We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. crescita delle piante <ol><li> Superficie sterilizzare i semi. <ol><li> Sterilizzare semi (fino a 30 mg) con il metodo a umido oa secco. Ad esempio, per il metodo di sterilizzazione a secco, aggiungere 1 ml glaciale HCl 37% in 50 ml di candeggina, in un bicchiere di vetro in un essiccatore chiuso per almeno 4 ore e fino a tutta la notte. Eseguire questo passaggio in una cappa chimica. </li></ol></li><li> Diffondere i semi sterili su piastre di agar con impianto di 0,8% a 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS). Avvolgere le piastre con parafilm o nastro poroso e coprire con un foglio di alluminio. </li><li> Conservare le piastre a 4 ° C per 1 - 4 giorni per promuovere la germinazione uniforme. </li><li> Trasferire le piastre ad una camera di crescita adatto per la coltivazione di piante di Arabidopsis. Posizionare le piastre verticalmente per mantenere la crescita delle radici sopra del mezzo agar e per impedire la penetrazione. </li><li> piantine di trasferimento di fissativo 7 giorni dopo la germinazione (DAG). </li></ol> 2. Fissazione <ol><li> Preparare 50 ml Richardson Solution combinando volumi uguali di 1% borace (agente di buffer), 1% Blu di metilene e l&#39;1% Azure (coloranti istologici) in acqua bidistillata. Filtrare attraverso una siringa Driven 0,22 micron Unità di PVDF filtro prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare 50 ml di fissativo: 1,25% glutaraldeide in 0,05 M di sodio Cacodylate (agente tampone). Nota: Questi materiali sono tossici e devono essere trattati in una cappa chimica. </li><li> Aggiungere 100 pl di soluzione di Richardson (vedere 2.1) alla soluzione di fissaggio (vedi 2.2) per ottenere la soluzione finale fissazione. </li><li> Mark ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con il nome del campione corrispondente. </li><li> Mettere 2 - 3 ml di soluzione finale di fissaggio (vedi 2.3) nei pozzetti, in modo che le piantine, una volta trasferiti, saranno interamente coperti in un liquido. </li><li> Trasferire accuratamente, usando pinze, fino a 10 piantine a ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con Parafilm. Conservare a 4 ° C, al buio, per almeno una notte, e fino ad una settimana. </li></ol> 3. disidratazione <ol> &lt;li&gt; Disidratare piantine. trasferirli tra i pozzi di nuovi 6 pozzetti, contenente concentrazioni crescenti di etanolo, come elencato qui: 10% di etanolo per 15 min; 30% di etanolo per 15 min; 50% di etanolo per 15 min; 70% di etanolo per 15 min; 85% di etanolo per 15 min; 95% di etanolo per 15 min; 95% di etanolo a 4 ° C, overnight, al minimo. Maneggiare piantine da loro afferrando con cura dai loro cotiledoni, preferibilmente con una pinza di plastica. </li></ol> 4. Infiltrazione <ol><li> Preparare mezzo di infiltrazione. Mescolare il contenuto di 1 sacchetto del kit historesin attivatore con 50 ml kit liquido resina di base in una piccola bottiglia di vetro. Mescolare con calamita per 20 min. medio infiltrazione può essere conservato a 4 ° C per alcune settimane. </li><li> Mark ciascun pozzetto di una nuova piastra da 6 pozzetti con il nome del campione corrispondente e riempire con 2 - 3 ml di terreno infiltrazione. </li><li> Trasferire le piantine dalla soluzione di etanolo al 95% al ​​mezzo di infiltrazione con pinze. Assicurarsi che le piantine sono fully coperti dal mezzo. </li><li> Conservare a 4 ° C per almeno 4 giorni, per garantire la massima penetrazione nei tessuti vegetali. </li></ol> 5. Blocco Preparazione <ol><li> Mettere piccole etichette, matita contrassegnati con il nome del campione, all&#39;interno di ogni ben di embedding stampi. </li><li> Preparare mezzo di inclusione con l&#39;aggiunta di 1 ml di indurente a 15 ml di mezzo di infiltrazione (vedi 4.1). Non tentare di preparare un volume minore di 15 ml, per evitare problemi di polimerizzazione. </li><li> Riempire la metà di ciascun pozzetto nello stampo con 200 microlitri mezzo di inclusione e coprire con un pezzo proiezione Overhead tagliare alla forma dello stampo, ma per la taglia 1 mm maggiore su ogni lato. Incubare a temperatura ambiente per almeno 2 ore, per permettere la polimerizzazione. Non superare 5 ore. </li><li> Preparare una serie supplementare di mezzo di inclusione (vedi 5.2) e tenere in ghiaccio, al fine di evitare la polimerizzazione mentre apici radicali vengono disposti nello stampo. </li><li> Tagliare ogni punta della radice in un ambito dissezione utilizzando bisturi e con molta attenzione posizione It: verticalmente per le sezioni trasversali o orizzontalmente per sezione longitudinale, a circa 2 - 3 mm dal bordo dello stampo. Riempire lo stampo completamente con soluzione bloccante e la copertura con un film in testa. Si noti che la soluzione di saturazione si restringerà leggermente una volta polimerizzato. </li><li> Mantenere a temperatura ambiente per 2 ore, al minimo. </li><li> Per asciugare i blocchi, mettere in una scatola con gel di silice asciutta e lasciare a temperatura ambiente per una notte, al minimo. </li></ol> 6. sezionamento <ol><li> Preparare coltelli in vetro da canne di vetro con un produttore di coltello. Utilizzare i coltelli di vetro per il sezionamento dei tessuti. Tagliare la bacchetta di vetro in un quadrato e poi tagliare il quadrato in diagonale per la produzione di due coltelli, utilizzando uno strumento di diamante di punteggio. </li><li> blocco di un tratto in 2 - 3 micron fette di larghezza, utilizzando una macchina di sezionamento. Mettere le fette su un vetrino, sulla parte superiore delle goccioline di acqua distillata e posizionare il vetrino su un blocco di calore impostato su fuoco basso (50 - 60 ° C), fino acqua evapora. </li></ol><ol><li> Diluire soluzione Richardson (vedi 2.1) allo 0,2% della soluzione originale e utilizzare 1 ml di esso per coprire le fette. Posizionare sul blocco di calore per 5 secondi e poi lavare con acqua distillata. </li><li> Asciugare il vetrino su una piastra calda. Osservare sotto un ambito dissezione e segnare il retro del vetrino con un marcatore, per indicare la posizione delle fette di interesse, per facilitare la loro successiva identificazione al microscopio. </li><li> Aggiungere 100 ml di mezzo di montaggio e coprire con un vetrino. </li></ol> 8. Acquisizione di immagini <ol><li> Posizionare il vetrino coperto che contiene le sezioni di radice sotto un microscopio ottico dotato di sistema PolScope adatto per ottenere le informazioni ritardante e di un filtro polarizzatore / interferenza ottica (Figura 1 dC). </li><li> Selezionare ingrandimento che permette chiara visualizzazione dell&#39;intero campione (ad esempio, 40X in questo studio) e mettere a fuoco il Microscopioe su un campo vuoto che contiene la sezione di blocco, ma nessuna sezione radice. Prova a trovare una regione pulita senza macchie. Utilizzare questa regione per impostare lo sfondo. </li><li> Impostare il sistema di imaging e parametri software: Imposta l&#39;intervallo a 17 nm. Applica &quot;Esposizione automatica&quot; e ottenere un&#39;immagine di sfondo dal campo vuoto (vedi 8.2). Una immagine di sfondo viene utilizzato per esperimento. </li></ol> 9. Analisi PolScope di cellulosa microfibril Orientamento <ol><li> Analisi di sezioni longitudinali. <ol><li> Inserire una diapositiva contenente sezioni longitudinali al microscopio e ottenere un&#39;immagine ritardanti di esso. Mettere a fuoco il microscopio su una sezione principale di interesse. Fornire un nuovo nome di file. </li><li> Scattare una foto Abrio (immagine con informazioni ritardo) attraverso la finestra &quot;Live Abrio&quot;. Assicurarsi di catturare una sezione che comprende la parete cellulare, che può essere identificato dalla cellulosa macchiato corre lungo la periferia della cellula, come mostrato nella Figura 2C.</li></ol></li><li> Analisi delle immagini. <ol><li> Fare doppio clic sull&#39;immagine rilevante nella serie di immagini. Selezionare &quot;Colore Orientamento Pseudo&quot; nella scheda &quot;Impostazioni di visualizzazione&quot;. </li><li> Per stimare l&#39;angolo di cellulosa microfibril, corrispondere la relativa ombra della parete cellulare a quella nella ruota dei colori. NOTA: La ruota colore nella Figura 2C riflette l&#39;asse lento della luce disteso lungo la microfibril che indica la direzione lungo l&#39;asse delle microfibrille. L&#39;angolo di microfibrille di cellulosa è l&#39;angolo indicato dal colore e l&#39;asse lungo della cella. Ad esempio, la cella allungamento nel cestello mostra colore ciano, inclinata di circa 90 ° rispetto all&#39;asse delle cellule. </li><li> Per quantificare l&#39;angolo medio microfibril nella parete cellulare, utilizzare lo strumento &quot;ritardante e Azimuth Stamp&quot; dalla barra degli strumenti del software. Durante la selezione lo strumento, punta e clicca sulla regione di interesse per l&#39;immagine ottenuta. NOTA: Questo will risultato nella visualizzazione degli angoli (azimut) in gradi (Figura 2C). </li><li> In un accesso aperto polarizzata software di analisi di immagine di luce alternativa, il pranzo plug-in &quot;Pol-Analyzer&quot; dal menu plugin. Nella nuova finestra che si apre, selezionare la scheda &quot;Birifrangenza&quot; e aprire e quindi salvare il file di sfondo e il file di immagine. </li><li> Nella finestra di immagine, selezionare &quot;Spec.&quot; e regolare la &#39;dimensione dei pixel ROI&#39; (uso di 5 pixel per questo studio). Nella &quot;Spec.&quot; finestra, selezionare &quot;Mostra valori nella tabella dei risultati&quot;. </li><li> Utilizzare lo strumento Poligono per segnare la regione di interesse nella finestra dell&#39;immagine. Selezionare &quot;Linee Orientamento&quot; per ottenere l&#39;orientamento del microfibril cellulosa. NOTA: Ciò comporta la visualizzazione degli angoli (azimut) in gradi. NOTA: L&#39;angolo medio calcolato da uno dei due metodi dovrà essere poi normalizzata al posizionamento della sezione di radice lungo la slitta. Per correggere la deviazione dallail posizionamento orizzontale della sezione di radice intera lungo la slitta, quantificare l&#39;angolo medio microfibril della parete cellulare fiancheggiano la cella lungo il suo asse lungo (cioè perpendicolare alla sezione e lungo l&#39;asse crescita delle radici, Figura 2C). Questo angolo è di 180 °, quando la parte di radice viene accuratamente posizionato lungo la slitta. Per calcolare l&#39;angolo microfibril, sottrarre l&#39;angolo microfibril media misurata della parete cellulare fiancheggiante da 180 °. Aggiungere la differenza portato all&#39;angolo media misurata microfibril della parete cellulare che giace piatto sul vetrino. </li></ol></li></ol> 10. Analisi PolScope del cristallino cellulosa accumulo <ol><li> Utilizzare sezioni trasversali (cross). Si noti che l&#39;accumulo di cellulosa cristallina può essere paragonata solo tra cellule quando i loro microfibrille di cellulosa sono allineate con un angolo simile (come determinato a 9). </li><li> Fare doppio clic sull&#39;immagine rilevante nella serie di immagini. Selezionare &quot;Pseudo colore &quot;nella scheda&quot; Impostazioni di visualizzazione &quot;. </li><li> Per misurare ritardante. Zoom-in sull&#39;immagine. Selezionare &quot;Regione&quot; e contrassegnare tutte le regioni di interesse. Passare alla scheda &quot;misure&quot; e &quot;Copia negli Appunti&quot; tutti i valori. <ol><li> Trasferire i dati in Excel ed estrarre le informazioni richieste (media regione di ritardata propagazione). Normalizzare i dati. NOTA: per tenere conto delle differenze di spessore tra le fette, esprimono i valori relativi ad un bordo specifico parete cellulare nella diapositiva. Per normalizzare, dividere il ritardo di media corrispondente alla parete cellulare di interesse dal ritardo della media di una parete cellulare diverso nella stessa immagine. Ad esempio, la parete cellulare epidermico esterno era normalizzata alla parete cellulare corticale interna nel nostro studio. </li></ol></li><li> Ripetere le misurazioni per almeno 3 sezioni per radice, con un minimo di 3 radici per campione. </li></ol>

<ol>
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The authors have no conflicts of interest.

Qui, presentiamo un metodo per determinare l&#39;accumulo di cellulosa cristallina nei diversi tessuti che compongono le radici di Arabidopsis, mantenendo informazioni anatomiche. Come tale, fornisce un ulteriore passo verso la comprensione processi di crescita nelle piante con una risoluzione cellulare. Questo metodo può essere applicato anche per lo studio di specie vegetali aggiuntivi e organi. Un certo numero di punti deve essere considerato quando si applica il metodo. Prima accumulo, cellulosa cristallina in una determinata sezione di radice può essere paragonato tra tessuti, tra sezioni di diversi genotipi e tra trattamenti se l&#39;orientamento dei loro microfibrille di cellulosa è simile. Microfibrille di cellulosa orientamento è determinato in sezione longitudinale contenente una faccia della parete cellulare 18. Quindi, la serie di sezioni longitudinali, che copre i tessuti distinte delle radici, dall&#39;esterno verso il maggior quelli interni, abilitazione analysè dell&#39;orientamento microfibrille di cellulosa nei diversi tessuti, in un determinato stadio di sviluppo. Nell&#39;esempio qui illustrato, le cellule meristematiche dell&#39;epidermide avere una vasta gamma di microfibrille di cellulosa orientamenti un angolo medio microfibrille di cellulosa di 140 °, mentre le cellule in allungamento dell&#39;epidermide hanno una struttura più organizzata, con un angolo medio microfibrille di cellulosa di 120 °. Queste misure erano simili tra wild type e il mutante di interesse, consentendo in tal modo un confronto sicuri della loro accumulo cellulosa cristallina relativa, nei corrispondenti tipi di cellule e di zona di sviluppo. In secondo luogo, la variabilità nella larghezza delle diverse sezioni può influenzare i livelli di luce ritardo della misurati. Questo è aggirato qui normalizzando le misure ritardanti grezzi del tessuto di interesse (cellule epidermiche) per la misurazione ritardata propagazione di un tessuto diverso (cellule della corteccia). I valori normalizzati are poi confrontato (Vedi Figura 2E-G). Infine, le sezioni trasversali lungo la radice, catturano diverse zone di sviluppo. Identificazione di queste zone in sezione trasversale è importante per l&#39;interpretazione dei dati. Perdita dello strato di cellule più esterno laterale cappa radicolare nella sezione comprendono zone marker semplice. In generale, le cellule iniziano la loro rapida espansione quando la cellula più antica del tappo radici laterali subisce la morte cellulare programmata, dopo di che, l&#39;epidermide non protetti diventa il tessuto più esterno 19. Attualmente, i metodi che forniscono una misura risoluzione cellulare del rapporto tra il cristallino contro i domini cellulosa amorfi sono carenti. Infatti, questo è anche uno limitazione del metodo qui presentato. Tuttavia, la sua capacità di comunicare l&#39;accumulo di cellulosa cristallina di per sé è un progresso significativo, come alti livelli relativi di cellulosa cristallina probabile rende un piùparete cellulare robusto con una maggiore resistenza alla trazione. Sviluppo di strumenti ad alta risoluzione per determinare con precisione la composizione della parete cellulare a fianco le sue proprietà meccaniche rimane una sfida futura.

La parete cellulare vegetale è una struttura dinamica. cellule in crescita sono circondate da una parete cellulare primaria, la cui organizzazione permette alle cellule di espandersi. Cellule che cessano di crescere deposito una parete secondaria più rigida che migliora il supporto meccanico della pianta. Entrambe le pareti cellulari sono composti microfibrille di cellulosa annegate in una matrice di polisaccaridi di diverse strutture (ad esempio, emicellulosa e pectina) che variano di tutti i diversi stadi di sviluppo e tessuti 1,2. Cellulosa viene sintetizzato come catene di (1,4) -β-D-glucano che sono strettamente allineati a formare la microfibril di una struttura cristallina. cellulosa amorfo si riferisce alle regioni in cui le catene glucano sono meno ordinate. Il rapporto tra il cristallino ei domini amorfi è un parametro pensato per influenzare le proprietà meccaniche della parete cellulare, fornendo resistenza meccanica e caratteristico viscoelastico rispettivamente 3. Diversi metodi sono statisviluppato per rilevare e quantificare le due forme di disposizione di cellulosa, tra i quali la diffrazione a raggi X e polarizzazione incrociata / angolo magic filatura NMR allo stato solido 4. Diffrazione di raggi X può essere utilizzato per determinare la percentuale di cristallina rispetto domini cellulosa amorfi nel campione 5. Un metodo alternativo utilizza frazionamento di contenuti parete cellulare in materiale acido insolubile e acido solubile, per distinguere tra il cristallino e cellulosa amorfa o altri polimeri, rispettivamente. In questo approccio, incorporazione di glucosio marcato ([14 C] glucosio) viene utilizzato per quantificare il 6,7 cellulosa. Questi metodi richiedono grandi quantità di materiale vegetale per le analisi di organi interi, nella migliore delle ipotesi, e, di conseguenza, sono adeguatamente sensibili a variazioni tessuto-specifica nella struttura della parete cellulare. Visualizzazione microfibrille di cellulosa ad una risoluzione cellulare può essere ottenuto in studi di imaging vivi combinati con coloranti fluorescenti 8,9, che può identificare variazionil&#39;orientamento delle microfibrille di cellulosa. Tuttavia, questi coloranti non sono utilizzati per la quantificazione, non sono specifici a cristallino cellulosa e possono interferire con la normale struttura della parete cellulare 8. PolScope è una tecnica di imaging che si basa sulla capacità di cellulosa cristallina dividere fasci di luce e ritardare parte della luce 10. ritardo luce è più forte per microfibrille che giacciono perpendicolarmente alla direzione di propagazione della luce. Per microfibrille con orientamento simile, maggiore è il grado di cristallinità, maggiore è il ritardo di luce 11. Quindi, PolScope viene usato per studiare sia i livelli relativi e l&#39;orientamento delle microfibrille di cellulosa. Radici presentano crescita lineare, durante il quale le cellule originari alla nicchia di cellule staminali, sulla punta della radice, subire una serie di divisioni cellulari, prima che rapidamente si espandono 12. Le cellule che compongono la radice si espandono in un unidirezionale (anisotropico)maniera, come dettato dalle piccole ormoni molecola di segnalazione che hanno un impatto le proprietà della parete cellulare 13. Risposte differenziale ormoni, nel tempo e nello spazio, forniscono un mezzo per assicurare una crescita equilibrata organo 14. Quindi, l&#39;analisi ad alta risoluzione di struttura della parete cellulare in grado di fornire importanti informazioni necessarie per comprendere meglio la connessione tra le risposte specifiche per tipo di cellule per la crescita dell&#39;intero organo. Qui, si segnala la realizzazione di PolScope per studiare l&#39;accumulo di tessuto-specifica di cellulosa cristallina nelle radici di Arabidopsis, come osservato nelle sezioni anatomiche di alta qualità. Questo metodo ha recentemente scoperto l&#39;accumulo specifico tipo di cellule di cellulosa cristallina in risposta alla perturbazione spaziale delle attività ormonale 15.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>LOBA CHEMIE&#160;</td>
			<td>6038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azure</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>861065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter&#160;</td>
			<td>MILLEX-GV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>EMS</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica kit historesin&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7022 18 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>embedding molds</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>film 100&#181; P.P.C.&#160;</td>
			<td>www.Jolybar.com</td>
			<td></td>
			<td>overhead film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knivemaker</td>
			<td>LKB</td>
			<td>7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultratome III</td>
			<td>LKB</td>
			<td>8800</td>
			<td>Ultratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shandon immumount&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>9990402</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse 80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio imaging system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td>CRI</td>
			<td>Abrio V2.2 software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open access polarized light image analysis software &#160;</td>
			<td>OPS</td>
			<td>OpenPolScope</td>
			<td><a href="http://www.openpolscope.org/">http://www.openpolscope.org/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

Studiamo l&#39;impatto delle risposte specifiche per tipo di cellula brassinosteroids (BRS), usando la radice Arabidopsis come modello organo 15-17. Quando il recettore BRI1 BR si rivolge, sullo sfondo di BRI1 mutante, a un sottoinsieme di cellule epidermiche chiamate cellule non-capelli (Figura 2A, B), inibisce l&#39;espansione delle cellule unidirezionale di cellule vicine, e la crescita integrale della radice 15. analisi PolScope è stata eseguita a rivelare il meccanismo alla base di questa inibizione. Sezioni longitudinali della radice ottenuto da wild type e dalle linee esprimenti BRI1 in cellule non-capelli solo, mostravano simile orientamento delle microfibrille di cellulosa (Figura 2C, D, e come spiegato in 9.2.3), consentendo il confronto della relativa accumulazione di cristallina cellulosa in cellule meristematiche e allungando, utilizzando sezioni trasversali prese da queste zone (Figura 2E, F). Questa analisi ha mostrato una correlation tra espressione BRI1 in cellule non-capelli e l&#39;accumulo locale di cellulosa cristallina. Follow up esperimenti hanno dimostrato che l&#39;inibizione mite cellulosa sintasi da basse concentrazioni di isoxaben abbassa il livello di cellulosa cristallina in queste cellule, che a sua volta, parzialmente restaurato inibizione della crescita, promuovendo l&#39;espansione delle cellule unidirezionale e la lunghezza della radice 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig1.jpg" /> Figura 1:. Luce polarizzata Sistema Microscopia Il sistema PolScope costituito da un microscopio ottico (A), dotato di una fotocamera CCD digitale (B), analizzatore e un cristallo liquido verde situato in cima alla sua sorgente luminosa (C) (D). software Abrio è stato utilizzato per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi delle immagini. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53707/53707fig1large.jpg" target="_blank">clicca qui t</a>o vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig2.jpg" /> Figura 2: Analisi PolScope di Composizione parete cellulare. (A) Sezione della radice primaria Arabidopsis mostrando organizzazione radiale dei suoi tessuti costituenti. Di questi, le cellule epidermiche non capelli (N); cellule ciliate (H) e la corteccia (C) sono contrassegnati. Bar, 10 micron. (B) le immagini al microscopio confocale di radici che esprimono BRI1-GFP mirati a cellule non-capelli. Bianco, PI colorazione che segna il cellule, Verde, espressione BRI1-GFP. Bar, 20 micron. (C) sezioni longitudinali delle radici ottenute da wild type e da piante che esprimono BRI1 in cellule non-capelli. L&#39;angolo di microfibrille di cellulosa (cioè, l&#39;angolo tra il colore e l&#39;asse lungo cellulare, che riflette l&#39;asse lungo della radice) è simile tra le due linee. La parete cellulare che fiancheggia la cellula lungo il suo lasse ong è circondata; contrassegno angolo rappresentano la parete cellulare ombreggiata che viene misurata. Bar, 50 micron. (D) Quantificazione dell&#39;angolo microfibril di cellulosa nelle pareti delle cellule epidermiche. Si noti l&#39;elevata variabilità degli angoli presenti nelle cellule meristematiche (vale a dire, la zona meristematica, MZ) rispetto alle cellule nella zona di transizione (TZ), come risulta dal diagramma a riquadri. Il simile angolo medio di cellulosa microfibril tra wild type e piante che esprimono BRI1 in cellule non-capelli consente il confronto di accumulo di cellulosa cristallina nelle cellule della loro zona di sviluppo corrispondente. L&#39;angolo medio di ciascun campione è indicato da una linea rossa. Sezioni (EF) trasversale alla radice di questi stessi sfondi vegetali, mostrate in modalità ritardo della luce. scala di colori rappresenta la luce ritardata propagazione di 0-17 nm. Sezioni corrispondenti al meristema (E) e l&#39;allungamento (F), le zone mostrate. Bar, 50 micron. La parete esterna delle cellule epidermiche e interioreparete cellulare corticale sono circondati. (G) Quantificazione dei valori ritardanti, come calcolato dalle immagini PolScope. I valori sono espressi come rapporto tra ritardante tra la parete cellulare epidermica esterna e la parete cellulare corticale interna. Si noti che l&#39;elevata deposizione di cellulosa cristallina in cellule non ciliate linee esprimenti BRI1 solo in queste cellule. Media + SE; 40 &lt;n &lt;600; (**) P &lt;0.01; (***) P &lt;0.001 in una t-test a due code. Il dato è stato adottato e modificato da 15. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53707/53707fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

8.1K Views.  Technion-Israel Institute of Technology. Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

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Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

Colture cellulari neuronali da Aplysia per imaging ad alta risoluzione di coni di crescita

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

Ricerca

Biologia

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantificazione di dsDNA con il F-7000 Hitachi Fluorescenza spettrofotometro e PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Utilizzo di Scanner Flatbed per la raccolta ad alta risoluzione e ritardi Immagini della Arabidopsis Root gravitropica risposta

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Colorazione istochimica di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellula secondaria Elementi da parete

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

A High Resolution metodo per monitorare l&#39;attivazione fosforilazione-dipendente di IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...