Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Science Foundation IOS-0.817.658.

Le procedure di zebrafish in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) alla Virginia Commonwealth University. 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> 4% PFA / PBS. Pesare 8 g di paraformaldeide (PFA) nella cappa. Sempre nella cappa, sciogliere il asciutta PFA in ~ 80 ml ​​di H 2 O distillata sotto agitazione e riscaldamento a 50 ° C. Mentre mescolando, aggiungere 3 - 10 gocce di fresca 1N NaOH fino PFA è completamente sciolto e la soluzione chiarisce. Togliere dal fuoco e aggiungere 100 ml di 2x tampone fosfato salino (PBS). Portare il volume a 200 ml con acqua distillata H 2 O. Raffreddare a RT e confermare pH di 7,4 prima dell&#39;uso. Conservare al buio a 4 ° C ma utilizzare entro una settimana. </li><li> Utilizzare 100% di metanolo senza supplementi. Utilizzare il 95% di etanolo senza supplementi. </li><li> Preparare fosfato-tamponata Tween (PBT). Supplemento PBS (PBS) con 0,1% di Tween-20. Aggiungi 0.5 ml di Tween-20 soluzione madre 20% a 100 ml 1x PBS. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare fosfato-tamponata Triton-X (PBTx). Supplemento PBS con 0,1% Triton X-100. Aggiungere 0,5 ml di 20% Triton X-100 magazzino a 100 ml di PBS. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 10% NGS / PBTx. blocchi normali siero di capra (NGS) non specifici siti di legame. NGS Conservare in aliquote a -20 ° C. Per utilizzare, aggiungere 1 ml a 9 ml PBTx. </li><li> Preparare 50% glicerolo / PBS. Mescolare parti uguali di fondo 2x PBS e 100% glicerolo. Conservare a temperatura ambiente. </li></ol> 2. Embryo Fixation <ol><li> . (Es., Β-actina: CAAX-GFP) Allevamento ottenere wild type (AB e WIK) o transgenici embrioni attraverso accoppiamenti naturali. Se lo si desidera, iniettare embrioni con costrutti o morpholinos, come descritto. 15,16 </li><li> Sollevare embrioni. Raccogliere embrioni e incubare a 28,5 ° C in presenza di 0,003% 1-fenil-2-tiourea (PTU) per bloccare la pigmentazione come descritto. 17 </su<html> p&gt; </li><li> Fissare. Quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato, 18, &#160; anestetizzare gli embrioni utilizzando MESAB, rimuovere l&#39;acqua sistema quanto più possibile e aggiungere fresca 4% PFA / PBS per 3 - 4 ore a RT. NOTA: A volte meno di 20 ore dopo la fecondazione (HPF), fissare prima dechorionation. A volte dopo 20 HPF, dechorionate prima della fissazione con due coppie di pinze punta fine sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Cambiare soluzioni. Trasferire gli embrioni utilizzando una vasta pipetta foro, come descritto. 17 Variazione soluzioni in 1,5 ml con tappo provette da microcentrifuga, semplicemente permettendo embrioni di stabilirsi per gravità senza centrifugazione. </li><li> Post-fissativo Dopo 3 -. 4 ore, rimuovere PFA / PBS, sostituire con il 100% di metanolo e conservare a -20 ° C per almeno 48 ore. NOTA: per la massima immunoreattività P-CaMK-II, limitare il tempo totale di memorizzazione metanolo per una settimana. </li></ol>&quot;&gt; 3. Immunocolorazione intero embrioni <ol><li> Posizionare un minimo di 10 embrioni per ogni condizione sperimentale in innevate provetta da 1,5 ml microcentrifuga, ed etichettarli. </li><li> Lasciare gli embrioni di stabilirsi. Rimuovere e scartare metanolo e reidratare con lavaggi progressive contenenti 0,5 ml di concentrazioni decrescenti di etanolo, come indicato nel passaggio successivo. Ogni passo è a 5 minuti di lavaggio con dondolo. </li><li> Progressivamente reidratare con questi 5 soluzioni: 66% etanolo / 33% PBTx, 33% etanolo / 66% PBTx, 100% PBTx, 100% PBTx (questa è la prima ripetizione di PBTx), 100% PBTx (questa è la seconda ripetizione PBTx). </li><li> Rimuovere ultimo lavaggio PBTx. Aggiungere 0,5 ml di 10% NGS / PBTx. Incubare per almeno 1 ora a temperatura ambiente con dolce dondolio e poi rimuovere ed eliminare soluzione. </li><li> Preparare la soluzione anticorpo primario diluendo nel 10% NGS / PBTx. Se la co-immunostaining, usare degli anticorpi più alta affinità per primo. Per questo studio, incubare con il mouse anti-acetilata anticorpo monoclonale tubulina diluito 1: 500. per example, se ci sono 10 campioni, combinare 6 ml di soluzione madre di anticorpi con 3 ml di 10% NGS / PBTx quindi distribuire 0,3 ml di questa in ogni provetta. </li><li> Aggiungere 0,2 - 0,5 ml di anticorpo primario diluito in ogni provetta per immergere tutti gli embrioni. Incubare con dolce dondolio O / N a temperatura ambiente. </li><li> Al mattino, rimuovere ed eliminare soluzione di anticorpi. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx per lavare via anticorpo primario in eccesso. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte. </li><li> Dim plafoniere e diluire l&#39;anticorpo secondario fluorescente coniugato adeguato nel 10% NGS / PBTx in modo che ogni condizione contiene almeno 0,5 ml. Con il topo anti-acetilata anticorpo primario tubulina, utilizzare il verde-colorante fluorescente capra anti-IgG di topo ad una diluizione 1: 500. </li><li> Incubare anticorpo secondario per 4 ore con leggera oscillazione a RT al buio. D&#39;ora in poi, il processo di campioni sotto luci soffuse e incubare in un contenitore scuro o avvolgendo in un foglio di alluminio. </li><li>Al termine dell&#39;incubazione, rimuovere e scartare la soluzione di anticorpo secondario. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx per lavare. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte. </li><li> Se la co-immunostaining, ottenere il secondo anticorpo primario da una specie diversa rispetto al primo anticorpo primario. In questi studi, seguire l&#39;anticorpo CaMK-II di coniglio anti-fosfo dal colorante coniugato capra anti-coniglio anticorpo secondario rosso fluorescente IgG. </li><li> Diluire coniglio anti-fosfo-CaMK II anticorpi 1:20. Per ogni tubo di embrioni, la sospensione in 0,3 ml di 10% NGS / PBTx, quindi aggiungere 15 ml di soluzione madre di anticorpi. </li><li> Assicurarsi che gli embrioni sono immersi e le luci si abbassano. Incubare con dolce O dondolo / N a RT al buio. </li><li> La mattina sotto le luci soffuse, rimuovere ed eliminare soluzione di anticorpi. Aggiungere 0,5 ml 2% NGS / PBTx. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte. </li><li> Mantenere plafoniere fioca e abbastanza del appropriata fluorescenza conju diluiregated anticorpo secondario in modo che ogni condizione contiene almeno 0,5 ml. In questo studio, diluire il colorante coniugato capra anti-IgG di coniglio anticorpi rosso fluorescente secondaria (canale rosso) 1: 500 nel 10% NGS / PBTx. </li><li> Incubare secondo anticorpo secondario per 4 ore con leggera oscillazione a RT al buio. </li><li> Alla fine di questa incubazione e sotto le luci soffuse, rimuovere ed eliminare la soluzione di anticorpo secondario. Aggiungere 0,5 ml PBTx. Agitare delicatamente per 5 min. Rimuovere e scartare la soluzione. Ripetere due volte. Conservare in entrambi PBTx o il 50% glicerolo / PBS a seconda della procedura di imaging. </li></ol> 4. confocale Imaging and Processing <ol><li> Monte embrioni per l&#39;imaging. Posizionare 1 - 5 embrioni su un vetrino. Creare una camera tra il vetrino principale e la diapositiva utilizzando frammenti coprioggetto su ciascun lato della camera. Tipicamente, quattro # 1 coprioggetto sono usati per fare queste pile distanziatori senza incollarsi. NOTA: Nessun mezzo di montaggio è necessario. </li><li> Utilizzare una immersione in olio 100Xobiettivo di portare singolo embrione a fuoco con luce trasmessa. Spegnere la luce. Accendere microscopio confocale. Garantire che i laser appropriate (verde e / o rosso) sono accesi e accessary messa a fuoco remota è impegnata. </li><li> Attivare il programma confocale. Nella &quot;barra Acquisisci&quot;, selezionare l&#39;obiettivo corretto. Nella barra &quot;XY di base&quot;, impostare le dimensioni dell&#39;immagine a 1.024 facendo clic sul pulsante 1.024. </li><li> Nella &quot;Laser e Detector&quot; bar, clicca con il 488 box rosso e il verde 568 casella per attivare il laser e rivelatore per ciascun canale. Impostare pinhole a medio e regolare il guadagno nella barra &quot;Gain&quot; di ciascun canale da visualizzare. </li><li> Nella barra &quot;Acquisire Impostazioni&quot;, cliccare su &quot;Live&quot; per iniziare l&#39;acquisizione di immagini. Nella barra &quot;View Settings&quot;, deselezionare la casella &quot;Forza integrale Zoom&quot; al centro nella finestra &quot;Live&quot;. </li><li> Nella barra &quot;Acquisisci impostazioni&quot;, nella scheda &quot;Z&quot;, scorrere i livelli dell&#39;immagine. Dopo aver selezionato il number di sezioni ottiche incorporare nella immagine, passare a un certo punto nel &quot;centro&quot; del piano z. </li><li> Nella scheda &quot;Z&quot;, fare clic sulla piccola scatola rossa &quot;di riferimento&quot;. Questo azzererà la RFA nel punto prescelto come &quot;centro&quot;. Nella casella &quot;Step Size&quot;, selezionare lo spessore degli strati (tra 0,25 micron e 2,0 micron è l&#39;ideale). Prestare attenzione alla casella &quot;Formato File&quot; e cercare di limitare a 1 GB. NOTA: in genere, fino a 40 sezioni ottiche di 0,5 - 1,0 micron si ottengono, ma il numero di sezioni può essere determinato empiricamente. </li><li> Per trovare l&#39;estremo superiore dell&#39;immagine, fare clic sul cerchio accanto a &quot;Top&quot; e passare attraverso gli strati z. Ora clicca il cerchio accanto a &quot;basso&quot;, il computer avrà l&#39;immagine di nuovo al livello come il centro. Ancora spostarsi attraverso gli strati di trovare l&#39;estremo inferiore dell&#39;immagine. </li><li> Clicca su &quot;vivere&quot; ancora una volta nei &quot;Acquisisci Impostazioni&quot; di dialogo per fermare il laseracquisizione. In questo pannello, selezionare le caselle rosse etichettati media e Z-stack. Queste scatole diventa verde. </li><li> Nella casella &quot;Acquisire Impostazioni&quot;, fai clic su &quot;Single&quot; per acquisire l&#39;intera serie di immagini. È possibile monitorare lo stato di avanzamento, come la scansione in entrambi i canali e attraverso l&#39;intero z-stack. </li><li> Per risparmiare, fare clic sulla finestra del volume e fare clic su &quot;Salva con nome&quot; e il nome del file. Salvare come file &quot;.ids&quot;. Per volume di rendere il file mentre lo z-stack è ancora aperto, selezionare i dati menu a discesa e clicca su &quot;il volume di rendering&quot;. Salvare il file reso come un file TIFF. Questa è l&#39;immagine proiettata che sono presenti in questa pubblicazione. </li></ol>

<ol>
	<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+during+embryonic+development.">Calcium signalling during embryonic development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).</li><li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signalling+and+early+embryonic+patterning+during+zebrafish+development.">Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).</li><li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+at+fertilization+and+in+early+development.">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).</li><li>Yuen, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ca(2+)+signaling+in+the+external+yolk+syncytial+layer+during+the+late+blastula+and+early+gastrula+periods+of+zebrafish+development.">Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).</li><li>Tombes, R. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+free+calcium+and+mitosis+in+mammalian+cells:+anaphase+onset+is+calcium+modulated,+but+is+not+triggered+by+a+brief+transient.">Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient.</a> J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).</li><li>Hudmon, A., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Ca2+/Calmodulin-Dependent+Protein+Kinase+II:+The+Role+of+Structure+and+Autoregulation+in+Cellular+Function.">Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).</li><li>Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Evolution+of+Multifunctional+Ca2+/CaM-dependent+Protein+Kinase+(CaMK-II).">Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II).</a> Gene. 322, 17-31 (2003).</li><li>Braun, A. P., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multifunctional+Calcium/Calmodulin-Dependent+Protein+Kinase:+From+Form+to+Function.">The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function.</a> Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).</li><li>Rich, R. C., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-directed+function+of+calmodulin+in+autophosphorylation+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).</li><li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5-mediated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+is+necessary+for+zebrafish+cardiac+and+pectoral+fin+morphogenesis.">Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 175-184 (2009).</li><li>Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+CaMK-II+genes+during+early+zebrafish+embryogenesis.">Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis.</a> Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).</li><li>Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+membrane+targeted+CaMK-II+in+the+zebrafish+Kupffer's+vesicle+is+required+for+left-right+asymmetry.">The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry.</a> Development. 137, 2753-2762 (2010).</li><li>Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMK-II+is+a+PKD2+target+that+promotes+pronephric+kidney+development+and+stabilizes+cilia.">CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia.</a> Development. 138, 3387-3397 (2011).</li><li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMK-II+activation+is+essential+for+zebrafish+inner+ear+development+and+acts+through+Delta-Notch+signaling.">CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling.</a> Dev Biol. 381, 179-188 (2013).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , e1113 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Obara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+immunolocalization+and+function+in+zebrafish.">Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).</li><li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+whole+mount+in+situ+hybridization+within+zebrafish+embryos+to+study+gene+expression+and+function.">High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function.</a> J Vis Exp. , e50644 (2013).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature. 3, 59-69 (2008).</li><li>Harris, P., Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+tubulin-containing+structures+in+the+egg+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus+from+fertilization+through+first+cleavage.">Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage.</a> J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il metodo / metanolo PFA è stato sviluppato in questo laboratorio con l&#39;obiettivo primario di ottimizzare la immunolocalizzazione del fosfo-T 287 -CaMK-II epitopi durante lo sviluppo zebrafish. Questo metodo localizzato successo P-CaMK-II durante la formazione di diversi organi ciliati compreso il KV zebrafish, 12 orecchio interno 14 e reni. 13 In particolare nella fase KV, questa tecnica era necessario. Il successo di questo metodo è probabilmente dovuto ad una combinazione di a) minimizzazione autofluorescenza, b) la conservazione dell&#39;epitopo fosfo-CaMK-II e c) una migliore accessibilità dell&#39;epitopo agli anticorpi. Un limite principale di questo approccio è il tempo di stoccaggio in metanolo. Mentre immunoreattività di P-CaMK-II è massima dopo due giorni in metanolo a -20 ° C, la reattività di questo epitopo viene persa dopo una settimana di conservazione in metanolo. Non è chiaro se in questo momento il gruppo fosfato è hydrolyzed o ulteriori denaturazione si verifica che diminuisce immunoreattività. Metanolo / EGTA a -20 ° C è un fissativo tradizionalmente rapida per preservare strutture ricche di tubulina durante lo sviluppo di embrioni precoci. 22 Tuttavia, metanolo da solo non è auspicabile per conservare le strutture morfologia o anche come il citoscheletro actina e deve essere preceduto da PFA. Ulteriori vantaggi di questo approccio sono che conserva anche altri epitopi come F-actina tubulina e acetilata e non elimina la fluorescenza nativa di GFP. Altri fissativi, come fissativo di Dent, sono superiori ad altri epitopi 13 e rimangono compatibile con P-CaMK-II colorazione, anche se P-CaMK-II colorazione è più debole di fissazione di Dent di PFA / metanolo. Dal momento che fosfo-proteine ​​sono prevalenti in vie di segnalazione che sono attivi durante lo sviluppo precoce, fissativo di Dent e PFA / metanolo sono raccomandati come due fissativi per altri fosfo-epitopi in zebembrioni rafish. Nello sviluppo di applicazioni con questa tecnica per altre proteine ​​e dei loro anticorpi, è stato utile avere anticorpi che sono anche reattivi su immunoblot e di aver clonato e le proteine ​​con le quali gli anticorpi possono essere convalidati sovraespresso. 12 Vale la pena lo sforzo per ottimizzare le tecniche di immunolocalizzazione perché a) in grado di verificare la soppressione del gene a livello proteico e b) consente lo sviluppo di modelli di azione. In questo laboratorio, i risultati di questi test hanno permesso la formulazione di modelli attraverso cui funzioni CaMK-II. Ad esempio, la sua posizione nel KV è transitoria e asimmetrica, come il ruolo di questo organo. Nel rene, la sua posizione sul lato apicale delle cellule duttali pronephric suggerisce ruoli che rispondono ai segnali del condotto. Infine, l&#39;attivazione di questo enzima in specifici puncta intenso alla base kinocilia orecchio suggerisce un segnale Ca 2+ localizzata. I metodi descritti quidovrebbe anche essere utile a qualsiasi investigatore che cerca di ottenere immagini ad alta risoluzione di qualsiasi tipo di cellula embrionale in due canali fluorescenti.

The techniques described here are the outcome of studies that have sought to define downstream targets of Ca2+ signals during events that occur during early development, including fertilization, gastrulation, somitogenesis and trunk, eye, brain and organ formation.1-3 The original discoveries of embryonic Ca2+ signaling were dependent on the use of natural and engineered Ca2+ indicators, such as aequorin4 and fura-2.5 Even with current technology, the detection of transient elevations of Ca2+ requires cumbersome analytical tools and does not reveal the targets of such Ca2+ signals. 
This laboratory investigates Ca2+ signals that act through the Ca2+/calmodulin-dependent (multifunctional) protein kinase known as CaMK-II, an enzyme that is enriched in the central nervous system and originally identified as a regulator of long-term potentiation.6 CaMK-II is not brain-specific, is widely expressed and highly conserved throughout the entire lifespan and bodies of species throughout the animal kingdom, including invertebrates.7,8 CaMK-II has the unique capability of sustaining its own activity even after Ca2+ levels have diminished due to its ability to autophosphorylate at Thr287. In this autophosphorylated state, CaMK-II remains active in a Ca2+/CaM-independent manner, until dephosphorylated.6 Thus, the localization of phosphorylated CaMK-II (Thr287) can identify cells in which natural, relevant Ca2+ elevations have occurred. 
An antibody against autophosphorylated (P-Thr287) mammalian CaMK-II has been well-characterized and was initially used to localize activated CaMK-II in brain tissue.9 Zebrafish (Danio rerio) have seven CaMK-II genes10,11 whose protein products contain a sequence of MHRQE[pT287]VECLK in this region.10,11 This sequence is very similar to the phosphopeptide antigen used to create this rabbit polyclonal antibody (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) and therefore it was not a complete surprise that this antibody cross-reacted with zebrafish CaMK-II. This laboratory showed that this antibody reacts with zebrafish CaMK-II in proportion to autophosphorylation and Ca2+/CaM-independent activity.12 Additional pan-specific CaMK-II antibodies have also been shown to cross-react with zebrafish CaMK-II.13
This antibody has been used to demonstrate that zebrafish CaMK-II is preferentially activated in cells on one side of the zebrafish Kupffer's Vesicle (KV), the ciliated organ necessary for establishment of left/right asymmetry.12 This antibody was used to demonstrate that CaMK-II is transiently activated in four adjacent cells on the left side of the KV during the exact same developmental phase that organ positioning is determined.12 In addition to the Kupffer's Vesicle (KV), autophosphorylated (P-T287) was also located in specific intracellular sites in other ciliated tissues including the kidney, neuromasts, and inner ear.12,13 In the zebrafish kidney, P-T287-CaMK-II is enriched along the apical border of ciliated ductal cells and within cloacal cilia where it influences their assembly.13 Finally, in the developing inner ear, P-T287-CaMK-II is intensely concentrated at the base of cilia and influences cell differentiation through the Delta-Notch signal pathway.14 In summary, the detection of activated CaMK-II has pinpointed sites of intracellular Ca2+ release and illuminated potential new signaling pathways.
These discoveries were completely dependent on developing a sensitive and accurate method to localize activated (P-T287-autophosphorylated) CaMK-II. The methods to fix and immunostain the zebrafish KV, kidney and inner ear are described. The limitations of this technique are also described. These techniques should be useful to any investigator who seeks to obtain high-resolution images in two fluorescent channels of not just phospho-epitopes, but any epitope, during early vertebrate development.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-7629</td>
			<td style="width:347px;">0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td style="width:347px;">Goat polyclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A11008</td>
			<td style="width:347px;">Goat polyclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 phalloidin</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td>Preferentially binds to F-actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa568 anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A11004</td>
			<td style="width:347px;">Goat polyclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa568 anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A11011</td>
			<td style="width:347px;">Goat polyclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">anti-acetylated a-tubulin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td style="width:347px;">Mouse monoclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:247px;">anti-phospho-T287 CaMK-II</td>
			<td style="width:175px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">06-881</td>
			<td style="width:347px;">Rabbit polyclonal, use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">anti-total CaMK-II</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">611292</td>
			<td style="width:347px;">Mouse monoclonal, use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S96857</td>
			<td style="width:347px;">Lab grade, 95% denatured</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">16004-330</td>
			<td>#1&#160; thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>Standard glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Methanol</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A411</td>
			<td>Store in freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-038</td>
			<td>capped tubes, not sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16210-064</td>
			<td>Aliquot 1ml tubes, store in freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td>Reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:175px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:119px;">119-069-131</td>
			<td>10X stock solution or made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">BP-151</td>
			<td>10% solution in water, store at room temp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85113</td>
			<td>10% solution in water, store at room temp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">E-600</td>
			<td>Mount on vibration-free table</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">C1 Plus two-laser scanning confocal</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">C1 Plus</td>
			<td>Run by EZ-C1 program, but upgrades use &#34;Elements&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining phospho-epitopes in ciliated organs of whole mount zebrafish embryos

La rapida proliferazione delle cellule, l&#39;espressione tessuto-specifica di geni e la nascita di reti di segnalazione caratterizzano sviluppo embrionale precoce di tutti i vertebrati. La cinetica e la posizione dei segnali - anche all&#39;interno di singole cellule - negli embrioni integra l&#39;identificazione di importanti geni dello sviluppo. tecniche di immunoistochimica sono descritte che hanno dimostrato di definire la cinetica di segnali intracellulari animali e intere in strutture piccole come cilia primaria. Le tecniche per il fissaggio, di imaging e di elaborazione delle immagini utilizzando un microscopio a scansione laser confocale composto può essere completato in soli 36 hr. Zebrafish (Danio rerio) è un organismo desiderabile per gli investigatori che cercano di condurre studi in una specie di vertebrati che è conveniente e rilevanti per le malattie umane. ko genetica o abbattimenti devono essere confermati dalla perdita del prodotto proteico reale. Tale conferma della perdita di proteinepuò essere realizzato utilizzando le tecniche descritte qui. Gli indizi in vie di segnalazione possono essere decifrati utilizzando anticorpi che sono reattivi con le proteine ​​che sono stati post-traduzionali modificati dalla fosforilazione. Preservare e ottimizzare lo stato fosforilato di un epitopo è quindi fondamentale per questa determinazione e si realizza con questo protocollo. Questo studio descrive tecniche per risolvere embrioni durante il primo 72 hr di sviluppo e co-localizzare una varietà di epitopi rilevanti con cilia nella zona di Kupffer Vesicle (KV), il rene e l&#39;orecchio interno. Queste tecniche sono semplici, non richiedono la dissezione e può essere completato in un periodo relativamente breve di tempo. Proiezione pile di immagini confocale in una singola immagine è un mezzo utile per la presentazione di questi dati.

Condizioni ottimali per la visualizzazione di fosfo-epitopi I metodi che descrivono la immunolocalizzazione di epitopi della proteina negli embrioni di zebrafish sono state relativamente scarse rispetto a quelle per la localizzazione mRNA tramite ibridazione in situ. Fissativi utilizzati nella localizzazione epitopi di proteine ​​nelle cellule ciliate di embrioni di zebrafish hanno incluso 4% PFA / PBS e fissativo di Dent, che è una miscela di metanolo e DMSO. 19 La localizzazione di RNA da montare tutto ibridazione in situ (WISH) è ottenuto in genere utilizzando PFA seguita da stoccaggio in 100% di metanolo. 20,21 I nostri studi hanno rivelato che la combinazione WISH fissativo, quando limitando il tempo in metanolo per due a sette giorni, è stato di gran lunga superiore a qualsiasi altro fissativo per immunolocalizzazione con l&#39;anticorpo P-CaMK-II . Il segnale ottenuto con questa combinazione PFA / metanolo era also significativamente maggiore rispetto a quando fissativo di Dent, 4% PFA / PBS o metanolo sono stati usati da soli, a seconda del tempo di sviluppo e posizione all&#39;interno dell&#39;embrione. Quando si ottimizza la tecnica qui e per ogni volta fissativo e sviluppo usato descritto, un campione di controllo è stato preparato in cui sono seguite tutte le fasi, ad eccezione che l&#39;anticorpo primario è stato omesso. Tali campioni di controllo mancava un segnale fluorescente quando ripreso nelle stesse condizioni sopra descritte. Questo controllo è consigliato per altri investigatori replicare questo approccio con qualsiasi anticorpo. La combinazione / metanolo fissativo PFA prodotto il più forte segnale P-CaMK-II ed è anche compatibile con immunocolorazione per tubulina acetilata, che è un marcatore standard per cilia. Punto di vista evolutivo, il primo organo ciliate che emerge ed è stato ripreso in questi studi è vescicola del Kupffer (KV). Il KV si trova all&#39;estremità posteriore del notochord come mostrato nella fase 12-somite (15 HPF) (Figura 1). Il KV è un organo transitorio ed è responsabile di asimmetria sinistra-destra. Emerge a 2-somite stadio (12 HPF) e scompare attorno al palco 18-somite. Battere cilia primaria generare un flusso circolare di fluido, che porta ad un aumento di Ca2 + nelle cellule ciliate che rivestono il KV e l&#39;attivazione di CaMK-II in posizioni discrete (Figura 1). Appare P-CaMK-II reattività e scompare su un lato del KV finché cilia battono. 12 In questa prima fase, i livelli totali embrionali CaMK-II sono ancora solo metà del livello al 24 HPF e un decimo del livello a 3 giorni di sviluppo. 11 Forse perché espressione totale CaMK-II è relativamente bassa a 15 HPF, alcun miglioramento nella tecnica immunocolorazione in questa fase è particolarmente importante. betweit 24 e 72 HPF di sviluppo, P-CaMK-II appare sulla superficie apicale delle cellule ciliate che rivestono le regioni specifiche dei dotti pronephric (figure 2,3). L&#39;immunoreattività del totale CaMK-II lungo l&#39;intero condotto di pronephric e tutta somiti adiacenti (Figura 2) mostra che solo un sottoinsieme di embrionale CaMK-II è attivato (P-CaMK-II). Le condizioni sono di fissazione coerente con il mantenimento GFP fluorescenza Queste tecniche di fissaggio sono compatibili anche con conservando verde di fluorescenza proteina fluorescente (GFP) senza aumento (Figura 3). Nel CaMK-II GFP-tagged costrutto che viene utilizzato in questa figura, GFP mantiene fluorescenza sufficiente se PFA / metanolo fissazione e successiva immunocolorazione. In vista alto ingrandimento delle cellule che rivestono condotto pronephric (figura 3), the l&#39;espressione mosaico di GFP-CaMK-II può essere visualizzato in cellule che sono state anche immunostained per P-CaMK-II. L&#39;orecchio embrionale zebrafish è un altro tessuto in cui l&#39;elevazione di Ca 2+, agendo attraverso CaMK-II, influenza il suo sviluppo. 14 orecchie zebrafish appaiono normalmente a circa un giorno di sviluppo. In questo momento, CaMK-II è intensamente attivato alla base dei kinocilia ea livelli inferiori lungo il kinocilium (Figura 4). Questo insieme di immagini dimostra che questa tecnica di fissazione e immunolocalizzazione può rilevare la colorazione all&#39;interno cilia, una struttura la cui sezione trasversale è inferiore a 1 micron. Queste ciglia mantengono la loro struttura nel corso di questo processo di fissazione e immunocolorazione. Un ulteriore esempio di contrasto bicolore nell&#39;orecchio interno in un secondo tempo di sviluppo è stato ottenuto mediante colorazione con entrambi Alexa 488phalloidin e tubulina anti-acetilati seguito da un Alexa 568 contrassegnati anticorpo secondario (Figura 5). È interessante notare che il metodo / metanolo fissazione PFA conserva sia F-actina e tubulina, che non è vero per tutti i fissativi. Questo esempio è mostrato uno a colori fusa per tutta orecchio e poi per sottoregioni. 14 Un ultimo esempio rappresentativo di contrasto bicolore è stato ottenuto con un ceppo di pesce che Embrioni prodotti con GFP membrana targeting (Figura 6). Membrana GFP mirati non è collegata a nessun altro proteine ​​e si perde quando estratto con metanolo, quindi, questa immagine è stata ottenuta dal pesce che sono stati fissati con PFA solo. Questo risultato suggerisce che il trattamento metanolo estrae membrane, quindi non è raccomandato per proteine ​​che possono essere membrana esclusivamente vincolati. Il segnale P-CaMK-II in questa figura è diminuita rispetto a quello ottenuto se metanoolo anche usato, ma questo dimostra che in questa fase e la posizione (rene) dello sviluppo dell&#39;embrione, il segnale è abbastanza forte da essere rilevato senza trattamento metanolo. Questo non è vero in fase di KV,. Ad esempio, il metanolo è necessario per visualizzare i P-CaMK-II immunocolorazione. In questo esempio viene mostrato solo come immagine fusa in cui dotto pronephric del rene è adiacente al muscolo del tronco. In sintesi, il / metanolo metodo di fissazione PFA qui descritto è compatibile con la conservazione della GFP e con colorazione per F-actina, tubulina acetilata, totale CaMK-II e P-CaMK-II. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig1.jpg" /> Figura 1. P-CaMK-II contrastate per acetilato tubulina (cilia) in KV Zebrafish. Vista di un singolo Live Stage 12 somite (12 ss) embrione rivela la posizione posteriore del KV dal arrowhead (vista laterale, A) e il cerchio all&#39;interno della scatola (vista ventrale, B). Embrioni in questa fase sono stati fissati con PFA / metanolo. Gli embrioni sono stati immunostained per tubulina acetilata seguito da un 488 anticorpo secondario marcati con Alexa (canale verde). Successivamente, il anticorpo policlonale di coniglio contro P-CaMK-II è stata seguita da un 568- anticorpo secondario marcato Alexa (canale rosso). Proiezioni di immagini fluorescenti due canali sono stati acquisiti come descritto ad ingrandimenti progressivamente crescenti (C, D). Barra di scala = 10 micron. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 12 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig2.jpg" /> Figura 2. P-CaMK-II contrastate perTotale CaMK-II lungo rene Zebrafish. Un singolo embrione dechorionated al 30 HPF è stato fissato usando PFA / metanolo. Gli embrioni sono stati poi colorate per totale CaMK-II seguito dal anticorpo secondario marcato Alexa 488 (verde). Successivamente, l&#39;anticorpo primario P-CaMK-II è seguita l&#39;anticorpo secondario marcato Alexa 568 (rosso). La colorazione rivela un arricchimento della attivata CaMK-II (in rosso) lungo la superficie apicale delle cellule che rivestono i dotti del rene zebrafish pronephric che la somma delle CaMK-II si arricchisce ai confini somite del tessuto muscolare adiacente e tutto sarcomeri. Barra di scala = 50 micron. Queste immagini sono state acquisite con un ingrandimento inferiore a quello descritto nel testo per visualizzare l&#39;intero organo. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 13 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3. P-CaMK-II contatore Imaged per GFP in cellule renali Zebrafish. Questo embrione 30 HPF è stato iniettato con un cDNA codificante un dominante negativo GFP-CaMK-II. 13 Tale inserimento mostrano tipicamente espressione mosaico. L&#39;embrione è stato fissato usando PFA / metanolo e poi immunostained per P-CaMK-II utilizzando un Alexa 568 anticorpo secondario marcato. Imaging rivela che GFP persiste attraverso PFA / metanolo fissazione, reidratazione, il blocco e immunocolorazione. Barra di scala = 10 micron. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 13 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig4.jpg" /> Figura 4 </strong&gt;. P-CaMK-II di contrasto con acetilato tubulina in Ear Zebrafish interno. Questo embrione 30 HPF è stato fissato usando PFA / metanolo. L&#39;anticorpo anti-acetilato tubulina è stato seguito in ordine dal anticorpo Alexa 488 -labeled secondaria, l&#39;anticorpo P-CaMK-II e la Alexa 568 marcato anticorpo secondario. La colorazione rivela che P-CaMK-II è presente lungo le ciglia orecchio interno e co-localizza con tubulina acetilato. Barra di scala = 5 micron. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 14 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig5.jpg" /> Figura 5. Actina e tubulina acetilato in Ear Zebrafish interno. Una tre giorni di età (72 HPF) zebrafish è stato fissato e immunostained per acetilata tubulin utilizzando Alexa 568 -labeled anticorpi secondari, seguita dalla visualizzazione di actina usando Alexa 488 falloidina. Cilia nonché innervazione assonale dell&#39;orecchio è rivelato da tubulina acetilata (in rosso) e le strutture di F-actina includono fibre muscolari (in verde). Due regioni sensoriali ciliate dell&#39;orecchio zebrafish sono mostrati in modo più dettagliato: la macula anteriore (mattino) e crista posteriore (PC). Barra di scala = 10 micron. Questa cifra viene modificato da una precedente pubblicazione. 14 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig6.jpg" /> . Figura 6 P-CaMK-II contatore Imaged per membrana GFP nel rene Zebrafish Questa singola immagine unita in cui la β-actina:. CAAX-GFP embrione (30 HPF) è stato fissato e macchiato per P-CaMK-II seguito dal anticorpo secondario marcato Alexa 568. La colorazione rivela un arricchimento della attivata CaMK-II (in rosso) lungo la superficie apicale delle cellule che rivestono i dotti del rene zebrafish pronephric. Queste cellule duttali del rene sono immerso appena sotto il tessuto muscolare ed entrambi sono contrassegnati mediante l&#39;espressione di membrana mirata GFP (in verde). Barra di scala = 50 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos at JoVE.com

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l&#39;attivazione di specifiche proteine.

Immunocolorazione fosfo-epitopi in Ciliated Organi di monte intero embrioni di zebrafish

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

immunostaining-phospho-epitopes-ciliated-organs-whole-mount-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.9K Views.  Virginia Commonwealth University.  Le tecniche sono descritte a immunostain fosfo-epitopi in interi embrioni di zebrafish e quindi condurre a due colori confocale a fluorescenza localizzazione in strutture cellulari piccoli come ciglia primarie. Le tecniche di fissaggio e di imaging possono definire la posizione e cinetica di comparsa o l'attivazione di specifiche proteine. 

Video: Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn and 70Zn) which are naturally fractionated between mouse organs. We first show how to dissolve the different organs in order to free the Zn atoms; this step is realized by a mixture of HNO3 and H2O2. We then purify the zinc atoms from all the other elements, in particular from isobaric interferences (e.g., Ni), by anion-exchange chromatography in a dilute HBr/HNO3 medium. These first two steps are performed in a clean laboratory using high purity chemicals. Finally, the isotope ratios are measured by using a multi-collector inductively-coupled-plasma mass-spectrometer, in low resolution. The samples are injected using a spray chamber and the isotopic fractionation induced by the mass-spectrometer is corrected by comparing the ratio of the samples to the ratio of a standard (standard bracketing technique).&#160;This full typical&#160;procedure produces an isotope ratio with a 50 ppm (2 s.d.) reproducibility.

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Alte le misure di precisione di zinco isotopiche applicate a mouse Organi

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

Ricerca

Chimica

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Radiomarcatura e quantificazione dei livelli cellulari di fosfoinositidi da alte prestazioni cromatografia liquida accoppiata flusso scintillazione

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Sintesi di proteine ​​bioconiugati<em&gt; via</em&gt; Chimica cisteina-maleimmide

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

Accesso prezioso Ligand Supporti per metalli di transizione: una versione modificata, Intermedio Scala Preparazione di 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound electrons with neutral molecules/atoms. State-of-the-art in vacuo anion generation techniques allow application to a broad range of atomic, molecular, and cluster anion systems. These are separated and selected using time-of-flight mass spectrometry. Electrons are removed by linearly polarized photons (photo detachment) using table-top laser sources which provide ready access to excitation energies from the infra-red to the near ultraviolet. Detecting the photoelectrons with a velocity mapped imaging lens and position sensitive detector means that, in principle, every photoelectron reaches the detector and the detection efficiency is uniform for all kinetic energies. Photoelectron spectra extracted from the images via mathematical reconstruction using an inverse Abel transformation reveal details of the anion internal energy state distribution and the resultant neutral energy states. At low electron kinetic energy, typical resolution is sufficient to reveal energy level differences on the order of a few millielectron-volts, i.e., different vibrational levels for molecular species or spin-orbit splitting in atoms. Photoelectron angular distributions extracted from the inverse Abel transformation represent the signatures of the bound electron orbital, allowing more detailed probing of electronic structure. The spectra and angular distributions also encode details of the interactions between the outgoing electron and the residual neutral species subsequent to excitation. The technique is illustrated by the application to an atomic anion (F&#8722;), but it can also be applied to the measurement of molecular anion spectroscopy, the study of low lying anion resonances (as an alternative to scattering experiments) and femtosecond (fs) time resolved studies of the dynamic evolution of anions.

Here, we present a protocol for photoelectron imaging of anionic species. Anions generated in vacuo and separated by mass spectrometry are probed using velocity mapped photoelectron imaging, providing details of anion and neutral energy levels, anion and neutral structure and the nature of the anion electronic state.

Imaging di fotoelettroni di anioni illustrato da 310 Nm distaccamento di F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a simple protocol for the multifunctional surface modification of NDs by using mussel-inspired polydopamine (PDA) coating. In addition, the functional layer of PDA on NDs could serve as a reducing agent to synthesize and stabilize metal nanoparticles. Dopamine (DA) can self-polymerize and spontaneously form PDA layers on ND surfaces if the NDs and dopamine are simply mixed together. The thickness of a PDA layer is controlled by varying the concentration of DA. A typical result shows that a thickness of ~5 to ~15 nm of the PDA layer can be reached by adding 50 to 100 &#181;g/mL of DA to 100 nm ND suspensions. Furthermore, the PDA-NDs are used as a substrate to reduce metal ions, such as Ag[(NH3)2]+, to silver nanoparticles (AgNPs). The sizes of the AgNPs rely on the initial concentrations of Ag[(NH3)2]+. Along with an increase in the concentration of Ag[(NH3)2]+, the number of NPs increases, as well as the diameters of the NPs. In summary, this study not only presents a facile method for modifying the surfaces of NDs with PDA, but also demonstrates the enhanced functionality of NDs by anchoring various species of interest (such as AgNPs) for advanced applications.

A facile protocol is presented to functionalize the surfaces of nanodiamonds with polydopamine.

Modifica di bio-ispirati Polydopamine superficie di nanodiamanti e sua riduzione delle nanoparticelle d'argento

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

Assaggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione composta, i valori IC50, l'attività Artifactual e l'attività intera delle cellule

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...