Questo protocollo descrive la sintesi e l'applicazione di PODS, un nuovo reagente per la bioconiogazione site-specific di proteine e peptidi. Questa tecnologia rappresenta un netto miglioramento rispetto alle tradizionali biocongiugazioni a base di maleimide-tiolo. Il più grande vantaggio di questa procedura è la semplicità con cui viene realizzato il reagente.
Il metodo consente di sintetizzare il reagente praticamente in qualsiasi laboratorio. In un pallone a fondo rotondo da 10 millilitri, sciogliere 100 milligrammi dell'amminofenil oxadiazolo tiolo in tre millilitri di metanolo. Alla soluzione aggiungere 360 microlitri di diisopropiletilammina e una barra di agitazione magnetica.
Sigillare il pallone con un tappo di gomma e mescolare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una siringa di vetro da un millilitro, fare un buco attraverso il tappo di gomma e aggiungere rapidamente 32 microlitri di iodometano alla miscela. Lasciare reagire la miscela per 45 minuti a temperatura ambiente.
In un pallone a fondo tondo da 25 millilitri, sciogliere 387 milligrammi dell'acido carbossilico protetto dal boc in 10 millilitri di diclorometano. Alla soluzione aggiungere 480 microlitri di diisopropiletilammina, 264 milligrammi di EDCI, 200 milligrammi di anilina e una barra di agitazione magnetica. Sigillare il pallone con un tappo di vetro e lasciare mescolare la reazione per cinque giorni a temperatura ambiente.
Una volta completata la reazione, trasferire la miscela di reazione in un imbuto separatore e lavare tre volte con cinque millilitri di acido cloridrico un molare. Raccogliere la fase organica e trasferirla nell'imbuto separatore. Quindi lavare la fase organica con carbonato di sodio un molare seguito da acqua.
Successivamente, raccogliere la fase organica e aggiungere solfato di magnesio per rimuovere eventuali tracce di acqua. Quindi filtrare la miscela utilizzando una fritta di vetro media. Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere i solventi volatili a pressione ridotta per permettersi un solido bianco troppo bianco.
In seguito, riassolvere il solido isolato in 10 millilitri di acetato di etile. Quindi precipitare il prodotto attraverso l'aggiunta graduale di 30 millilitri di cicloesano. Filtrare la soluzione utilizzando una fritta di vetro media per ottenere il prodotto carbammato come polvere bianca.
In un pallone a fondo tondo da 10 millilitri, sciogliere 30 milligrammi del carbammato in quattro millilitri di diclorometano. Aggiungere lentamente 49 milligrammi di acido cloroperbenzoico al 70%m e una barra di agitazione magnetica alla miscela e sigillare il pallone con un tappo di vetro. Mescolare la soluzione durante la notte a temperatura ambiente, producendo infine una miscela gialla.
Il giorno seguente, trasferire la miscela in un imbuto separatore. Quindi lavare la miscela con idrossido di sodio 0,1 molare seguito da acqua. Raccogliere la fase organica e aggiungere solfato di magnesio per rimuovere eventuali tracce di acqua.
Quindi filtrare la miscela utilizzando una fritta di vetro media. In un pallone a fondo tondo da 25 millilitri, sciogliere 30 milligrammi del carbammato in due millilitri di diclorometano. Aggiungere una barra di agitazione magnetica alla miscela.
E 400 microlitri di acido trifluoroacetico e sigillare il pallone con un tappo di vetro. Quindi mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per tre ore. Una volta completata la reazione, rimuovere i volatili a pressione ridotta a temperatura ambiente utilizzando un evaporatore rotante per ottenere un residuo oleoso.
Sciogliere il residuo oleoso in sette millilitri di acqua. E trasferimento in un imbuto separatorio. Lavare la soluzione acquosa tre volte con quattro millilitri di acetato di etile.
In un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri sciogliere 10 milligrammi di PODS e 300 microlitri di solfossido di dimetile. Quindi aggiungere 26 microlitri di N, N-diisopropiletilammina alla soluzione. Sciogliere 15,2 milligrammi di DOTA NCS in 100 microlitri di solfossido di dimetile e combinare la soluzione con la soluzione PODS.
Sigillare il tubo di microcentrifugo e consentire alla reazione di incubare durante la notte a temperatura ambiente. Successivamente, diluire 61 microlitri di una soluzione di stock di trastuzumab con 859 microlitri di PBS in un tubo di microcentrifugo a basso legame proteico da 1,5 millilitri. A questa miscela, aggiungere 6,7 microlitri di una soluzione da 10 millimolare appena fatta di TCEP in acqua.
Aggiungere 73 microlitri di una soluzione PODS-DOTA da un milligrammo per millilitro alla miscela di reazione. Infine, sigillare il tubo di microcentrifugo e incubare la soluzione per due ore a temperatura ambiente. La sintesi PODS è robusta e affidabile.
La deproteinazione e la sostituzione dell'amminofenil oxadiazolo tiolo ne offriva una in resa quantitativa. La legatura del tioetere uno e dell'acido carbossilico protetto dal boc ha prodotto il composto due nella resa del 55%. L'ossidazione ha offerto al composto tre con una resa del 90%.
E la rimozione del gruppo che protegge i bocs ha prodotto PODS con una resa del 98%. L'identità di ogni prodotto è stata confermata tramite NMR protone, NMR in carbonio e SM ad alta risoluzione. Una variante portante di isotiocianato del chelatore DOTA è stata accoppiata all'ammina pendente di PODS per ottenere il chelatore bifunzionale con una resa del 75%. L'identità del prodotto è stata confermata tramite NMR protone, NMR al carbonio e SM ad alta risoluzione. Qui viene mostrata la bioconiogazione selettiva del sito di PODS-DOTA al trastuzumab anticorpale con targeting HER2.
I collegamenti disolfuro della regione della cerniera dell'anticorpo sono stati selettivamente ridotti e l'anticorpo è stato quindi incubato con PODS-DOTA per permettersi all'immunoconiuvato dota una resa dell'80%. L'analisi MALDI-TOF ha rivelato un grado di etichettatura di 1,8 DOTA per anticorpo. Che rimane coerente in una serie di anticorpi IgG1 umani, umanizzati e chimerici.
Tuttavia, le stesse condizioni producono immunoconiuvati con un grado di etichettatura di 1,5 per gli anticorpi murini IgG1. A causa della sensibilità alla luce di questo composto, è importante mantenere tutte le reazioni nei vasi ricoperti di fogli. Ciò aumenterà la resa complessiva del prodotto.
Mentre questo protocollo descrive la sintesi di PODS-DOTA, una procedura simile può essere applicata a una vasta gamma di carichi potenziali, tra cui fluorofori, tossine e altri chelatori. Questo metodo faciliterà la costruzione di immunoconiuvati ben definiti, omogenei e altamente stabili che possono essere utilizzati in un'ampia varietà di campi. È importante ricordare che l'iodometano aggiunto nella prima fase di questo esperimento può avere effetti dannosi e dovrebbe quindi essere usato in una cappa aspirante.
