אנו מודים יוהיי Yamauchi ורוברטה מנצ&#39;יני לספק לנו חומרים כימיים. מעבדת AH נתמכה על ידי רשתות ההדרכה הראשוניות מארי קירי (ITN), מועצת המחקר האירופית (ERC), ועל ידי הקרן הלאומית למדע השויצרי (Sinergia).

1. הכנת חוצצים ופתרונות במלאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ MNT (20 MES מ&quot;מ, 30 מ&quot;מ טריס ו 100 mM NaCl) על ידי המסת 470 מ&quot;ג טריס Hydrochloride, 390 מ&quot;ג מימה MES ו 580 מ&quot;ג NaCl ב 80 מ&quot;ל DDH 2 O. התאם את חיץ pH 7.4 ולהביא אותו לנפח סופי של 100 מ&quot;ל עם DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלושה פתרונות זהים של 500 חיץ מ&quot;מ MES על ידי המסת מימה MES 9.76 גרם 80 מ&quot;ל DH 2 O כל אחד. התאם את מאגרי 5.8 pH, 5.4, ו -5.0, בהתאמה, על ידי titrating עם NaOH המרוכז. תביאו כל חיץ לנפח סופי של 100 מ&quot;ל עם DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני פתרונות זהים של 500 מ&quot;מ טריס חיץ ידי המסת 7.88 גרם טריס הידרוכלוריד ב 80 מ&quot;ל DH 2 O כל ולהתאים את ה- pH ל 7.4 ו -6.4, בהתאמה, על ידי titrating עם מרוכזת HCI. תביאו למאגר לנפח סופי של 100 מ&quot;ל עם DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון גליצרול 50% ב DH 2 O ומערבבים היטב עד glycארול הוא מעורב homogenously. סנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן Steritop (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) לתוך בקבוק זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10% פתרון NP-40 ו 1 M NaCl ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 25x מעכב פרוטאז מרוכז על ידי המסת שתי טבליות ב 4 מ&quot;ל DDH 2 O. </li></ol> 2. הכנת מעברי צבע גליצרול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 5 מיליליטר לערבב חומרי ניקוי החיץ מאסטר (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x מרוכז מעכבי פרוטאז) פתרון עבור כל תנאי pH לבדוק (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, ו -5.0). לשם כך, לערבב 9 מ&quot;ל של 1 M NaCl, 6 מ&quot;ל של 10% NP-40, 2.4 מ&quot;ל של המניה מעכב פרוטאז 25x, ו- 9 מ&quot;ל DDH 2 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל pH מצב pipet 4.4 מ&quot;ל של מיקס מאסטר לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ערכי ה- pH מעל 5.8 להוסיף 0.6 מ&quot;ל של פתרון המניות בהתאמה מותאם pH 500 מ&quot;מ טריס אל הצינור. עבור 5.8 pH והתחתון להוסיף 0.6 מ&quot;ל של פתרון המניות pH המותאמת בהתאמה 500 מ&quot;מ MES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 5מ&quot;ל של תמיסת מאגר המכיל 300 mM NaCl, מעכבי פרוטאז 2x, 60 מ&quot;מ טריס מותאם pH 7.4 ו DDH 2 O. זה ישמש חיץ שיפוע מלא חומר ניקוי חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, עדין לכוונן את ה- pH של פתרונות pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, ו -5.0 ידי הוספת פתרונות HCI או NaOH מרוכז, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של המניה גליצרול 50% עד 5 מ&quot;ל של המכילים חומרי ניקוי וחומרי ניקוי ללא תערובות חיץ וכתוצאה מכך שישה פתרונות גליצרול שונים 25%. בדוק את ערכי ה- pH באמצעות רצועות אינדיקטור pH. הערה: במידה pH נמדד שונה באופן משמעותי מן הערך הרצוי, הפתרונות המתאימים צריכים להיות מוכנים שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון גליצרול 15% על ידי ערבוב 50% מניות גליצרול עם DH 2 O ב 3: יחס 7. </li></ol> 3. ultracentrifugation של IAV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 פתרון גליצרול מ&quot;ל 15% לתוך צינורות צנטריפוגה אולטרה ברור (13.2 מ&quot;ל, 14 מ&quot;מ x 89 מ&quot;מ) באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל ו לביתDLE (21 G, 9 ס&quot;מ). אין להשאיר טיפות על הקיר הפנימי של הצינור, שכן הדבר עלול להפריע את היושרה של השיפוע. חזור על פעולה זו עבור סכום כולל של שישה צינורות צנטריפוגה, אחד עבור כל אחד מחמשת התנאים pH לבדוק ואחד למדגם שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום 3.4 מ&quot;ל 25% פתרון גליצרול מתחת לשכבת גליצרול 15% באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל ו מחט ארוכה. יש להיזהר שלא לערבב את שתי השכבות. חזור על פעולה זו עבור כל ששת התנאים לבדוק עם פתרונות גליצרול pH המותאמת בהתאמה. הערה: עבודת בארון biosafety בכיתה השנייה על הצעדים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות כיסוי הדרגתי גליצרול עם 30 μl בהירים נוזל allantoic המכיל IAV (X31, H3N2) מדולל 1 מיליליטר חיץ MNT (מקביל סביב 20-30 מיקרוגרם של חלבון נגיפי הכולל) עבור כל צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתרה מנוגדים צינורות ומניחים אותם לתוך הרוטור ultracentrifugation SW41. צנטריפוגה עבור 150 דקות, ב 55,000 XG, ו -12 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, בזהירותלהסיר את supernatant, כלומר, הן שכבות גליצרול באמצעות פיפטה פסטר נקייה וכן aspirator. Resuspend גלולה ב 40 μl (1x) חיץ מדגם LDS הלא צמצום. חשוב pipet מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר את הגלולה לחלוטין. מעבירים את המדגם לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li></ol> 4. SDS-PAGE של גלולה שברים ו Coomassie מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בשלב זה הדגימות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד שהם מנותחים על ידי SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 20 μl של כדורי מומס על שיפוע מראש יצוק (4-12%) Bis-טריס ג&#39;ל מיני ולהפעיל עבור שעה 1 ב 200 V ב 1x מגבים SDS הפעלת המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון קיבעון עם 40% מתנול 10% קרחוני חומצה אצטית DDH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;ל בתמיסה קיבעון עבור שעה 1 ו להכתים לילה בצלחת תרבית תאים 15 ס&quot;מ עם נפח מספיק של פתרון Coomassie קולואידים בעוד בעדינותרועד בטמפרטורת החדר. הערה: חשוב לסגור את המנה על מנת למנוע אידוי של הפתרון המכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain הג&#39;ל DDH 2 O. החזר את DDH 2 O כל 15-20 דקות עד שרקע ג&#39;ל מתבהר. אחסן את הג&#39;ל DDH 2 O על 4 מעלות צלזיוס עד שהוא נסרק כימות הלהקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את הג&#39;ל על ברזולוציה גבוהה ולהשתמש תוכנה זמינה או מחוייט מסחרית עבור כימות של עוצמות להקת חלבון. הפחת את אות רקע מאזור קרוב להקות בהתאמה לנרמל את הערכים הללו ל דגימות בקרת חומר הניקוי ללא (ב- pH 7.4). </li></ol>

<ol>
	<li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Evolution,+Host+Adaptation,+and+Pandemic+Formation.">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host &amp; microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li><li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry:+the+influenza+hemagglutinin.">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li><li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li><li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells.">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+virus+entry+via+endocytosis.">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li><li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus.">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li><li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus.">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li><li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins:+The+viral+matrix+protein+(M1)+promotes+export+and+inhibits+import.">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47.">Chapter 47.</a> Fields Virology. , 1647-1690 (2006).</li><li>Chou, Y. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis.">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).</li><li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus.">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li><li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus.">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li><li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K++is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration.">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li><li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+matrix+protein+M1/M+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses.">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li><li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry.">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li><li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation.">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li><li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry.">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).</li><li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses.">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li><li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores.">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li><li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus.">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li><li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+influenza+virus:+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles.">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li><li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+virus+uncoating.">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li><li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+at+a+glance.">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li><li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Influenza+C+Viruses,+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH.">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

capsids ויראלי הם קומפלקסים macromolecular metastable. בעוד הרכבה של virions מחייבת encapsidation ועיבוי של הגנום הווירוס, ייזום של הסיבוב הבא של זיהום תלוי פירוק מבנה קפסיד קומפקטי זו. וירוסים התפתחו לנצל מנגנונים תאיים שונים כדי לשלוט על מחזור הציפוי-uncoating, כולל קולטני תאים, מלווה, אנזימים פרוטאוליטים, כוחות פיסיים הניתנים על ידי חלבונים מנועים או helicases וכן pH ומתגים יוניים 26,27. כאן, אנו מתארים גישה במבחנה מבוססת על צנטריפוגה שיפוע גליצרול כדי לבדוק את ההשפעה במיוחד של גורמי קידום פירוק גרעין IAV. הטכניקה ניתן להתאים באופן פוטנציאלי עבור לנתח תהליכי uncoating של וירוסים אפופים אחרים. באמצעות קולואידים Coomassie, חלבוני IAV המבניים הגדולים M1, NP, ו HA ניתן לאתר בבירור SDS-PAGE אפילו עם partic וירוס קטן יחסיתמספר le. עם זאת, אפיון מעמיק יותר של המבנה קפסיד משקעים והרכבה ידרוש מעקב מנתח, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית (כמו בעבר הציג 28), המערבי סופג, פיזור אור דינאמי או ספקטרומטריית מסה. הארכה נוספת של הפרוטוקול יכולה לכלול חלוקה של השלב גליצרול הנמוך (25%) וניתוח של מרכיבי הליבה הספציפיים. התאמת שכבת גליצרול התחתונה אל pH ההיתוך האופטימלי של 5.0 (עבור X31) הביאה ניתוק מוחלט כמעט של שכבת מטריקס (איור 2) 16. עם זאת, כ -30% של אות קלט NP עדיין יכולים להיקלט ב- pH זה. יתכן כי בשל העדר של גורמי הסלולר uncoating כלולים בהגדרה זו, כגון deacetylase היסטון זיהה באחרונה 6 (HDAC6) 18, פירוק שלם מתרחש. בתוך התא, החמצה האיטית של הליבה וחשיפה ויראלי למתג מ Na + ל- K + </sup&gt; מספרים ראשוניים הנגיף לשחרור מלא vRNP בשליטת uncoating גורמי 16. אנחנו לא יכולים לשלול כי ההגדרה שלנו, אבקת הכביסה הלא היונית חלקית משבשת את ליבת החומצה חשופה ומעורערת. עם זאת, אין כל השפעה על הליבה לסדימנטציה ב- pH הניטראלי הוא ציין שמציינת בעוצמות להקת חלבון דומות לעומת דגימות הלא solubilized (איור 2 א, להשוות מסלולי 1 ו -2). אמנם, assay המוצג כאן התברר לשחזור מאוד (וככזה הוא) חזק מספיק עבור כימות להקה, טווח מסוים של וריאציה יכול להיבחן. השימוש גליצרול בפרוטוקול זה הוא קריטי עבור התוצאה של הניסוי. כפי שדווח בעבר 17, ultracentrifugation באמצעות שיפוע סוכרוז מערער הליבה IAV, אשר צפוי עקב כוח אוסמוטי גבוה נוצר על ידי סוכרוז. טיהור IAV באמצעות הדרגתיים סוכרוז עלולה להפעיל השפעות דומות. לכן השווינו-ביצת גדל X31 נגזרת CL<html> נוזל allantoic arified ומניות מטוהרים סוכרוז. אין הבדל גדול יכול להיבחן ביחס להשפעת pH חומצי על יציבות הליבה (מידע לא מוצג). אף על פי כן, על מנת לשלול תופעות לוואי אפשריות של סוכרוז אוסמוטי הפעיל, אנו ממליצים לבצע את במבחנת assay uncoating עם הבהיר allantoic supernatants תרבית תאים נוזל או מרוכז. מלבד הבחירה של חומר שיפוע, חשוב לשמור על השלמות של השיפוע לא להשפיע על התנהגות השקיעה של ליבות ויראלי lysed ולהבטיח תוצאות לשחזור. בנוסף, resuspension שלם של השבר גלולה לאחר ultracentrifugation מוביל צפוי לתוצאות שונות. לבסוף, אנו ממליצים בחום התאמת ה- pH של תמיסות בופר המכיל חומר הניקוי באופן אידיאלי באותו היום של הניסוי כמו שינויים קטנים ריכוז יוני עשויים להיות השפעה דרסטית על יציבות ליבת ויראלי. תוכן &quot;&gt; חשוב לציין כי בהתאם לזן IAV בפרט, יעילות פירוק שונות עלולים לגרום מבוססות על המאפיינים של M1 בהתאמה NP וריאנטים. זה עשוי לחול גם על וירוסי מוטציה. לפיכך, ספי pH עבור שכבת מטריקס vRNP דיסוציאציה צריך להיקבע עבור זן IAV בהתאמה לפני בדיקת השפעות נוספות. לניתוח של תנאים ספציפיים על יציבות ליבה ויראלי אנו ממליצים להתאים את שכבת גליצרול התחתונה לערך pH כך שמחצית מקסימלי פירוק M1 מושג. יתכן כדי לחקור את ההשפעה של יונים ספציפיים או סוכני הפחתה ידי שינוי השכבה המכיל חומר הניקוי בהתאם. גורמי uncoating הסלולר משוערים ניתן להוסיף ישירות שיפוע גליצרול. במקרה של גורמי cytoplasmic, שכבת גליצרול שלישית בתחתית השיפוע יכולה להיות הציג, אשר מותאם pH נייטרלי, מכיל הגורם הסלולר של עניין, והוא ללא חומר ניקוי. בדרך זו, השיפוע תלת שכבתי דואר אפילו לחקות באופן הדוק יותר את המעבר של הנגיף באמצעות מערכת endocytic ושחרור פלחי גנים לתוך הציטופלסמה הניטראלי. יחדיו, אנו מציגים assay חזק אך פשוט במבחנה ללמוד תחול IAV ו uncoating, אשר יש לו את פוטנציאל שינויים צדדיים כדי לענות על שאלות מגוונות בהקשר של כניסת IAV. בנוסף, זה יכול להיות מיושם כדי לחקור תהליכי כניסת וירוסים אפופים אחרים עם מנגנוני uncoating קשורים.

וירוס שפעת A (IAV) הוא וירוס אפוף ושייך למשפחת Orthomyxoviridae. הגנים שלו מקודדים על גנום RNA מפולח, שלילי-השכל חד-גדילים. אצל בני אדם, IAV גורם זיהומים בדרכי נשימה, אשר מתרחשים התפרצויות מגיפה עונתיות ונושאת פוטנציאל המגיפות העולמיות 1. עם קשירת שאריות חומצת sialic על תא מארח המשטח 2, IAV מופנם על ידי אנדוציטוזה clathrin התלוי מסלולים עצמאיים-clathrin 3-8. המילייה חומצי (pH &lt;5.5) ב vacuoles endocytic מפעילה שינוי קונפורמציה מרכזי hemagglutinin גליקופרוטאין ספייק IAV (HA), שתוצאתה היתוך של נגיפי ואת endosomal מאוחר קרום 9. לאחר קפסיד IAV (כאן המכונה גם ויראלי &quot;הליבה&quot;) ברח מן endosomes מאוחר (LES), הוא ללא ציפוי ב cytosol ואחריו התחבורה של ribonucleoproteins ויראלי (vRNPs) לתוך הגרעין - O את האתרf וירוס שכפול שעתוק 10-13. לפני הפעלת חומצה של HA בנגיף חווה ירידה הדרגתית pH במערכת endocytic, אשר מספרים ראשוניים הליבה עבור פירוקו לאחר 14-16. בחודש זה &quot;הטרמה&quot; צעד של תעלות יונים M2 בקרום ויראלי לתווך זרם של פרוטונים ו- K +10,14,16. השינוי בריכוז יוני בפנים הווירוס מפריע האינטראקציות להצטבר על ידי חלבון מטריקס ויראלי M1 ואת צרור השמונה vRNP, ומקל IAV uncoating בציטופלסמה הבא קרום היתוך 10,14-17. ניתוח ישיר וכמותיים של הצעד יחול כבר הקשה על ידי העובדה endosomes קשה לגשת באופן ניסיוני. תהליך הכניסה, יתר על כן, מאוד לא סינכרוני. בנוסף, מבחני סוף נקודות, כגון qRT-PCR של מדידות infectivity או רנ&quot;א נגיפי שוחרר, אינם מספקים תמונה מפורטת על מצב ביוכימי של capsi ויראליד בכל צעד נתון כניסה. בעוד ההפרעות של endosomes ידי siRNA או טיפול תרופתי תרם משמעותית להבנת כניסה IAV 18-20, כיוונון עדין קשה ונוטים תופעות לוואי נוקבים בתוכנית התבגרות אנדוזום תחת פיקוח הדוק. כדי למנוע בעיות אלה, יש לנו התאמנו שפותח בעבר בפרוטוקול במבחנה מבוסס על שימוש צנטריפוגה שיפוע מהיר 17. בניגוד לניסיונות אחרים 21,22, 23,24, שהתבססו בעיקר על שילובים של מחשוף פרוטאוליטים וטיפול חומר ניקוי ואחריו ניתוח EM, גישה זו אפשרה להם תוצאה לכימות בקלות. צנטריפוגה דרך שכבות צבע שונות מאפשרת החלקיקים לסדימנטציה להיחשף ומגיבים עם שינוי תנאים באופן מבוקר. בפרוטוקול שהוצג, IAV נגזר נוזל allantoic בהיר או חלקיקים נגיפיים מטוהרים שקועים גליצרול דו שכבתישיפוע שבו השכבה התחתונה מכילה את הלא יוניים חומר ניקוי NP-40 (איור 1). כמו הנגיף חודר את השכבה השנייה, המכיל חומר ניקוי, המעטפה שומנים ויראלי גליקופרוטאינים המעטפה הם solubilized בעדינות והשאיר אחריו. הליבה, מורכב משמונה צרור vRNP ומוקף שכבת מטריקס, משקע כמבנה יציב לתוך השבר הגלול. חלבונים הליבה ויראלי, כגון M1 ו- nucleoprotein הקשורים vRNP (NP), יכול להיות מזוהים את הכדור על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים. בפרט, תוך ניצול של ג&#39;ל שיפוע הזמין המסחרי מכתימה עם קולואידים רגישות הגבוהה Coomassie 25, מאפשר דיוק וזיהוי גבוהים של כמויות קטנות אפילו של חלבוני ליבה קשורה ויראלי. זו מגדירה את הבסיס לבדוק האם תנאים שונים כגון pH, ריכוז מלח, וגורם uncoating המשוערת יש השפעות על התנהגות השקיעה של רכיבי ליבת הליבה stabil<html> ity. למטרה זו, רק את השכבה התחתונה, המכיל חומר ניקוי שיפוע גליצרול היא שונה על ידי החדרת הגורם או מצב עניינים. הטכניקה כבר יקרה במיוחד בחקירת ההשפעה שונה ערכי pH וריכוז מלח על שלמות ליבת IAV 16. פעולות ביניים של uncoating IAV יכול להיות במעקב דיסוציאציה כולל של שכבת מטריקס ב- pH חומצי קל (&lt;6.5) ואחריו דיסוציאציה vRNP ב- pH 5.5 והתחתון 16,17 (איור 1). השלב האחרון היה עוד יותר משופר על ידי נוכחות של גבוה K + ריכוז בשכבת גליצרול, המשקף בסביבה endocytic מאוחר 16. לכן, כמו הווירוס ואת הליבה משקעים דרך השיפוע שחווה בסביבה משתנית שתנאים מחקו ב endosomes. התוצאה היתה פירוק הדרגתי של הליבה ויראלי במבחנה, המשלימה התוצאות הנגזרות מבחני ביולוגיה של התא. t &quot;&gt; השיטה המוצגת כאן אפשרה מהר וניתוח לשחזור ביותר של IAV (X31 ו- A / WSN / 33) ואת IBV (B / Lee / 40) uncoating מופעלות על ידי pH חומצי והגדלת K +16,17 וכן פירוק ליבות paramyxovirus בחשיפה pH בסיסי 17. זה מתקבל על הדעת כי ניתן להתאים את הגישה וירוסים אפוף אחרים כדי להשיג תובנות את התכונות הביוכימיות של המבנה קפסיד ויראלי ופירוק קפסיד במהלך ערך בתא.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1103">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">cOmplete&#8482;, EDTA-free protease inhibitor tablets</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">11873580001</td>
			<td style="width:473px;">The stock solution can be stored at 2 to 8 &#176;C for 1 to 2 weeks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol anhydrous BioChemica</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>100317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NP-40</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Now commercially available as IGEPAL&#174; CA-630</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; LDS sample buffer (4X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE&#174; MOPS SDS running buffer (20X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH indicator strips, pH 4.0 - 7.0</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QC Colloidal Coomassie Stain</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1610803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium chloride</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodiumhydroxide</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Steritop&#8482; filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride&#160;</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid</td>
			<td>Virapur</td>
			<td></td>
			<td>Freshly thawed on 4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro disassembly of influenza a virus capsids by gradient centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

כפי שכבר דן, יחול ב endosomes נדרש כדי להבהיר את ליבת IAV uncoating מוסמכת. Protonation של הליבה מחליש אינטראקציה של M1 ו- vRNPs (מורכב של רנ&quot;א הנגיפי, NP, ואת פולימראז המורכב PB1 / PB2 / רש&quot;פ). תהליך זה מופעל כאשר וירוס נכנס חשוף pH של 6.5 (או נמוכים) ב endosomes מוקדם (EES) וממשיך עד נתיכי הווירוס בסביבות 5.0 pH ב Les. על מנת לחקות את הירידה של pH, השכבה התחתונה של הדרגתיים גליצרול הותאמו ערכי בין pH 7.4 ו -5.0 בריכוז מלח מתמיד. X31 נגזר נוזל allantoic הבהיר היה נתון צנטריפוגה שיפוע מהיר ונותח על ידי SDS-PAGE (איור 2 א &#39;, ב&#39;). ללא חומר ניקוי נוכח השיפוע (איור 2 א, lane1) virions השלם הם pelleted, כפי שמשתקפים הדפוס האופייני שללהקות המייצג HA (HA1 ו HA2; 63 KDA), NP (56 KDA), ו M1 (27 KDA) ב Coomassie מוכתם ג&#39;ל. מאז ג&#39;ל נדרס בתנאים הלא צמצום, proteolytically ביקע HA1 ו HA2 עדיין מחוברים באמצעות אג&quot;ח דיסולפיד ולהפעיל כ 64 kDa. בתנאי הפחתת הלהקות המתאימות HA1 ו HA2 תופענה קרוב מאוד להקות NP ו M1, בהתאמה, מה שהופך אותו קשה לפרש בנאמנות ולקבוע בעוצמות להקה כי נגזרות אך ורק מליבת ויראלי (איור 2 ב). עם התוספת של NP-40 לתחתית (25%) גליצרול שכבת המעטפת הנגיפית כולל HA, NA, ו- M2 היה solubilized וליבת ויראלי לבד משקעת לתוך הגלולה במהלך ultracentrifugation (איור 1; איור 2, מסלול 2). החל עם pH מתחת ל -6.5, M1 הוא איבד בהדרגה את השבר גלולה והגיע למינימום בין pH 5.8 ו -5.4 (איור2A, B). להלן pH 5.8 vRNPs היו מנותקים וכך אבדו מן הגלולה. בעבר, הוכיח כי, למעשה, כל vRNPs משתחרר לתוך השכבה העליונה, כמו שחרורם בקורלציה עם הפסד של PB2 מן השבר הגלול 16. להקה עוצמת חלבון נקבעו, התגלה שני ספי pH ברורים פירוק שכבת M1 ו- דיסוציאציה של חבילות vRNP, בהתאמה (איור 2). להקות נוספות יכולות להיבחן על הג&#39;ל, אשר עשוי מתאים אל PB1 חלבוני פולימראז (87 KDA), PB2 (86 KDA), הרשות פלסטינית (83 KDA), ו- M2 (11 KDA). בשל מספרי העותק התחתונים שלהם בתוך virions IAV לא יכולנו לקבוע את זהותם באופן מהימן והם וכתוצאה מכך לא נלקחו בחשבון עבור כימות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig1.jpg" /> איור 1: ייצוג סכמטי של IAV <em&gt; במבחנה assay פירוק הליבה. בקצרה, חלקיקים נגיפיים מטוהרים נטענים על שיפוע גליצרול בן שני שלבים. השכבה התחתונה מכילה חומר הניקוי NP-40 ו מותאם ריכוז pH ומלח הרצויה תוך השכבה העליונה, ללא חומרי ניקוי נשמר בריכוז pH ומלח מתמיד. בהתאם לתנאי בשכבת גליצרול הנמוכה, ליבות ויראלי מלאות משקעים לתחתית (1) או הם ניתקו ולהישאר בשכבת גליצרול (2). pH ניטרלי מוביל שקיעה של ליבות ויראלי שלם המורכב M1 ו- vRNPs. תנאים נוחים uncoating, כגון pH חומצי (5.0), תוצאות דיסוציאציה של מרכיבי ליבת ויראלי ולכן הפסד השבר הגלול. בעקבות ultracentrifugation, supernatants גליצרול יוסרו וכדוריות מנותחים על ידי SDS-PAGE. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53909/53909fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </<html> p&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig2.jpg" /> איור 2: פירוק ליבת IAV במבחנה על החמצה (א) במבחנת פירוק חלקים המשומשים X31 בתנאי pH שונה בשכבת גליצרול הנמוכה.. כביקורת, NP-40 הושמטו משכבת ​​גליצרול התחתונה (הנתיב הראשון). דוגמאות הופרדו על ידי SDS-PAGE בתנאים שאינם צמצום ואחריו Coomassie מכתים. להקות חלבון נגיפי מסומנים בצד ימין. (ב) כימות densitometric של העוצמות של להקות חלבון נגיפיות שמוצגות (א). עוצמות להקת חלבון עבור M1 ו- NP היו מנורמלות לאלה ב- pH 7.4 בלי NP-40. נתונים מיוצגים כאמצעי ניסויים כפולים ± סטיית תקן (SD). מעובד מתוך סטיופר et al., 2014 16.ge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation at JoVE.com

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

במבחנה פירוק של וירוס שפעת capsids ידי צנטריפוגה שיפוע

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

in-vitro-disassembly-influenza-virus-capsids-gradient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

8.9K Views.  ETH Zurich. Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Video: In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

האף מגבונים לשפעת זיהוי וירוסים ובידוד מחזירים

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone considering direct medical and hospitalization expenses and work absenteeism2. Animal models are crucial in Influenza A virus (IAV) studies to evaluate viral pathogenesis, host-pathogen interactions, immune responses, and the efficacy of current and/or novel vaccine approaches as well as antivirals. Mice are an advantageous small animal model because their immune system is evolutionarily similar to that found in humans, they are available from commercial vendors as genetically identical subjects, there are multiple strains that can be exploited to evaluate the genetic basis of infections, and they are relatively inexpensive and easy to manipulate. To recapitulate IAV infection in humans via the airways, mice are first anesthetized prior to intranasal inoculation with infectious IAVs under proper biosafety containment. After infection, the pathogenesis of IAVs is determined by monitoring daily the morbidity (body weight loss) and mortality (survival) rate. In addition, viral pathogenesis can also be evaluated by assessing virus replication in the upper (nasal mucosa) or lower (lungs) respiratory tract of infected mice. Humoral responses upon IAV infection can be rapidly evaluated by non-invasive bleeding and secondary antibody detection assays aimed at detecting the presence of total or neutralizing antibodies. Here, we describe the common methods used to infect mice intranasally (i.n) with IAV and evaluate pathogenesis, humoral immune responses and protection efficacy.

Influenza A viruses (IAVs) are important human respiratory pathogens. To understand the pathogenicity of IAVs and to perform preclinical testing of novel vaccine approaches, animal models mimicking human physiology are required. Here, we describe techniques to evaluate IAV pathogenesis, humoral responses and vaccine efficacy using a mouse model of infection.