high-purity AAV vectors using a cell factory platform, meeting the quality standards for in vivo studies.

Ein optimiertes und standardisiertes Verfahren zur Generierung von hochtiternden, qualitativ hochwertigen Adeno-assoziierten Virusvektoren unter Verwendung einer Zellfabrikplattform

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

AAV-Isolierung durch Doppel-Jodixanol-Dichtegradientenzentrifugation

Suspension Culture Production and Purification of Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Centrifugation for In Vivo Applications

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a serotype-agnostic method of purifying AAV first described in 1999. rAAV vectors are widely used in gene therapy applications to deliver transgenes to various human cell types. In this work, the recombinant virus is produced by transfection of Expi293 cells in suspension culture with plasmids encoding the transgene, vector capsid, and adenoviral helper genes. Iodixanol density gradient centrifugation purifies full AAV particles based on particle density. Additionally, three steps are included in this now-ubiquitous methodology in order to increase total virus yield, decrease the risk of precipitation due to contaminating proteins, and further concentrate the final virus product, respectively: precipitation of viral particles from cell media using a solution of polyethylene glycol (PEG) and sodium chloride, the introduction of a second round of iodixanol density gradient centrifugation, and buffer exchange via a centrifugal filter. Using this method, it is possible to consistently achieve titers in the range of 1012 viral particles/mL of exceptional purity for in vivo use.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Adeno-assoziierte Virusisolierung für präklinische Anwendungen

Adeno-associated virus is produced in suspension cell culture and purified by double iodixanol density gradient centrifugation. Steps are included to increase total virus yield, decrease the risk of virus precipitation, and further concentrate the final virus product. Expected final titers reach 1012 viral particles/mL and are suitable for pre-clinical in vivo use.

Herstellung und Aufreinigung von Suspensionskulturen von Adeno-assoziierten Viren durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation für In-vivo-Anwendungen