Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı hibe IOS-0817658 tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol zebrabalıkları prosedürler Virginia Commonwealth Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Reaktiflerin 1. Hazırlık <ol><li> % 4 PFA / PBS ile yıkandı. davlumbaz paraformaldehit 8 g (PFA) tartılır. Hala davlumbaz, ~ 80 ml ​​50 ° C, karıştırma ve ısıtma ile damıtılmış H2O kuru PFA çözülür ise. PFA tamamen çözülene ve çözelti açıklık kadar taze 1 N NaOH 10 damla - karıştırılırken, 3 ekleyin. Ateşten ve 100 ml 2x fosfat tamponlu tuz (PBS) ilave edin. Damıtılmış H2O 200 ml hacim getirmek Oda sıcaklığına soğutun ve kullanımdan önce 7.4 pH teyit etmektedir. 4 ° C de karanlıkta deposu ancak bir hafta içinde kullanın. </li><li> herhangi bir ek olmadan% 100 metanol kullanın. herhangi bir ek olmadan% 95 etanol kullanın. </li><li> Fosfat tamponlu Tween (PBT) hazırlayın. % 0.1 Tween-20 ile fosfat tamponlu tuz (PBS) Supplement. 0 ekleyin.PBS 1X 100 ml% 20 Tween-20 stok çözeltisi 5 mi. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Fosfat tamponlu Triton-X (PBTx) hazırlayın. % 0.1 Triton X-100 ile PBS Supplement. PBS, 100 ml bir% 20 Triton X-100 stokunun 0.5 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> % 10 NGS / PBTx hazırlayın. Normal keçi serumu (NGS) blok spesifik olmayan bağlanma siteleri. -20 ° C&#39;de parçalar halinde saklayın NGS. Kullanmak 9 ml PBTx 1 ml ekleyin. </li><li> % 50 gliserol / PBS hazırlayın. 2x PBS ve% 100 gliserol iyice eşit parçaya karıştırın. Oda sıcaklığında saklayın. </li></ol> 2. Embriyo Sabitleme <ol><li> . (., Örneğin β-aktin: CAAX-GFP) Damızlık elde vahşi tip (AB ve WIK) veya transgenik doğal çiftleşmelerin aracılığıyla embriyolar. İstenirse açıklandığı gibi, yapıları veya morpholinos ile embriyolar enjekte edilir. 15,16 </li><li> . Embriyolar kaldırın embriyolar toplayın ve tarif edildiği gibi pigmentasyon engellemek için% 0.003 1-fenil-2-tioüre (PTU) mevcudiyetinde 28.5 ° C&#39;de inkübe edin. 17 </su<html> p&gt; </li><li> Embriyolar istenilen gelişim aşamasına, 18 ulaştığında. Fix, &#160; , MESAB kullanılarak embriyolar anestezi mümkün olduğu kadar sistem, suyu buharlaştırmak ve 3 taze% 4 PFA / PBS ekleyin - oda sıcaklığında 4 saat. NOT: 20 saat sonra döllenme (hpf) daha az zamanlarda, dechorionation önce düzeltin. 20 hpf sonra zaman zaman, bir mikroskop altında ince nokta forseps iki çift kullanarak fiksasyon önce dechorionate. </li><li> Çözümler değiştirme. Geniş bir delik pipet kullanarak embriyoların transferi, tarif edildiği gibi. Mikrosantrifüj tüpleri şapkalı 1.5 ml 17 Değişim çözümleri, sadece embriyolar santrifüj olmadan yerçekimi ile yerleşmek için izin vererek. </li><li> Sonrası sabitleyici sonra 3 -. 4 saat, en az 48 saat boyunca -20 ° C&#39;de% 100 metanol ve mağaza ile yerine, PFA / PBS kaldırmak. NOT: maksimal P-CAMK-II immünoreaktivitesinde için, bir hafta toplam metanol saklama süresini sınırlamak. </li></ol>&quot;&gt; 3. Immün Tüm Embriyolar <ol><li> başlıklı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, her deneysel koşul için 10 embriyo az yerleştirin ve etiketlemek. </li><li> embriyolar yerleşmek için izin verin. Çıkarın ve metanol atmak ve bir sonraki aşamada gösterildiği gibi, etanol ve azalan konsantrasyonlarda 0.5 ml ihtiva eden aşamalı yıkama ile rehidrate. Her adım sallanan bir 5 dk yıkama olduğunu. </li><li> Kademeli bu 5 çözümleri ile rehydrate:% 66 etanol /% 33 PBTx,% 33 etanol / PBTx,% 100 PBTx,% 100 PBTx (bu PBTx ilk tekrarıdır),% 100 PBTx (bu ikinci tekrarı ise% 66 PBTx). </li><li> Geçen PBTx yıkama çıkarın. 0.5 ml% 10 NGS / PBTx ekleyin. hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca inkübe edilir ve akabinde çıkarın ve solüsyonu atın. </li><li> % 10 NGS / PBTx içinde seyreltilmesi birincil antikor çözüm hazırlayın. CO-immün, önce yüksek afinite antikor kullanımı. 500: Bu çalışma için, 1 seyreltilmiş fare anti-asetile tübülin monoklonal antikor ile inkübe edin. exampl içinE, 10 numune,% 10 NGS / PBTx 3 ml stok antikor çözeltisi 6 ul birleştirilir ve daha sonra, her tüpe, bu, 0.3 ml dağıtmak varsa. </li><li> Tüm embriyo sokmak için her bir tüpe seyreltilmiş birincil antikor 0.5 ml - 0.2 ekleyin. Oda sıcaklığında nazik sallanan O / N ile kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Sabah, kaldırmak ve antikor çözüm atın. Fazla birincil antikor yıkayacak 0.5 ml% 2 NGS / PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın. </li><li> tepe ışıkları Dim ve her bir durum, en azından 0.5 ml içerir, böylece% 10 NGS / PBTx uygun floresan-konjuge sekonder antikor seyreltin. : 500 oranında seyreltilmiş fare anti-asetillenmiş tübülin birincil antikor ile, 1 yeşil fluoresan boya keçi anti-fare IgG kullanın. </li><li> yumuşak karanlıkta oda sıcaklığında çalkalanarak 4 saat sekonder antikoru inkübe edin. silik ışıkları altında ve karanlık bir kapta inkübe veya alüminyum folyo ile sararak numuneler süreç, şu andan itibaren. </li><li>İnkübasyonun sonunda, kaldırma ve ikincil antikor solüsyonu atın. 0.5 ml% 2 NGS / PBTx yıkamak ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın. </li><li> CO-immün, önce birincil antikor daha farklı bir türden gelen ikinci birincil antikor elde edilir. Bu çalışmalarda, kırmızı fluoresan boya-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor tavşan anti-fosfo CAMK-II antikoru izleyin. </li><li> tavşan anti-fosfo CAMK-II antikoru 01:20 sulandırmak. Embriyoların her bir tüp için, daha sonra, 0.3 ml% 10 NGS / PBTx askıya hazır antikor çözeltisi 15 ul ekle. </li><li> Embriyolar dalmış ve ışıkları sönük olduğundan emin olun. karanlıkta oda sıcaklığında hafif sallanan O / N ile kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> loş ışıklar altında Sabah, kaldırmak ve antikor çözüm atın. 0.5 ml% 2 NGS / PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın. </li><li> loş havai ışıkları tutmak ve uygun floresan konjugat yeterince sulandırmakkapı ikincil antikor, böylece her koşul en az 0.5 ml içerir. 500,% 10 NGS / PBTx: Bu çalışmada, kırmızı fluoresan boya-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG ikincil antikor (kırmızı kanal) 1 seyreltin. </li><li> yumuşak karanlıkta oda sıcaklığında çalkalanarak 4 saat, ikinci ikincil antikor inkübe edin. </li><li> Bu inkübasyon ve loş ışıkları altında sonunda, kaldırmak ve ikincil antikor çözüm atın. 0.5 mi PBTx ekleyin. Yavaşça 5 dakika sallayın. Çıkarın ve çözüm atın. İki kez tekrarlayın. Mağaza PBTx ya da% 50 gliserol / PBS ya görüntüleme işlemi bağlı olarak değişir. </li></ol> 4. Konfokal Görüntüleme ve İşleme <ol><li> Dağı görüntüleme için embriyolar. Bir bardak slayt 5 embriyo - 1 yerleştirin. Ana lamel ve odanın her iki tarafında lamel fragmanları kullanılarak kızak arasında bir bölme oluşturur. Tipik olarak, dört 1. lamelleri sızdırmazlık olmadan bu boşluk yığınları yapmak için kullanılır. NOT: Hiçbir montaj orta gereklidir. </li><li> Bir 100X yağ daldırma kullanınAmaç iletilen ışık kullanarak odak noktası haline tek embriyo getirmek. Işığı kapatın. konfokal mikroskop açın. Bu uygun lazerler (yeşil ve / veya kırmızı) açık ve uzaktan odak accessary oturduğundan emin olun. </li><li> konfokal programı açın. In &quot;Edinme bar,&quot; Doğru hedefi seçin. &quot;XY Temel&quot; çubuğunda, 1.024 butonuna tıklayarak 1.024 görüntü boyutunu ayarlayın. </li><li> &quot;Lazer ve Dedektörü&quot; barda, her kanal için lazer ve dedektör açmak için kırmızı 488 kutu ve yeşil 568 kutusuna tıklayın. orta iğne deliği ayarlayın ve görselleştirmek için her kanalın &quot;Kazanç&quot; barda kazancını ayarlayın. </li><li> &quot;Elde Ayarlar&quot; çubuğunda, görüntüleri elde başlamak için &quot;Canlı&quot; seçeneğine tıklayın. &quot;Görünüm Ayarları&quot; çubuğunda, &quot;Canlı&quot; penceresinde merkezine &quot;İntegral Yakınlaştırma zorla&quot; kutusunun işaretini kaldırın. </li><li> &quot;Ayarlar Edinme&quot; barda &quot;Z&quot; sekmesi altında, görüntünün katmanları üzerinden adım. nu seçtikten sonraOptik bölümden mber, görüntü içine dahil z-düzlemi &quot;Merkezi&quot; bazı noktaya taşımak için. </li><li> &quot;Z&quot; sekmesi altında, küçük kırmızı &quot;Referans&quot; kutusuna tıklayın. Bu &quot;merkez&quot; olarak seçilen noktada RFA sıfır olacaktır. &quot;Adım Boyutu&quot; etiketli kutuda (ideal mikron mikron 0.25 ila 2.0) katmanların kalınlığı seçin. &quot;Dosya Boyutu&quot; kutusuna dikkat edin ve 1GB sınırlamak için deneyin. Not: Genellikle, 0.5, 40, optik bölüme kadar - 1.0 um elde edilir, ancak bölme sayısı deneysel olarak tespit edilebilir. </li><li> Resmin üst extreme bulmak için, &quot;Top&quot; yanındaki daireyi tıklayın ve z katmanları arasında hareket. Şimdi, bir sonraki &quot;Bottom&quot; için daireyi tıklayın bilgisayar merkezi olarak katmana geri görüntü alacaktır. Yine resmin alt aşırı bulmak için katmanları arasında hareket. </li><li> lazer durdurmak için kutu &quot;Edinme Ayarlar&quot; tekrar &quot;Canlı&quot; linkine tıklayınedinimi. Bu panelde, kırmızı Ortalama etiketli kutuları ve Z-yığını tıklayın. Bu kutular yeşile döner. </li><li> &quot;Elde Ayarlar&quot; kutusunda, görüntülerin tüm seriyi kazanmak için &quot;Single&quot; tıklayın. her iki kanalda ve tüm z-yığın içinde tarar gibi ilerlemesini izleyebilirsiniz. </li><li> Kaydetmek birimi penceresinde tıklayın ve tıklayın &quot;farklı kaydet&quot; ve dosyayı adlandırın. Bir &quot;.ids&quot; dosyası olarak kaydedin. hacmine z yığın açıkken, dosyayı işlemek Veri menüyü aşağı çekin ve &quot;render hacim&quot; linkine tıklayarak seçin. Bir tiff dosyası olarak verilen dosyayı kaydedin. Bu, ilgili yayının gösterilmiştir yansıtılan görüntüdür. </li></ol>

<ol>
	<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+during+embryonic+development.">Calcium signalling during embryonic development.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 539-551 (2003).</li><li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signalling+and+early+embryonic+patterning+during+zebrafish+development.">Ca2+ signalling and early embryonic patterning during zebrafish development.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 34, 897-904 (2007).</li><li>Whitaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+at+fertilization+and+in+early+development.">Calcium at fertilization and in early development.</a> Physiol. Rev. 86, 25-88 (2006).</li><li>Yuen, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Ca(2+)+signaling+in+the+external+yolk+syncytial+layer+during+the+late+blastula+and+early+gastrula+periods+of+zebrafish+development.">Characterization of Ca(2+) signaling in the external yolk syncytial layer during the late blastula and early gastrula periods of zebrafish development.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1641-1656 (2013).</li><li>Tombes, R. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+free+calcium+and+mitosis+in+mammalian+cells:+anaphase+onset+is+calcium+modulated,+but+is+not+triggered+by+a+brief+transient.">Intracellular free calcium and mitosis in mammalian cells: anaphase onset is calcium modulated, but is not triggered by a brief transient.</a> J. Cell Biol. 109, 627-636 (1989).</li><li>Hudmon, A., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Ca2+/Calmodulin-Dependent+Protein+Kinase+II:+The+Role+of+Structure+and+Autoregulation+in+Cellular+Function.">Neuronal Ca2+/Calmodulin-Dependent Protein Kinase II: The Role of Structure and Autoregulation in Cellular Function.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 473-510 (2002).</li><li>Tombes, R. M., Faison, M. O., Turbeville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+Evolution+of+Multifunctional+Ca2+/CaM-dependent+Protein+Kinase+(CaMK-II).">Organization and Evolution of Multifunctional Ca2+/CaM-dependent Protein Kinase (CaMK-II).</a> Gene. 322, 17-31 (2003).</li><li>Braun, A. P., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multifunctional+Calcium/Calmodulin-Dependent+Protein+Kinase:+From+Form+to+Function.">The Multifunctional Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase: From Form to Function.</a> Annu. Rev. Physiol. 57, 417-445 (1995).</li><li>Rich, R. C., Schulman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-directed+function+of+calmodulin+in+autophosphorylation+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II.">Substrate-directed function of calmodulin in autophosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II.</a> J Biol Chem. 273, 28424-28429 (1998).</li><li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx5-mediated+expression+of+Ca2+/calmodulin-dependent+protein+kinase+II+is+necessary+for+zebrafish+cardiac+and+pectoral+fin+morphogenesis.">Tbx5-mediated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II is necessary for zebrafish cardiac and pectoral fin morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 175-184 (2009).</li><li>Rothschild, S. C., Lister, J. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+CaMK-II+genes+during+early+zebrafish+embryogenesis.">Differential expression of CaMK-II genes during early zebrafish embryogenesis.</a> Dev Dyn. 236, 295-305 (2007).</li><li>Francescatto, L., Rothschild, S. C., Myers, A. L., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+activation+of+membrane+targeted+CaMK-II+in+the+zebrafish+Kupffer's+vesicle+is+required+for+left-right+asymmetry.">The activation of membrane targeted CaMK-II in the zebrafish Kupffer's vesicle is required for left-right asymmetry.</a> Development. 137, 2753-2762 (2010).</li><li>Rothschild, S. C., Francescatto, L., Drummond, I. A., Tombes, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMK-II+is+a+PKD2+target+that+promotes+pronephric+kidney+development+and+stabilizes+cilia.">CaMK-II is a PKD2 target that promotes pronephric kidney development and stabilizes cilia.</a> Development. 138, 3387-3397 (2011).</li><li>Rothschild, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMK-II+activation+is+essential+for+zebrafish+inner+ear+development+and+acts+through+Delta-Notch+signaling.">CaMK-II activation is essential for zebrafish inner ear development and acts through Delta-Notch signaling.</a> Dev Biol. 381, 179-188 (2013).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos.">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , e1113 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Obara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycystin-2+immunolocalization+and+function+in+zebrafish.">Polycystin-2 immunolocalization and function in zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 17, 2706-2718 (2006).</li><li>Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+whole+mount+in+situ+hybridization+within+zebrafish+embryos+to+study+gene+expression+and+function.">High resolution whole mount in situ hybridization within zebrafish embryos to study gene expression and function.</a> J Vis Exp. , e50644 (2013).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature. 3, 59-69 (2008).</li><li>Harris, P., Osborn, M., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+tubulin-containing+structures+in+the+egg+of+the+sea+urchin+Strongylocentrotus+purpuratus+from+fertilization+through+first+cleavage.">Distribution of tubulin-containing structures in the egg of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus from fertilization through first cleavage.</a> J Cell Biol. 84, 668-679 (1980).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

PFA / metanol yöntemi zebrabalıkları gelişim sırasında fosfo-T 287 -CaMK-II epitopunun bağışık optimize temel amacı ile bu laboratuvarda geliştirilmiştir. Bu yöntem başarıyla zebrabalıkları KV, 14 ve özellikle KV aşamada böbrek. 13, bu tekniğin gerekli olduğu 12 iç kulak olmak üzere birçok siliyalı organların oluşumu sırasında P-CAMK-II lokalize. Bu yöntemin başarısı otofloresansı a) en aza indirilmesi, fosfo-CAMK II epitopunun b) korunması ve antikorlara epitop C) geliştirilmiş erişilebilirlik bir kombinasyonu muhtemeldir. Bu yaklaşımın bir birincil sınırlamanın, metanol içinde depolama zamandır. P-CAMK-II immünoreaktivitesi, -20 ° C&#39;de metanol içinde iki gün sonra maksimum olsa da, bu epitopun tepkime metanol içinde bir haftalık depolamadan sonra, kaybolur. Anda fosfat grubu hy olup olmadığı açık değildirdrolyzed ya da daha fazla denatürasyon bu immün reaktiviteyi azaltan oluşur. -20 ° C&#39;de metanol / EGTA, erken embriyo gelişimi sırasında, tübülin zengin yapıların korunması için geleneksel olarak hızlı bir sabitleyici değildir. 22. Bununla birlikte, tek başına metanol&#39;ün aktin hücre iskeletinin olarak morfolojisi ya da yapıların korunması için istenen bir durum değildir ve gelmelidir PFA. Bu yaklaşımın diğer avantajları bu aynı zamanda F-aktin ve asetillenmiş tubulin diğer epitoplar koruyan ve GFP doğal floresans ortadan kaldırmaz vardır. Bu Dent sabitleyici olarak diğer sabitleyiciler, diğer epitoplarla 13 üstündür ve P-CAMK II boyama PFA / metanol daha Dent sabitleyici zayıf olsa da, P-CAMK II boyama ile uyumlu olmaya devam etmektedir. fosfo-proteinler erken gelişim sırasında aktif olan sinyal yolları yaygın olduğundan, Dent sabitleştirici ve PFA / metanol Zeb diğer fosfo-epitoplar için iki fiksatif olarak tavsiye edilirrafish embriyolar. Diğer proteinler ve bunların antikorları bu teknikle uygulamalar geliştirirken, bu immunoblötları da reaktif olan antikorları var ve klonlanmış ve antikorlar valide edilebildiği proteinleri aşırı olması yararlı olmuştur. 12 O a) protein düzeyinde gen bastırma doğrulamak ve b) eylem modellerinin geliştirilmesini sağlar çünkü bağışık tekniklerini optimize etmek için çabaya değer. Bu laboratuvarda, bu deneylerin sonuçları modellerle CAMK II fonksiyonları formülasyonunu izin vermiştir. Örneğin, KV konumu, bu organın rolü gibi, geçici ve asimetriktir. Böbrekte, Pronephric duktal hücrelerin apikal tarafında konumu kanalına gelen sinyallere yanıt rolleri önerir. Son olarak, kulak kinocilia tabanında belirli bir yoğun puncta bu enzim aktivasyonu yerelleştirilmiş Ca2 + sinyali göstermektedir. yöntemleri burada tarif edilenAyrıca iki floresan kanallarda herhangi bir embriyonik hücre tipinin yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için arayan herhangi bir araştırmacı için yararlı olmalıdır.

The techniques described here are the outcome of studies that have sought to define downstream targets of Ca2+ signals during events that occur during early development, including fertilization, gastrulation, somitogenesis and trunk, eye, brain and organ formation.1-3 The original discoveries of embryonic Ca2+ signaling were dependent on the use of natural and engineered Ca2+ indicators, such as aequorin4 and fura-2.5 Even with current technology, the detection of transient elevations of Ca2+ requires cumbersome analytical tools and does not reveal the targets of such Ca2+ signals. 
This laboratory investigates Ca2+ signals that act through the Ca2+/calmodulin-dependent (multifunctional) protein kinase known as CaMK-II, an enzyme that is enriched in the central nervous system and originally identified as a regulator of long-term potentiation.6 CaMK-II is not brain-specific, is widely expressed and highly conserved throughout the entire lifespan and bodies of species throughout the animal kingdom, including invertebrates.7,8 CaMK-II has the unique capability of sustaining its own activity even after Ca2+ levels have diminished due to its ability to autophosphorylate at Thr287. In this autophosphorylated state, CaMK-II remains active in a Ca2+/CaM-independent manner, until dephosphorylated.6 Thus, the localization of phosphorylated CaMK-II (Thr287) can identify cells in which natural, relevant Ca2+ elevations have occurred. 
An antibody against autophosphorylated (P-Thr287) mammalian CaMK-II has been well-characterized and was initially used to localize activated CaMK-II in brain tissue.9 Zebrafish (Danio rerio) have seven CaMK-II genes10,11 whose protein products contain a sequence of MHRQE[pT287]VECLK in this region.10,11 This sequence is very similar to the phosphopeptide antigen used to create this rabbit polyclonal antibody (MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore) and therefore it was not a complete surprise that this antibody cross-reacted with zebrafish CaMK-II. This laboratory showed that this antibody reacts with zebrafish CaMK-II in proportion to autophosphorylation and Ca2+/CaM-independent activity.12 Additional pan-specific CaMK-II antibodies have also been shown to cross-react with zebrafish CaMK-II.13
This antibody has been used to demonstrate that zebrafish CaMK-II is preferentially activated in cells on one side of the zebrafish Kupffer's Vesicle (KV), the ciliated organ necessary for establishment of left/right asymmetry.12 This antibody was used to demonstrate that CaMK-II is transiently activated in four adjacent cells on the left side of the KV during the exact same developmental phase that organ positioning is determined.12 In addition to the Kupffer's Vesicle (KV), autophosphorylated (P-T287) was also located in specific intracellular sites in other ciliated tissues including the kidney, neuromasts, and inner ear.12,13 In the zebrafish kidney, P-T287-CaMK-II is enriched along the apical border of ciliated ductal cells and within cloacal cilia where it influences their assembly.13 Finally, in the developing inner ear, P-T287-CaMK-II is intensely concentrated at the base of cilia and influences cell differentiation through the Delta-Notch signal pathway.14 In summary, the detection of activated CaMK-II has pinpointed sites of intracellular Ca2+ release and illuminated potential new signaling pathways.
These discoveries were completely dependent on developing a sensitive and accurate method to localize activated (P-T287-autophosphorylated) CaMK-II. The methods to fix and immunostain the zebrafish KV, kidney and inner ear are described. The limitations of this technique are also described. These techniques should be useful to any investigator who seeks to obtain high-resolution images in two fluorescent channels of not just phospho-epitopes, but any epitope, during early vertebrate development.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-7629</td>
			<td style="width:347px;">0.12% Stock solution. Dilute 1:40 in system water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td style="width:347px;">Goat polyclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A11008</td>
			<td style="width:347px;">Goat polyclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa488 phalloidin</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td>Preferentially binds to F-actin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa568 anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A11004</td>
			<td style="width:347px;">Goat polyclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Alexa568 anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A11011</td>
			<td style="width:347px;">Goat polyclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">anti-acetylated a-tubulin</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T7451</td>
			<td style="width:347px;">Mouse monoclonal, use at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:247px;">anti-phospho-T287 CaMK-II</td>
			<td style="width:175px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">06-881</td>
			<td style="width:347px;">Rabbit polyclonal, use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">anti-total CaMK-II</td>
			<td style="width:175px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">611292</td>
			<td style="width:347px;">Mouse monoclonal, use at 1:20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ethanol</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S96857</td>
			<td style="width:347px;">Lab grade, 95% denatured</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">16004-330</td>
			<td>#1&#160; thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td>Standard glass slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Methanol</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A411</td>
			<td>Store in freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20170-038</td>
			<td>capped tubes, not sterile</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16210-064</td>
			<td>Aliquot 1ml tubes, store in freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P-6148</td>
			<td>Reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:175px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:119px;">119-069-131</td>
			<td>10X stock solution or made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">BP-151</td>
			<td>10% solution in water, store at room temp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tween-20</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85113</td>
			<td>10% solution in water, store at room temp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">E-600</td>
			<td>Mount on vibration-free table</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">C1 Plus two-laser scanning confocal</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">C1 Plus</td>
			<td>Run by EZ-C1 program, but upgrades use &#34;Elements&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunostaining phospho-epitopes in ciliated organs of whole mount zebrafish embryos

hücrelerin hızlı çoğalması, gen dokuya özgü sentezleme ve sinyal ağlar ortaya tüm omurgalıların, erken dönemde embriyo gelişimi karakterize eder. hatta tek hücrelerin içinde - - kinetik ve sinyallerin yeri gelişmekte olan embriyonun önemli gelişimsel genlerin belirlenmesi tamamlar. Immün teknikleri primer kirpikler kadar küçük yapılarda, hücre içi ve bütün hayvan sinyallerinin kinetiklerini belirlemek için gösterilmiştir ki açıklanmaktadır. bir lazer tarama konfokal bileşik mikroskop kullanılarak sabitleme, görüntüleme ve işleme görüntüler için teknikler kadar az 36 olarak saat içinde tamamlanabilir. Zebra balığı (Danio rerio) ekonomik ve insan hastalığı ile ilgili bir omurgalı türlerinde çalışmalar yapmak istiyoruz araştırmacılar için bir arzu organizmadır. Genetik tırnakları veya knockdowns gerçek protein ürününün kaybı ile teyit edilmesi gerekir. protein kaybı Böyle onayBurada tarif edilen teknikler kullanılarak elde edilebilir. sinyal yolları içine ipuçları da çeviri sonrası fosforilasyon ile modifiye edilmiş protein ile reaktif olan antikorlar kullanılarak deşifre edilebilir. Korunması ve bir epitopun fosforile durumunu optimize bu belirleme için kritik öneme sahiptir ve bu protokol ile gerçekleştirilir. Bu çalışma geliştirme ve ilk 72 saat boyunca embriyolar düzeltmek için teknikler anlatılmaktadır Kupffer en veziküllü (KV) &#39;de cilia ile ilgili epitopların çeşitli böbrek ve iç kulak co-lokalize. Bu teknikler diseksiyon gerekmez, basit ve zaman görece kısa bir süre içinde tamamlanabilir. tek bir görüntü içine konfokal görüntü yığınlarının Projelendirme bu verileri sunma yararlı bir araçtır.

Fosfo-epitopları görselleştirme için en uygun koşulları Zebra balığı embriyolarının protein epitoplarının bağışık anlatan Yöntem in situ melezleme yoluyla mRNA&#39;ların lokalize için kıyasla nispeten seyrek olmuştur. Zebra balığı embriyoların silli hücrelerde protein epitoplarının lokalize kullanılan Fiksatifler% 4 PFA / PBS ve metanol ve in situ hibridizasyon bütün montaj ile RNA DMSO ilave edin. 19 yerleşim (DİLERİZ) &#39;in bir karışımı olan Dent fiksatif dahil olan tipik olarak PFA kullanılarak elde edilir % 100 metanol depolama eklenmiştir. 20,21 Çalışmalarımız, iki ila yedi gün için metanol içinde süresinin kısaltılması sırasında DİLERİZ sabitleyici bileşimi, p-CAMK II antikoru ile bağışık için başka bir sabitleyici çok daha üstün olduğunu ortaya koydu . Bu PFA / metanol kombinasyonu ile elde sinyal oldu also Dent sabitleyici,% 4 PFA / PBS veya metanol embriyo içinde gelişimsel zaman ve yere bağlı olarak, tek başına kullanıldığı zaman önemli ölçüde daha büyük. burada kullanılan her tespit edici ve gelişim süresi için tarif edilen teknik optimize ederken, bir kontrol numunesi birincil antikor tamamen gözardı edilmesi hariç, burada tüm adımları izlenmiştir hazırlanmıştır. Yukarıda tarif edilen aynı koşullar altında görüntülenmiş Böyle kontrol numuneleri bir flüoresan sinyal yoktu. Bu kontrol bir antikor ile bu yaklaşımı çoğaltma diğer araştırmacılar için önerilir. PFA / metanol sabitleştirici kombinasyonu güçlü P-CAMK-II sinyalini verdi ve aynı zamanda kirpikler için standart bir belirtecidir asetillenmiş tubulin için immün ile uyumlu idi. çıkar ve bu çalışmalarda görüntülenmiştir edilmiştir Gelişimsel, ilk kirpikli organı Kupffer en vezikül (KV) &#39;dir. 12-hücre gruplarının (15 HPF) aşama (Şekil 1) gösterildiği gibi KV Notokordun arka ucunda yer alır. KV geçici bir organdır ve sol-sağ asimetri sorumludur. Bu 2-hücre gruplarının sahne (12 hpf) ortaya çıkmaktadır ve 18-hücre gruplarının sahne etrafında kaybolur. Dayak primer kirpikler KV ve ayrı konumlarda CAMK-II ile aktivasyonunu (Şekil 1) astar silli hücrelerde Ca + 2 bir artışa yol açar sıvının dairesel akım oluşturur. P CAMK II reaktivite, toplam embriyonik CAMK II seviyeleri hala sadece yarısı 24 hpf olarak düzeyi ve seviye onda biri olan görünür ve bu erken aşamada sürece kirpikler yenerek gibidir. 12 KV bir tarafında kaybolur Toplam CAMK-II ekspresyonu 15 HPF nispeten düşük olduğundan, gelişme 3 gün. 11 belki de, bu aşamada immün tekniğinde bir gelişme önemlidir. betwegelişme 24 ve 72 hpf tr P-CAMK-II Pronephric kanalların (Şekil 2,3) belirli bölgelerini kaplayan siliyalı hücrelerinin apikal yüzeyinde görünür. (Şekil 2) tüm Pronephric kanal boyunca ve komşu Somitlerin boyunca toplam CAMK-II immünoreaktivitesi embriyonik CAMK-II yalnızca bir alt kümesini (P-CAMK-II) devrede olduğunu göstermektedir. Tespit Koşullar GFP Floresan koruma ile uyumlu olan Bu tespit teknikleri de geliştirme olmadan (Şekil 3) yeşil flüoresan protein (GFP) floresan tutucu ile uyumludur. GFP etiketli CAMK-II bu şekilde kullanılır inşa GFP yeterli floresan PFA / metanol tespit ve takip eden immün olsa korur. Pronephric kanalını çevreleyen hücreler arasında yüksek bir büyütme görünümünde (Şekil 3), inciGFP-CAMK-II &#39;nin E mozaik ifadesi, P-CAMK-II için boyanmış olan hücrelerde görüntülenebilir. Zebra balığı embriyonik kulak Ca 2+ yükseklik, CAMK-II aracılığıyla hareket ederek gelişimini etkileyen bir başka dokudur. 14 Zebra balığı kulakları normal gelişim yaklaşık bir gün görünür. Şu anda, CAMK II yoğun kinocilia tabanında ve kinocilium (Şekil 4) boyunca düşük düzeylerde aktive edilir. Görüntülerin Bu seti bu tespit ve bağışık tekniği kirpikler içinde boyama algılayabilir gösterir, kimin kesit bir yapı en az 1 mm. Bu kirpikler bu tespit ve immün süreci boyunca yapılarını korurlar. Gelişme, daha sonra, iç kulakta iki renkli counterstaining bir başka örnek, Alexa 488, her iki ile boyama ile elde edilmiştirfaloidin ve Alexa 568 takiben anti-asetillenmiş tubulin ikincil antikor (Şekil 5) etiketledi. PFA / metanol tespit yöntemi tüm fiksatiflerin doğru değil, hem F-aktin ve tubulin, korur dikkat çekicidir. Bu örnek, tüm kulağa birleştirilmiş renkli görüntü olarak ve daha sonra alt bölge için gösterilmiştir. 14 İki renkli counterstaining son bir temsili bir örneği, membran-hedefli GFP (Şekil 6) ile embriyolar üretilen balık suşundan elde edilmiştir. Membran hedeflenen GFP başka proteine ​​bağlı değildir ve bu yüzden, bu görüntü, tek başına PFA ile tespit edildi balıktan elde edildi, metanol ile ekstre kaybolur. Bu sonuç, metanol işleme membranları özler olduğunu göstermektedir, bu nedenle özel olarak zara bağlı olabilir proteinler için tavsiye edilmez. Bu şekilde P-CAMK-II sinyal o elde eğer metan göreli azalırol da kullanılabilir, ancak bu gelişen embriyonun bu aşamasında ve konum (böbrek) de, sinyal metanol tedavi olmadan tespit edilebilecek kadar güçlü olduğunu gösteriyor. O KV aşamasında doğru değildir;. Yani metanol P-CAMK-II immün görselleştirmek için gereklidir. Bu örnek sadece böbreğin Pronephric kanal gövde kas bitişik olan birleştirilmiş bir görüntü olarak gösterilir. Özet olarak, burada açıklanan PFA / metanol sabitleme yöntemi GFP korunduğu ve F-aktin için boyama, asetile tubulin toplam CAMK-II ve P-CAMK-II ile uyumludur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig1.jpg" /> Zebra balığı KV Asetillendirilmiş tubulin (silya) Şekil 1. P-CAMK-II karşıt. Tek bir canlı 12 hücre gruplarının aşamasının Görüntüler (12 ss) embriyo ar tarafından KV posterior konumunu ortaya koymaktadırrowhead (lateral görüntü, A) ve kutu içinde daire (ventral görünüm, B). Bu aşamada Embriyolar PFA / metanol kullanılarak tespit edildi. Embriyolar Alexa 488 -etiketli ikincil antikor (yeşil kanal) takip asetillenmiş tubulin boyama yapıldı. Daha sonra, P-CAMK-II&#39;ye karşı tavşan poliklonal antikoru, bir Alexa 568- etiketli sekonder antikor (kırmızı kanal) takip etmiştir. Giderek daha yüksek büyütme (C, D) açıklandığı gibi iki kanallı floresan görüntü projeksiyonları elde edildi. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 12 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53747/53747fig2.jpg" /> Şekil 2,. P-CAMK II karşıtZebra balığı Böbrek boyunca Toplam CAMK-II. 30 hpf tek dechorionated embriyo PFA / metanol kullanılarak tespit edildi. Embriyolar daha sonra Alexa 488 etiketli sekonder antikor (yeşil) ve ardından toplam CAMK-II için boyandı. Daha sonra, P-CAMK II birincil antikor Alexa 568 etiketli sekonder antikor (kırmızı) ile takip edildi. Boyama, toplam CAMK-II ise Pronephric zebra balığı böbrek kanalları bitişik kas dokusu ve sarkomer boyunca hücre gruplarının sınırlarında zenginleştirilmiştir hattı hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca (kırmızı) aktif CAMK-II &#39;nin bir zenginleştirme ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu 50 mikron =. Bu görüntüler, tüm böbrek görselleştirmek için metinde açıklanan daha düşük büyütmede elde edildi. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 13 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> GFP için Şekil 3,., P-CAMK II Sayaç Imaged balığı Böbrek Hücreleri. Bu işlem 30 HPF embriyo cDNA&#39;sı dominant negatif GFP-CAMK II. 13 Bu enjeksiyonlar, tipik bir mozaik ifadesi olduğunu gösterir kodlayan enjekte edildi. Embriyo PFA / metanol ile tespit ve daha sonra bir Alexa 568 etiketlenmiş sekonder antikor kullanılarak, P-CAMK-II için immüno-lekelendi. Görüntüleme GFP PFA / metanol fiksasyon, rehidrasyon, engelleme ve immün yoluyla devam ettiğini ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 13 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53747/53747fig4.jpg" /> Şekil 4, </strongZebra balığı İç Kulak Asetillendirilmiş tubulin ile&gt;. P-CAMK-II karşıt. Bu 30 hpf embriyo PFA / metanol kullanılarak tespit edildi. Anti-asetillenmiş tübülin antikoru Alexa 488 -etiketli sekonder antikor, p-CAMK II antikoru ve Alexa 568 etiketli ikincil antikor tarafından sırada takip edildi. Boyama P-CAMK-II iç kulak kirpikler boyunca mevcut ve asetillenmiş tubulin ile birlikte lokalize olduğunu ortaya koymaktadır. Ölçek çubuğu = 5 mikron. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 14 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53747/53747fig5.jpg" /> Zebra balığı İç Kulak Şekil 5. Aktin ve Asetillendirilmiş tubulin. Üç günlük (72 hpf) Zebra balığı embriyo sabit ve asetillenmiş t immunohistokimyasal edildiAlexa 568 -etiketli ikincil antikorlar kullanılarak ubulin, Alexa 488 Phalloidin kullanarak aktin görselleştirme izledi. Cilia yanı sıra kulak aksonal innervasyon (kırmızı) asetillenmiş tubulin ortaya çıkar ve F-aktin yapılar (yeşil) kas lifleri içerir. Zebra balığı kulak iki kirpikli duyusal bölgeleri daha detaylı olarak gösterilmiştir: anterior makulayı (am) ve posterior crista (pc). Ölçek çubuğu 10 mikron =. Bu rakam, bir önceki yayın değiştirilir. 14 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53747/53747fig6.jpg" /> . Zebra balığı Böbrek Membran GFP Şekil 6 P-CAMK-II Sayaç Imaged β-aktin olan bu tek bir birleştirilmiş görüntü: CAAX-GFP embriyo (30 hpf) sabit ve P-CaMK- için boyandı.II Alexa 568 etiketli ikincil antikor eklenmiştir. Boyama Pronephric zebrabalıkları böbrek kanalları hat hücrelerinin apikal yüzeyi boyunca (kırmızı) devreye CAMK-II bir zenginleştirme ortaya koymaktadır. Bu böbrek duktal hücreleri sadece kas dokusu altına sokuldu ve her ikisi de (yeşil) membran hedeflenen GFP ifade tarafından işaretlenir. Ölçek çubuğu = 50 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53747/53747fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos at JoVE.com

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir.

Tüm Dağı Zebra balığı Embriyolar kirpikli Organları boyanmasına Fosfo-epitoplar

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

immunostaining-phospho-epitopes-ciliated-organs-whole-mount-zebrafish

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.9K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University.  Teknikler, tüm zebra balığı embriyolar fosfo-epitopları immunostain ve daha sonra birincil kirpikler kadar küçük hücresel yapılarının iki renkli flüoresan konfokal lokalizasyonu yapmak için tarif edilmiştir. tespit ve görüntüleme için teknikler yer ve spesifik protein ortaya veya aktivasyon kinetikleri tanımlayabilir. 

Video: Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

High Precision Zinc Isotopic Measurements Applied to Mouse Organs

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn and 70Zn) which are naturally fractionated between mouse organs. We first show how to dissolve the different organs in order to free the Zn atoms; this step is realized by a mixture of HNO3 and H2O2. We then purify the zinc atoms from all the other elements, in particular from isobaric interferences (e.g., Ni), by anion-exchange chromatography in a dilute HBr/HNO3 medium. These first two steps are performed in a clean laboratory using high purity chemicals. Finally, the isotope ratios are measured by using a multi-collector inductively-coupled-plasma mass-spectrometer, in low resolution. The samples are injected using a spray chamber and the isotopic fractionation induced by the mass-spectrometer is corrected by comparing the ratio of the samples to the ratio of a standard (standard bracketing technique).&#160;This full typical&#160;procedure produces an isotope ratio with a 50 ppm (2 s.d.) reproducibility.

We present the technique to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs.

Fare Organlar Uygulanan Yüksek Hassasiyetli Çinko İzotopik Ölçümler

We present a procedure to measure with high precision zinc isotope ratios in mouse organs. Zinc is composed of 5 stable isotopes (64Zn, 66Zn, 67Zn, 68Zn ...

Kimya

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Accessing Valuable Ligand Supports for Transition Metals: A Modified, Intermediate Scale Preparation of 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that derive from initial 2-bromo-2-butene lithiation followed by acid mediated dienol cyclization. The revised synthesis and purification of the ligand avoids the use of mechanical stirring while still permitting access to significant quantities (39 g) of Cp*H in good yield (58%). The procedure offers other additional benefits, including a more controlled quench of excess lithium during the production of the intermediate heptadienols and a simplified isolation of Cp*H of sufficient purity for metallation with transition metals. The ligand was subsequently used to synthesize [Cp*MCl2]2 complexes of both iridium and ruthenium to demonstrate the utility of the Cp*H prepared and purified by our method. The procedure outlined herein affords substantial quantities of a ubiquitous ancillary ligand support used in organometallic chemistry while minimizing the need for specialized laboratory equipment, thus providing a simpler and more accessible entry point into the chemistry of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene.

Reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented. The revised protocol for the synthesis and purification of the ligand minimizes the need for specialized laboratory equipment while simplifying reaction workups and product purification. Use of Cp*H in the synthesis of [Cp*MCl2]2 complexes (M = Ru, Ir) is also described.

Değerli Ligand Erişme Geçiş Metaller için altlıklar: 1,2,3,4,5-Pentamethylcyclopentadiene bir Modifiye, Ara Ölçeği Hazırlık

A reliable, intermediate scale preparation of 1,2,3,4,5-pentamethylcyclopentadiene (Cp*H) is presented, based on modifications of existing protocols that ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound electrons with neutral molecules/atoms. State-of-the-art in vacuo anion generation techniques allow application to a broad range of atomic, molecular, and cluster anion systems. These are separated and selected using time-of-flight mass spectrometry. Electrons are removed by linearly polarized photons (photo detachment) using table-top laser sources which provide ready access to excitation energies from the infra-red to the near ultraviolet. Detecting the photoelectrons with a velocity mapped imaging lens and position sensitive detector means that, in principle, every photoelectron reaches the detector and the detection efficiency is uniform for all kinetic energies. Photoelectron spectra extracted from the images via mathematical reconstruction using an inverse Abel transformation reveal details of the anion internal energy state distribution and the resultant neutral energy states. At low electron kinetic energy, typical resolution is sufficient to reveal energy level differences on the order of a few millielectron-volts, i.e., different vibrational levels for molecular species or spin-orbit splitting in atoms. Photoelectron angular distributions extracted from the inverse Abel transformation represent the signatures of the bound electron orbital, allowing more detailed probing of electronic structure. The spectra and angular distributions also encode details of the interactions between the outgoing electron and the residual neutral species subsequent to excitation. The technique is illustrated by the application to an atomic anion (F&#8722;), but it can also be applied to the measurement of molecular anion spectroscopy, the study of low lying anion resonances (as an alternative to scattering experiments) and femtosecond (fs) time resolved studies of the dynamic evolution of anions.

Here, we present a protocol for photoelectron imaging of anionic species. Anions generated in vacuo and separated by mass spectrometry are probed using velocity mapped photoelectron imaging, providing details of anion and neutral energy levels, anion and neutral structure and the nature of the anion electronic state.

F− 310 Nm dekolmanı tarafından resimli anyon photoelectron görüntüleme

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a simple protocol for the multifunctional surface modification of NDs by using mussel-inspired polydopamine (PDA) coating. In addition, the functional layer of PDA on NDs could serve as a reducing agent to synthesize and stabilize metal nanoparticles. Dopamine (DA) can self-polymerize and spontaneously form PDA layers on ND surfaces if the NDs and dopamine are simply mixed together. The thickness of a PDA layer is controlled by varying the concentration of DA. A typical result shows that a thickness of ~5 to ~15 nm of the PDA layer can be reached by adding 50 to 100 &#181;g/mL of DA to 100 nm ND suspensions. Furthermore, the PDA-NDs are used as a substrate to reduce metal ions, such as Ag[(NH3)2]+, to silver nanoparticles (AgNPs). The sizes of the AgNPs rely on the initial concentrations of Ag[(NH3)2]+. Along with an increase in the concentration of Ag[(NH3)2]+, the number of NPs increases, as well as the diameters of the NPs. In summary, this study not only presents a facile method for modifying the surfaces of NDs with PDA, but also demonstrates the enhanced functionality of NDs by anchoring various species of interest (such as AgNPs) for advanced applications.

A facile protocol is presented to functionalize the surfaces of nanodiamonds with polydopamine.

Nanodiamonds ve gümüş nano tanecikleri onun azaltılması biyo-ilham Polydopamine yüzey modifikasyonu

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sentez ve Site seçici olarak oluşturulması için Thiol reaktif reaktif Bioconjugation Immunoconjugates modifiye

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment screening. NMR-based activity assays are ideally suited to work at the higher concentrations of test compounds required to detect these weaker inhibitors. The dynamic range and chemical shift dispersion in an NMR experiment can easily resolve resonances from substrate, product, and test compounds. This contrasts with spectrophotometric assays, in which read-out interference problems often arise from compounds with overlapping UV-vis absorption profiles. In addition, since they lack reporter enzymes, the single-enzyme NMR assays are not prone to coupled-assay false positives. This attribute makes them useful as orthogonal assays, complementing traditional high throughput screening assays and benchtop triage assays. Detailed protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells. The methods are demonstrated using two nucleoside ribohydrolase enzymes. The use of 1H NMR is shown for the purine-specific enzyme, while 19F NMR is shown for the pyrimidine-specific enzyme. The protocols are generally applicable to any enzyme where substrate and product resonances can be observed and distinguished by NMR spectroscopy. To be the most useful in the context of drug discovery, the final concentration of substrate should be no more than 2-3x its Km value. The choice of NMR experiment depends on the enzyme reaction and substrates available as well as available NMR instrumentation.

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based activity assays have been developed to identify and characterize inhibitors of two nucleoside ribohydrolase enzymes. Protocols are provided for initial compound assays at 500 &#956;M and 250 &#956;M, dose-response assays for determining IC50 values, detergent counter screen assays, jump-dilution counter screen assays, and assays in E. coli whole cells.

NMR tabanlı aktivite bileşik Inhibisyonu belirlenmesi için Assays, ıC50 değerleri, Artifactual aktivite, ve Nükrenoside Ribohidolases tüm hücre aktivitesi

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...