우리는 시약으로 우리를 제공 요헤이 야마우치와 로버타 만치니 감사합니다. 아 연구소는 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 (ITN)에 의해 지원되었다, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 유럽 연구위원회 (ERC) (SINERGIA).

버퍼 및 재고 솔루션 1. 준비 <ol><li> 80 ML의 DDH 2 O.에 470 mg의 트리스 염산염 390 mg을 MES 수화물 580 mg의 NaCl을 용해하여 (20 MM의 MES, 30 mM 트리스, 100 mM의 염화나트륨)을 MNT 버퍼를 준비 pH를 7.4로 버퍼를 조정하고 DDH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 가져 </li><li> 80 ml의 DH 2 O 각각에 9.76 g의 MES 수화물을 용해하여 500 mM의 MES 버퍼의 3 개의 동일한 솔루션을 준비합니다. 농축 된 NaOH로 적정하여 각각의 pH 5.8, 5.4, 5.0,에 버퍼를 조정합니다. DH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 각 버퍼를 가지고 </li><li> DH 2 O 80 ㎖에 각각 7.88 g 트리스 염산에 용해시켜 500 mM 트리스 버퍼의 두 개의 동일한 솔루션을 준비하고 진한 HCl로 적정하여, 각각 7.4와 6.4로 pH를 조정합니다. DH 2 O. 100 ml의 최종 부피로 버퍼를 가지고 </li><li> DH 2 O 50 % 글리세롤 솔루션을 준비하고 glyc 때까지 잘 저어EROL는 균일하게 혼합이다. 유리 병으로 Steritop 필터 부 (0.22 ㎛의 공극 크기)를 통해 용액을 필터. </li><li> 10 % NP-40 용액 DH 2 O. 1 M NaCl을 준비 </li><li> 4 ML의 DDH 2 O. 두 개의 정제를 용해시켜 25 배 농축 된 단백질 분해 효소 억제제를 준비 </li></ol> 글리세롤 그라디언트 2. 준비 <ol><li> 5 ml의 세제 버퍼 마스터 믹스 준비 (PH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, 5.0) 시험을 각각의 pH 조건에 대한 용액 (300 mM의 NaCl을 2 % NP-40을 2 배는 단백질 분해 효소 억제제를 집중). 이를 위해, 1 M의 NaCl 9 ㎖, 10 % NP-40 6 ml 일 25X 프로테아제 저해제 스톡 2.4 ㎖, 9 ML의 DDH 2 0 섞는다. </li><li> 각각의 pH 조건 피펫 대한 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 마스터 믹스의 4.4 ml의. </li><li> pH 값의 경우 5.8 위의 튜브에 각각의 pH를 조정 500 mM 트리스 주식 솔루션의 0.6 ml를 추가합니다. pH가 5.8와 하부를 들어 각각의 pH를 조정 500 mM의 MES 주식 솔루션의 0.6 ml를 추가합니다. </li><li> 5 확인300 mM의 NaCl을 함유하는 완충액 ml의 2 배 프로테아제 억제제는, 60 mM 트리스 pH를 7.4 DDH 2 O. 조정 이 세제없이 제어 그라데이션 버퍼로서 기능한다. </li><li> 필요한 경우, 각각 농축 HCI 또는 수산화 나트륨 용액을 첨가하여 pH를 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 및 5.0의 용액 pH를 미세 조정한다. </li><li> 여섯 가지의 25 % 글리세롤 용액의 결과로 세제 함유 세제 프리 버퍼의 혼합물을 5 ml의 50 % 글리세롤 5 mL를 추가한다. 산도 표시기 스트립을 사용하여 pH 값을 확인한다. 주 : 측정 된 pH가 목적하는 값에서 크게 다를 경우, 각각의 용액을 다시 제조한다. </li><li> 7 비율 : 3에서 DH 2 O 50 % 글리세롤 주식을 혼합하여 15 % 글리세롤 솔루션을 준비합니다. </li></ol> IAV의 3 초 원심 분리 <ol><li> 5 ML의 주사기와 옛 성은을 사용하여 매우 명확한 원심 분리 튜브에 (13.2 ml를, 14mm X 89mm)을 3 ml의 15 % 글리세롤 솔루션을 추가DLE (9cm 길이 21 G). 이 그라데이션의 무결성을 방해 하듯 튜브의 내부 벽에 방울을 두지 마십시오. 여섯 원심 분리 튜브, 시험 법에 다섯 pH 조건 각각에 대해 하나 제어 샘플에 대한 하나의 총에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 5 ㎖ 주사기 긴 바늘을 사용하여 15 %의 글리세롤 층 아래에​​ 3.4 ml의 25 % 글리세롤 용액을 놓는다. 두 개의 레이어를 혼합하지 않도록주의하십시오. 각각의 pH를 조정 글리세롤 솔루션을 테스트하는 여섯 조건에 대해이 작업을 반복합니다. 참고 : 다음 단계 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에서 작업 할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 1 ml의 MNT 버퍼에 희석 IAV (X31, H3N2)를 포함 뇨 유체를 정화 30 μL와 글리세롤 그라디언트 오버레이 각 그라데이션 (약 20 ~ 30 μg의 총 바이러스 성 단백질에 해당). </li><li> 균형 튜브를 반대하고 SW41의 초 원심 분리 회 전자에 배치합니다. 55,000 XG에 150 분, 12 ° C에 대한 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 신중하게깨끗한 파스퇴르 피펫 및 흡입기를 사용하여 상층 액, 즉, 두 글리세롤 레이어를 제거합니다. 40 μL (1X) LDS 샘플 완충액 비 환원성의 펠렛을 재현 탁. 완전히 펠렛을 용해 다운 수회 피펫을하고 중요하다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 샘플을 전송합니다. </li></ol> 펠렛 분획 및 쿠마시 염색 4. SDS-PAGE <ol><li> 10 분 동안 95 ° C에서 모든 샘플을 가열. 이들은 SDS-PAGE에 의해 분석 될 때까지이 지점에서 샘플을 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 로드 프리 캐스트 구배 (4~12%) 상에 용해 된 펠릿 20 μl를 비스 - 트리스 미니 젤 버퍼를 실행 1 배 MOPS SDS 200 V에서 1 시간 동안 실행합니다. </li><li> DDH 2 O. 40 % 메탄올 및 10 % 빙초산 고정 용액을 </li><li> 1 시간 동안 고정 용액 내에서 겔을 쿠마 부화 콜로이드 용액의 충분한 부피를 가진 15cm 세포 배양 접시에서 하룻밤 동안 부드럽게 얼룩실온에서 진탕. 주 : 염색 용액의 증발을 방지하기 위해 접시를 가까이하는 것이 중요하다. </li><li> DDH 2 O.에서 젤 Destain 겔 배경이 명확해질 때까지 DDH 2 O마다 15 ~ 20 분 교체합니다. 이 밴드 정량 검사 될 때까지 4 ° C에서 DDH 2 O에서 젤을 저장합니다. </li><li> 높은 해상도에서 젤을 스캔 단백질 밴드 강도의 정량화를위한​​ 시판 또는 사용자 정의 만든 소프트웨어를 사용합니다. 각 밴드에 근접한 영역에서 바탕 신호를 빼고 (PH 7.4) 세제없는 대조 시료에 이들 값을 정규화. </li></ol>

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	<li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Evolution,+Host+Adaptation,+and+Pandemic+Formation.">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host &amp; microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li><li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry:+the+influenza+hemagglutinin.">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).</li><li>de Vries, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+influenza+a+virus+endocytic+routes+reveals+macropinocytosis+as+an+alternative+entry+pathway.">Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway.</a> PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).</li><li>Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+entry+pathway+of+influenza+virus+in+a+canine+kidney+cell+line.">Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).</li><li>Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mechanism+of+influenza+virus+entry+into+cells.">Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells.</a> J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).</li><li>Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+endocytic+machinery+around+individual+influenza+viruses+during+viral+entry.">Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry.</a> Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).</li><li>Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+virus+entry+via+endocytosis.">Dissecting virus entry via endocytosis.</a> J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).</li><li>Yoshimura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Cell+Entry+Mechanism+of+Influenza+Virus.">Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus.</a> Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).</li><li>White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-fusion+activity+of+influenza+virus.">Membrane-fusion activity of influenza virus.</a> Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).</li><li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins:+The+viral+matrix+protein+(M1)+promotes+export+and+inhibits+import.">Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import.</a> Cell. 67 (1), 117-130 (1991).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47.">Chapter 47.</a> Fields Virology. , 1647-1690 (2006).</li><li>Chou, Y. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+Different+Influenza+Viral+RNA+Segments+in+the+Cytoplasm+before+Viral+Budding+as+Shown+by+Single-molecule+Sensitivity+FISH+Analysis.">Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis.</a> PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).</li><li>Martin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+incoming+influenza+virus+nucleocapsids+into+the+nucleus.">Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus.</a> Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).</li><li>Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+M1+protein+and+low+pH+on+nuclear+transport+of+influenza+virus+ribonucleoproteins.">Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins.</a> Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH-Controlled+Two-Step+Uncoating+of+Influenza+Virus.">pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus.</a> Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).</li><li>Stauffer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+priming+by+acidic+pH+and+high+K++is+required+for+efficient+uncoating+of+influenza+A+virus+cores+after+penetration.">Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration.</a> Journal of Virology. , (2014).</li><li>Zhirnov, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+of+matrix+protein+M1/M+from+virions+occurs+at+different+pH+for+orthomyxo-+and+paramyxoviruses.">Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses.</a> Virology. 176 (1), 274-279 (1990).</li><li>Banerjee, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+A+virus+uses+the+aggresome+processing+machinery+for+host+cell+entry.">Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry.</a> Science. 346 (6208), 473-477 (2014).</li><li>Huotari, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cullin-3+regulates+late+endosome+maturation.">Cullin-3 regulates late endosome maturation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).</li><li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+Deacetylase+8+Is+Required+for+Centrosome+Cohesion+and+Influenza+A+Virus+Entry.">Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).</li><li>Bachmayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Solubilization+of+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+from+Influenza+Viruses.">Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses.</a> Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).</li><li>Reginster, M., Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Characterization+of+Influenza+Virus+Cores.">Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores.</a> Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).</li><li>Nermut, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+Investigation+on+the+Fine+Structure+of+Influenza+Virus.">Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus.</a> Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).</li><li>Schulze, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+influenza+virus:+II.+A+model+based+on+the+morphology+and+composition+of+subviral+particles.">The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles.</a> Virology. 47 (1), 181-196 (1972).</li><li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+silver:+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis.">Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).</li><li>Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+virus+uncoating.">Mechanisms of virus uncoating.</a> Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).</li><li>Yamauchi, Y., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+entry+at+a+glance.">Virus entry at a glance.</a> Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).</li><li>Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Influenza+C+Viruses,+Distinct+from+That+of+Influenza+A+and+B+Viruses+Requires+Neutral-Alkaline+pH.">Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH.</a> Virology. 200 (1), 284-291 (1994).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

바이러스 캡시드는 준 안정 거대 분자 복합체이다. 비리의 어셈블리가 바이러스 게놈의 이입 및 응축을 필요로하지만, 감염의 다음 라운드의 시작이 소형 캡시드 구조의 해체에 따라 달라집니다. 바이러스는 세포 수용체, 보호자, 단백질 분해 효소, 모터 단백질 또는 헬리뿐만 아니라 pH와 이온 스위치 (26, 27)에 의해 제공되는 물리적 인 힘을 포함하는 코팅 - uncoating주기를 제어하는 다양한 세포 메커니즘을 악용 진화했다. 여기서는 구체적 IAV 코어의 분해를 촉진하는 요인의 영향을 테스트하기 위해, 글리세롤 구배 원심 분리에 기초한 시험 관내 방법을 설명한다. 이 기술은 잠재적으로 다른 외피 바이러스 uncoating 프로세스 해부하도록 구성 될 수있다. 콜로이드 쿠마, M1은, NP는, HA와 명확하더라도 비교적 작은 바이러스 partic하여 SDS-PAGE에서 검출 될 수있는 주요 구조물 IAV 단백질을 사용하여르 번호. 그러나,보다 깊이 침전 된 캡시드 구조의 특성화 및 추적 관찰을 필요로 조성 분석, (이전 28 제시된) 전자 현미경과 같은, 웨스턴 블로 팅, 동적 광산란 또는 질량 분석. 프로토콜의 추가 확장은 코어의 특정 구성 요소의 하부 (25 %)의 글리세롤의 위상 및 분석 분획을 포함 할 수있다. (X31 용) 5.0의 최적 pH를 융합에 하부 글리세롤 층의 조정은 매트릭스 층의 거의 완전한 분리 (도 2) (16)로했다. 그러나, NP 입력 신호의 30 %가 여전히 pH에서 검출 될 수있다. 이 때문에 같은 최근에 확인 된 히스톤 디 아세틸 라제 6 (HDAC6) 18이 설정에서 셀룰러 uncoating 요인의 부재로, 불완전 분해가 발생할 가능성이있다. 세포 내부 나 +에서 스위치 바이러스 코어 노광 천천히 산성화 + k로 </sup는&gt; (16) 요인 uncoating에 의해 제어 전체 vRNP 릴리스 바이러스를 소수가. 우리는 우리의 설정에서, 비이 온성 세제가 부분적으로 노출 산 불안정 코어 방해 것을 배제 할 수 없다. 그러나, 중성 pH에서 침전되는 코어에 영향 비 가용화 샘플에 비해 유사한 단백질 밴드의 강도에 의해 표시되지 관찰되었다 (도 2A, 비교 레인 1과 2). (예를 들면 그대로) 여기에 제시된 입증 분석이 밴드 정량에 충분한 강력한 높은 재현성과로,하지만, 변화의 특정 범위를 관찰 할 수있다. 이 프로토콜에서 글리세롤을 사용하는 실험의 결과에 중요하다. 이전 17보고 된 바와 같이, 자당 기울기를 통해 초 원심 분리로 인해 자당에 의해 생성 된 높은 삼투압 힘 가능성이 IAV 코어, 불안정. 수 크로스 구배를 통해 정제 IAV 마찬가지의 효과를 발휘할 수있다. 그러므로 우리는 달걀 성장 X31은 CL에서 파생 비교<html> arified 뇨 유체 및 자당 정제 주식. 별다른 차이 코어 안정성 산성 pH의 영향에 대해 관찰되지 않았다 (데이터는 보이지 않음). 그럼에도 불구하고, 삼투 성 활성 자당의 잠재적 부작용을 배제하기 위해, 우리는 뇨 정화 유체 또는 농축 된 세포 배양 상청액과 함께 시험 관내 분석을 수행 uncoating 바랍니다. 경사 재료의 선택 게다가, 분해 된 바이러스 코어의 퇴적 동작에 영향을하고 재현 가능한 결과를 보장 할 수있는 그래디언트의 무결성을 유지하는 것이 중요하다. 또한, 초 원심 분리 후의 펠릿 분획 불완전 부유 가능성 다른 결과를 이끈다. 이온 농도의 작은 변화는 바이러스 코어의 안정성에 급격한 효과를 가질 수 마지막으로, 우리는 강력 실험 당일 이상적 세제 함유 완충 용액의 pH를 조정 추천한다. 콘텐츠 &quot;&gt; 특정 IAV 변형에 따라 다른 분해 효율은 각각 M1의 특성에 따라 발생할 수있는 점에 유의하는 것이 중요하다 순이익이 또한 돌연변이 바이러스가 부과 될 수 있습니다. 변형. 따라서, 매트릭스 층과 vRNP에 대한 pH가 임계 값 해리 추가적인 영향을 테스트하기 전에 각 IAV 균주에 대해 결정해야한다. 우리가 M1의 최대량의 절반 분해가 달성되도록 pH 값 하단 글리세롤 층 조정 제안 바이러스 코어의 안정성에 대한 특정 상황에 대한 분석을 위해. 것이 가능 따라서 세제 함유층을 수정하여 특정 이온 또는 환원제의 영향을 조사하기 위해. 추정 적 세포 uncoating 요인 글리세롤 구배에 직접 첨가 될 수있다. 세포 내 인자의 경우에, 그라데이션의 하단에 제 글리세롤 층 수 중성 pH로 조정하는 도입 관심의 세포 계수를 포함하고, 세제의 자유이다. 이와 같이, 제E 삼층 구배 더욱 밀접 중립 세포질 내로 이입 시스템 유전자 세그먼트의 방출을 통해 바이러스의 통과를 모방하는 것이다. 함께, 우리는 IAV 항목의 맥락에서 다양한 문제를 해결하기 위해 다양한 수정의 가능성이 IAV 프라이밍 및 uncoating을 연구하는 강력한 아직 간단한 시험 관내 분석을 제시한다. 또한, 관련이 uncoating 메커니즘 기타 외피 바이러스의 진입 과정을 조사하기 위해 적용될 수있다.

인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 포락선 바이러스와 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae)의 가족에 속한다. 그 유전자는 세그먼트, 음의 감지 및 단일 가닥 RNA 게놈에 인코딩됩니다. 인간, IAV 계절 전염병의 발생에서 발생하는 호흡기 감염을 원인과 글로벌 전염병 일 가능성을 맺는다. 숙주 세포의 표면에이 시알 산 잔기에 결합하면, IAV는 클라 의존적 세포 내 이입 및 클라 독립 경로 3-8에 의해 내재화된다. 세포 내 이입 공포의 산성 환경 (PH &lt;5.5) 바이러스의 융합과 후반 엔도 좀 막 9 초래 IAV 스파이크 당 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA)의 주요 구조적 변화를 트리거합니다. 사이트 오 - IAV 캡시드되면 말 엔도 좀 (레),이 핵에 바이러스 리보 (vRNPs)의 전송 다음 세포질에 코팅되지 않은됩니다에서 탈출했다 (여기 또한 바이러스의 &quot;핵심&quot;이라한다)F 바이러스 복제 및 전사 10-13. HA 산의 활성화에 앞서 바이러스는 연속 14-16 분해 용 코어를 준비하게 이입 시스템에서 pH의 점차적 감소를 경험한다. 이 &quot;프라이밍&quot;양성자와 K +10,14,16의 유입을 매개 바이러스 막 중의 M2 이온 채널 단계. 바이러스 내부에 이온 농도의 변화는 상호 작용이 바이러스의 매트릭스 단백질 (M1)과 여덟 vRNP 번들로 구축 방해 및 막 융합 10,14-17 다음 세포질 IAV의 uncoating을 용이하게한다. 프라이밍 공정 직접 정량 분석​​은 엔도 좀 실험적 액세스 어렵다는 사실에 의해 저해되었다. 진입 과정은 또한 매우 비동기이다. 또, 릴리스 바이러스 RNA 또는 감염성 측정 QRT-PCR 같은 종점 분석법은 바이러스 capsi의 생화학 적 상태에 대한 상세한 그림을 제공하지항목의 특정 단계 라. siRNA를하거나 약물 치료에 의해 ​​엔도 좀의 교란이 크게 IAV 항목 18 ~ 20의 이해에 기여하고 있지만, 미세 조정은 엄격하게 통제 엔도 좀 성숙 프로그램에서 불특정 부작용에 어렵고 쉽다. 이러한 문제를 방지하기 위해 속도 구배 원심 분리 (17)의 사용에 기초하여 이전에 개발 된 시험 관내 프로토콜을 채택하고있다. 대부분의 단백질 분해 절단 및 EM 분석 하였다 세제 처리의 조합을 기반으로 한 다른 시도가 21, 22, 23, 24, 대조적으로,이 방법은 쉽게 정량화 결과 수 있었다. 다른 구배 층을 통해 원심 분리는 침강 입자에 노출 제어 된 방식으로 상황 변화에 반응 할 수있다. 제시된 프로토콜, IAV 정화 막액 또는 정제 된 바이러스 입자로부터 유도는 2 층 글리세롤로 침강구배하는 바닥층은 비이 온성 세제 NP-40 (도 1)을 포함한다. 바이러스 제 세제 함유층 들어갈 때, 바이러스 외피 지질 및 엔벨로프 당 단백질 부드럽게 가용화 남아있다. 코어 8 개의 vRNP 다발로 구성되며, 매트릭스 층에 의해 둘러싸인 펠렛 분획으로 안정한 구조와 퇴적물. 이러한 M1과 vRNP 관련 핵 단백질 (NP)과 같은 바이러스 코어 단백질은, SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 펠렛으로 식별 될 수있다. 특히, 시판 구배 겔을 활용하고 고감도 콜로이드 쿠마시 염색 25, 고정밀 바이러스 코어 - 관련 단백질에도 소량의 검출을 가능하게한다. 이는 pH를, 염 농도, 및 추정 uncoating 요인 핵심 구성 요소 및 핵심 STABIL의 침강 거동에 영향을 상이한 조건 여부를 시험하기위한 기준을 설정<html> 성만. 이를 위해, 글리세롤 구배 만 이하, 세제 함유층 인자 또는 관심 조건을 도입함으로써 변경된다. 이 기술은 IAV 코어 (16)의 무결성에 대한 pH 값 염화칼슘 농도 가지의 효과를 조사하고 특히 가치있다. IAV의 uncoating의 중간 단계의 pH 5.5와 낮은 16, 17 (그림 1)에서 vRNP 해리 뒤에 약간 산성 pH (&lt;6.5)에서 매트릭스 층을 포함하는 해리를 모니터링 할 수 있습니다. 후자 단계는 상기 늦은 이입 환경 (16)을 반영 글리세롤 층이 높은 K + 농도의 존재에 의해 개선되었다. 바이러스 코어는 그라데이션을 침전으로서 따라서, 그들은 변화 환경 엔도 좀에서 모방 조건을 경험 하였다. 결과는 세포 생물학 분석에서 도출 된 결과를 보완, 체외에서 바이러스 코어의 단계적 해체했다. t &quot;&gt; 여기에 제시된 방법은 빠른 활성화 및 IAV의 높은 재현성 분석했다 (X31 및 A / WSN / 33) 및 IBV (B가 리 / 40 /) 산성 pH에 의해 트리거 및 분해뿐만 아니라 K +16,17 증가 uncoating 그것은 생각할 알칼리 pH를 17 노광시의 코어 paramyxovirus. 접근법은 셀 입력시 바이러스 캡시드 구조 캡시드 분해의 생화학 적 특성에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 외피 바이러스에 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>cOmplete&amp;trade;, EDTA-free protease inhibitor tablets</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>The stock solution can be stored at 2 to 8 &amp;deg;C for 1 to 2 weeks</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Merck Millipore</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol anhydrous BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck Millipore</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Long injection needle (21&amp;nbsp;G, 9 cm, bevel or blunt-end)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>Now commercially available as IGEPAL&amp;reg; CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10&amp;nbsp;wells, 1.0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS sample buffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>pH indicator strips, pH 4.0-7.0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Colloidal Coomassie Stain</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck Millipore</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>Sodiumhydroxide</td><td>Merck Millipore</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Steritop filter unit</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2&amp;nbsp;ml, 14 mm x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid</td><td>Virapur</td><td></td><td>Freshly thawed on 4 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

in vitro disassembly of influenza a virus capsids by gradient centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

이미 설명한 바와 같이, 엔도 좀에서 프라이밍 능력 uncoating IAV 코어를 렌더링하는 데 필요합니다. 코어의 양성자는 M1 및 vRNPs의 상호 작용을 약화 (바이러스 RNA, NP 구성을하고, 중합 효소 복합체 PB1 / PB2 / PA). 들어오는 바이러스 초기 엔도 좀 (EES) 6.5 (이하)의 pH에​​ 노출 레 약 5.0의 pH에​​서의 바이러스 퓨즈까지 계속 될 때이 프로세스는 시작된다. 산도의 감소를 모방하기 위해, 글리세롤 구배 바닥층은 일정 염 농도에서 pH를 7.4 및 5.0 사이의 값으로 조정 하였다. 명확히 막액으로부터 유도 X31은 SDS-PAGE에 의해 속도 구배 원심 분리하여 분석 하였다 (도 2A, B). 패턴의 특징에 의해 반영된 바와 같이 경사 (도 2A, lane1)에 존재하는 세제없이 완전한 비리 온이되어 펠렛HA (HA1과 HA2 63 kDa의)를 나타내는 밴드 쿠마시에서, NP (56 kDa의), 그리고 M1 (27 kDa의)는 젤 스테인드. 젤 비 환원 조건에서 실행 된 이후, 단백질 가수 분해 절단 HA1과 HA2는 여전히 이황화 결합에 의해 연결되고 약 64 kDa의를 실행됩니다. 환원 조건 하에서 HA1과 HA2에 대응하는 대역 해석 충실 단독 바이러스 코어 (도 2B)에서 파생 된 밴드 강도를 결정하기 어렵게 각각 NP 및 M1 대역에 매우 근접 나타날 것이다. 바닥 NP-40을 첨가시 (25 %) 글리세롤은 HA, NA를 포함한 바이러스 성 봉투 층 및 M2는 용해되었고 바이러스 코어는 단독으로 초 원심 분리 (그림 1, 그림 2, 레인 2) 동안 펠렛으로 침전. 6.5 이하의 pH를 시작으로, M1은 점차적으로 pH를 5.8 및 5.4 (그림 사이의 최소 도달, 펠렛 분획에서 손실도 2A, B). pH가 5.8 이하가 vRNPs 해리시키고, 따라서 펠렛으로부터 잃었다. 이전에는 그들의 릴리스 펠릿 분획 16 PB2의 감소와 상관 관계로서 사실상 전체 vRNPs이 상층으로 방출되는 것으로 밝혀졌다. 단백질 밴드 강도는 vRNP 번들 각각 (그림 2)의 M1 층과 해리의 분해에 대한 두 가지의 pH 임계 값을 드러내는 측정 하였다. 추가 밴드 중합 효소 단백질 PB1 (87 kDa의), PB2 (86 kDa의), PA (83 kDa의)과 M2 (11 kDa의)에 해당 할 수 있습니다 젤, 관찰 할 수있다. IAV의 비리 내부에 자신의 낮은 사본 번호로 인해 우리는 확실하게 자신의 정체성을 확인할 수 그들은 결과적으로 정량 고려되지 않았다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig1.jpg" /> 그림 1 : IAV의 도식 표현 <em&gt; 체외 핵심 분해 분석. 간단히, 정제 된 바이러스 입자는 2 단계 글리세롤 구배에로드된다. 바닥층은 NP-40 세제를 포함하고, 상부, 세제 프리 층 일정한 pH 및 염 농도로 유지하면서 원하는 pH 및 염 농도로 조정된다. 하부 글리세롤 층의 상태에 따라, 완전한 바이러스 코어는 (1) 바닥에 침강 또는 해리 및 글리세롤 층 (2)에 남아있다. 중성 pH는 M1 및 vRNPs 구성 그대로 바이러스 코어의 침전에 연결됩니다. 이러한 산성 pH (5.0)와 같은 uncoating에 유리한 조건, 바이러스 핵심 구성 요소의 분리 및 펠렛 분획에서 따라서 손실이 발생합니다. 초 원심 분리 후, 글리세롤 상층 액을 제거하고 펠렛 SDS-PAGE에 의해 분석된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53909/53909fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </<html> P&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53909/53909fig2.jpg" /> 도 2 : 산성화시 체외 IAV 코어 분해 (A) 하부 글리세롤 층에서 다른 pH 조건에서 X31 코어의 시험 관내 분해.. 대조군으로서, NP-40은 하단 글리세롤 층 (제 1 레인)에서 생략 하였다. 샘플은 쿠마시 염색 하였다 비 환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 분리 하였다. 바이러스 성 단백질 밴드는 오른쪽에 표시됩니다. (B) (A)에 도시 된 바이러스 단백질 밴드의 강도 정량의 농도계. M1과 NP에 대한 단백질 밴드 강도는 NP-40없이 pH가 7.4에서 사람들에게 정규화 하였다. 데이터는 표준 편차 (SD) ± 중복 실험의 수단으로 표현된다. 스타 우퍼 등. 2014 년 16에서 적응.ge.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

8.9K 조회수.  ETH Zurich. Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

연구

면역학 및 감염병학

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal phase during establishment of infection in a given host. Consequently, study of encapsidation deciphers the information regarding the know-how of the mechanism regulating virus assembly to form infectious virions. Such information is vital in formulating novel methods of curbing virus spread and disease control. Virus encapsidation can be studied in vivo and in vitro. Genome encapsidation in vivo is a highly regulated selective process involving macromolecular interactions and subcellular compartmentalization. Therefore, study leading to dissect events encompassing virus encapsidation in vivo would provide basic knowledge to understand how viruses proliferate and assemble. Recently in vitro encapsidation has been exploited for the research in the area of biomedical imaging and therapeutic applications. Non-enveloped plant viruses stand far ahead in the venture of in vitro encapsidation of the negatively charged foreign material. Brome mosaic virus (BMV), a non-enveloped multicomponent RNA virus pathogenic to plants, has been used as a model system for studying genome packaging in vivo and in vitro. For encapsidation assays in Nicotiana benthamiana plants, Agrobacterium -mediated transient expression, refer to as agroinfiltration, is an efficient and robust technique for the synchronized delivery and expression of multiple components to the same cell. In this approach, a suspension of Agrobacterium tumefaciens cells carrying binary plasmid vectors carrying cDNAs of desiredviral mRNAs is infiltrated into the intercellular space withina leaf using nothing more sophisticated than a 1 ml disposable syringe (without needle). This process results in the transfer of DNA insert into plant cells; the T-DNA insert remains transiently in the nucleus and is then transcribed by the host polymerase II, leading to the transient expression. The resulting mRNA transcript (capped and polyadenylated) is then exported to the cytoplasm for translation. After approximately 24 to 48 hours of incubation,sections of infiltrated leaves can be sampled for microscopyor biochemical analyses. Agroinfiltration permits large numbers (hundreds to thousands) of cells to be transfected simultaneously. For in vitro encapsidation, purified virions of BMV are dissociated into capsid protein by dialyzing against dissociation buffer containing calcium chloride followed by removal of RNA and un-dissociated virions by centrifugation. Genome depleted capsid protein subunits are then reassembled with desired viral genome components or non-viral components such as indocyanine dye.

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

A simple, efficient and robust way to synchronize the delivery of multiple viral components to plant cells via Agrobacterium-mediated transient expression is described. This approach is amenable for studying replication, encapsidation followed by in vitro reassembly of non-viral components into genome depleted optical viral ghosts suitable for biomedical applications.

간편하고 강력한 생체내에서과 체외에서</em바이러스 조립 유학을위한> 접근법

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

생물학

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

아데노바이러스 생산을 위한 효율적인 방법

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

생체공학

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

A Streamlined and Standardized Procedure for Generating High-Titer, High-Quality Adeno-Associated Virus Vectors Utilizing a Cell Factory Platform

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. Traditional approaches in research laboratories often involve extensive use of cell culture dishes to cultivate HEK293T cells, a process that can be both laborious and problematic. Here, a unique in-house method is presented, which simplifies this process with a specific cell factory (or cell stacks, CF10) platform. An integration of polyethylene glycol/aqueous two-phase partitioning with iodixanol gradient ultracentrifugation improves both the yield and purity of the generated AAV vectors. The purity of the AAV vectors is verified through SDS-PAGE and silver staining, while the ratio of full to empty particles is determined using transmission electron microscopy (TEM). This approach offers an efficient cell factory platform for the production of AAV vectors at high yields, coupled with an improved purification method to meet the quality demands for in vivo studies.

Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production

As the field of gene therapy continues to evolve, there is a growing need for innovative methods that can address these challenges. Here, a unique method is presented, which streamlines the process of generating high-yield and high-purity AAV vectors using a cell factory platform, meeting the quality standards for in vivo studies.

Cell Factory Platform을 활용하여 고역가, 고품질 아데노 관련 바이러스 벡터를 생성하기 위한 간소화되고 표준화된 절차

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

이중 요오딕사놀 밀도 구배 원심분리에 의한 AAV 분리

Suspension Culture Production and Purification of Adeno-Associated Virus by Iodixanol Density Gradient Centrifugation for In Vivo Applications

This protocol describes recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification by iodixanol density gradient centrifugation, a serotype-agnostic method of purifying AAV first described in 1999. rAAV vectors are widely used in gene therapy applications to deliver transgenes to various human cell types. In this work, the recombinant virus is produced by transfection of Expi293 cells in suspension culture with plasmids encoding the transgene, vector capsid, and adenoviral helper genes. Iodixanol density gradient centrifugation purifies full AAV particles based on particle density. Additionally, three steps are included in this now-ubiquitous methodology in order to increase total virus yield, decrease the risk of precipitation due to contaminating proteins, and further concentrate the final virus product, respectively: precipitation of viral particles from cell media using a solution of polyethylene glycol (PEG) and sodium chloride, the introduction of a second round of iodixanol density gradient centrifugation, and buffer exchange via a centrifugal filter. Using this method, it is possible to consistently achieve titers in the range of 1012 viral particles/mL of exceptional purity for in vivo use.

저자 스포트라이트: 전임상 애플리케이션을 위한 효율적인 아데노 관련 바이러스 분리

Adeno-associated virus is produced in suspension cell culture and purified by double iodixanol density gradient centrifugation. Steps are included to increase total virus yield, decrease the risk of virus precipitation, and further concentrate the final virus product. Expected final titers reach 1012 viral particles/mL and are suitable for pre-clinical in vivo use.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

요약

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