We thank Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan, and Dr. Linda Callahan at the University of Rochester Multiphoton Core for technical advice throughout the completion of this protocol. We also thank Dr. Changyong Feng for expert statistical advice, and Dr. Maiken Nedergaard at the University of Rochester Medical Center for the headplate design used in this paper. This work was supported in part by grants T32GM007356 and R01DA026325 from the National Institutes of Health (NIH); and by the University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).

L&#39;Università del comitato dell&#39;Università di Rochester per le risorse animali ha approvato tutte le procedure eseguite in questo documento. Preparazione 1. Pre-chirurgico (e mouse) <ol><li> Preparare l&#39;area chirurgica con tutte le attrezzature necessarie. Sterilizzare tutti gli utensili impiegati durante la procedura di anticipo utilizzando 70% di etanolo. Facoltativamente, utilizzare uno sterilizzatore vetro tallone o in autoclave per sterilizzare gli strumenti. </li><li> Posizionare il mouse in una camera di induzione isoflurano collegato ad un vaporizzatore isoflurano. Impostare i livelli isoflurano al 4% ad una velocità di 1 L / min. Nota: per gli esperimenti qui riportati, i topi con doxiciclina (DOX) inducibile di HIV-1 Tat transgene guidato dalla proteina gliale fibrillare specifici astrociti (GFAP) promotore (HIV Tat-Tg topi) 10 sono stati utilizzati per esaminare l&#39;effetto del virus HIV -1 neuroinfiammazione sulla struttura vascolare cerebrale indotta, come precedentemente descritto 7,10. </li><li> Punta delicatamente la camera di induzione di osservare il mouse &amp;# 39; s riflesso di raddrizzamento. Una volta che il riflesso di raddrizzamento è stata soppressa, impostare il livello di isoflurano al 2% e reindirizzare il flusso d&#39;aria dalla camera di induzione al cono al banco chirurgica. </li><li> Spostare rapidamente il mouse dalla camera di induzione al pad riscaldamento dell&#39;acqua infuso. Continuare ad applicare isoflurano (1,5-2%) attraverso il cono. Regolare l&#39;anestesia secondo tolleranza individuale del mouse valutata attraverso la frequenza respiratoria (RR) di monitoraggio. Nota: La depressione di RR può perturbare parametri fisiologici gas che alterano il flusso sanguigno cerebrale e valutazione diametro del vaso. Tentativo di mantenere RR tra 55-65 respiri al minuto. Frequenza cardiaca (HR) può anche essere usato valutare la profondità dell&#39;anestesia; mantenere HR tra 300-450 battiti al minuto per evitare cambiamenti fisiologici al diametro del vaso. Tipicamente, anestesia sarà adeguato tra 1,5-2,0% isoflurano a 1 L / min per un dato mouse. </li><li> Eseguire un pizzico piedi per verificare ulteriormente la profondità dell&#39;anestesia. Se il mouse non risponde, commENCE le procedure chirurgiche. </li></ol> 2. Preparazione del sottile cranio cranici Finestra <ol><li> Applicare gel lacrima artificiale agli occhi del mouse. Rimuovere completamente i capelli dal cuoio capelluto del mouse con le forbici o un rasoio elettrico. </li><li> Sterilizzare il cuoio capelluto mediante l&#39;applicazione di una soluzione di iodio-povidone; lasciare asciugare. Poi, sotto un microscopio ottico, togliere la pelle dal cuoio capelluto del mouse, esponendo completamente le ossa parietali, ossa frontali caudale, e marcatura Bregma. </li><li> Applicare una piccola quantità di una soluzione di cloruro ferrico 10% al cranio per asciugare le membrane per una facile rimozione. Rimuovere le membrane secche con la # 5/45 forcipe raschiando delicatamente il cranio. </li><li> Applicare un sottile strato di colla intorno alla finestra piastra di testa. Premere delicatamente la piastra di testa contro il cranio del mouse, mantenendo la zona di interesse del centro della finestra. Applicare una goccia di cemento dentale per la piastra di testa di polimerizzare la colla. </li><li> Applicare uno strato sottiledi colla lungo il bordo della finestra piastra di testa per creare un serbatoio in cui tenere salina. Una volta che la colla si è asciugata, avvitare il piastra di testa nel cablaggio del mouse piastra di testa. Nota: il cablaggio del mouse piastra di testa utilizzato in questa procedura è una struttura con una base di metallo e due colonne di metallo. Su ogni colonna c&#39;è una molla e un galletto. La piastra di testa è posto sulla sommità della molla, e il dado ad alette viene stretto finché la testa sia in piano e non si muove. </li><li> Rimuovere la colla dalla finestra piastra di testa con una punta attaccato ad un trapano MicroTorque impostato a 6.000 giri. Fermare ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del mouse del cranio che può provocare danni strutturali alle navi. <ol><li> Utilizzando una nuova punta, posizionare il MicroTorque fresa 1.5 mm lateralmente da linea mediana (un terzo del diametro della finestra piastra di testa). Inizia a sottile cranio nei dintorni a 4,000 rpm. Spostare il trapano delicatamente attraverso il cranio senza pressione diretta verso il basso. </li><li> Cease drilling ogni 10-15 secondi per evitare il surriscaldamento del cranio del mouse. Durante questo tempo, rimuovere la polvere accumulata cranio utilizzando una bomboletta di aria compressa. </li><li> Utilizzare gocce di soluzione salina RT raffreddare cranio per 5-10 secondi. Rimuovere delicatamente tutto il liquido con un panno morbido per continuare cranio diradamento. </li></ol></li><li> Per l&#39;assottigliamento finale del cranio, posizionare un piccolo volume di soluzione salina nel serbatoio piastra di testa e leggermente spazzare un microlama dentale sull&#39;area di interesse finché piccoli vasi sono chiaramente visibili. </li></ol> 3. Il monitoraggio dei parametri fisiologici <ol><li> Una volta che il cranio è completamente diluito, scollegare il mouse dal supporto e posizionarlo sul dorso. Nastro delicatamente verso il basso entrambe le zampe posteriori per esporre chiaramente le cosce mediale. </li><li> Rimuovere i capelli su entrambe le cosce mediale con le forbici o un rasoio elettrico. Disinfettare il sito chirurgico coprendo le cosce con iodopovidone. </li><li> Pizzicare la pelle sulla coscia mediale proprio sopra la vena femoralee l&#39;arteria con la # 5 pinze. Tirare delicatamente la pelle verso l&#39;alto e usare le forbici per tagliare e rimuovere la pelle. Nota: la coscia sinistra è riservata nel caso di complicanze chirurgiche (anomalie vascolari, vasi rotti). </li><li> Applicare circa 3-5 gocce di soluzione fisiologica 0,9% al sito chirurgico. Questo consente una maggiore ingrandimento di navi, oltre a mantenere il sito idratata e prevenire l&#39;essiccazione dei vasi. Separare la vena femorale da arteria da dissezione senza mezzi termini nel fascio neurovascolare femorale utilizzando due # 5/45 pinze. </li><li> Inserire due, 3 pezzi cm di sutura chirurgica sotto l&#39;arteria femorale circa 1 cm di distanza. Ruotare la parte superiore in senso orario di sutura per creare un laccio vascolare che contribuirà a prevenire un&#39;eccessiva perdita di sangue durante il cateterismo. </li><li> Fai una piccola incisione nell&#39;arteria femorale utilizzando le forbici primavera. Posizionare il catetere nell&#39;arteria attraverso l&#39;incisione e avanzare fino a quando il catetere è saldamente all&#39;interno dell&#39;arteria. </li><li&gt; districare la sutura superiore (laccio emostatico) per valutare la tenuta e il corretto posizionamento del catetere. Fissare il catetere nell&#39;arteria femorale legando due nodi intorno al catetere all&#39;interno del vaso utilizzando le suture. </li><li> Iniettare 10 ml di eparina (100 UI / ml) attraverso il catetere per prevenire la coagulazione del sangue. Poi, chirurgicamente chiudere la coscia destra cucendo insieme la pelle con un 4-0 di sutura in un semplice schema interrotto. </li><li> Iniettare 50 ml di uretano (1,2 mg / g) per via intraperitoneale nel quadrante in basso a destra. Cinque minuti dopo ripetere con un&#39;altra iniezione 50 microlitri al quadrante inferiore sinistro per un totale di 100 ml di uretano intraperitoneale. Ridurre lentamente i livelli isoflurano a circa il 0,25%, mentre in concomitanza ricontrollare il mouse per la profondità dell&#39;anestesia. Nota: Mantenere l&#39;ago superficiali all&#39;interno della cavità peritoneale lungo la parete addominale posteriore in modo da non perforare l&#39;intestino. Questo può essere ottenuto pizzicando rectus mu addominalescles lontano dai visceri e poi iniettare. </li><li> Utilizzando un tubo capillare, raccogliere un campione di 40 ml di sangue arterioso dal catetere. Fissare il catetere al trasduttore di pressione sanguigna, dotata di rubinetto a quattro vie soluzione salina e la siringa eparina-riempita. </li><li> Nastro il trasduttore di pressione sanguigna con gli apparecchi chirurgici per impedire la rimozione involontaria del catetere. Avviare il monitoraggio della pressione arteriosa media. </li><li> Inserire il tubo capillare riempito di sangue in una porta di entrata analizzatore di gas di sangue. Una volta che tutto il sangue è stato estratto, rimuovere il tubo capillare dalla porta di entrata. I livelli di gas nel sangue 2 O 2 e CO apparirà su una carta stampata dal analizzatore di gas di sangue. </li></ol> 4. L&#39;iniezione del colorante fluorescente <ol><li> Pizzicare la pelle sulla coscia sinistra mediale utilizzando la # 5 pinze. Tirare delicatamente la pelle verso l&#39;alto e usare le forbici per tagliare e rimuovere la pelle. Preparare destrano coniugato rosso che emette rhodamine tintura(70 kDa) (10 mg / kg disciolto in soluzione fisiologica). </li><li> Individuare femorale vein.Using una siringa da 1 ml con un ago da 30 G allegata, disegnare una soluzione precedentemente preparata di un colorante fluorescente appropriata per l&#39;imaging alla linea 130 microlitri della siringa. Rimuovere tutte le bolle d&#39;aria disegnando il colorante completamente nella siringa e fermamente muovendo il muro siringa. <ol><li> Piegare il 30 ago G con un angolo di circa 30 gradi, premendo contro una superficie dura lato smusso up. Riempire l&#39;ago con il colorante ed eliminare il liquido in eccesso, lasciando un campione di 100 microlitri. </li></ol></li><li> Iniettare il campione di 100 ml di colorante lentamente nella vena femorale. Dopo aver rimosso l&#39;ago, applicare costante, delicatamente pressione sul sito di iniezione per fermare le emorragie. Lasciare il colorante circolare per 5 min. Nota: in alternativa, la vena femorale destra può essere utilizzato invece per l&#39;iniezione colorante fluorescente per impedire ulteriore perdita di sangue attraverso la creazione di un altro sito chirurgico. Inoltre, se laanimale sta sanguinando incontrollabile dal sito chirurgico, potrebbe essere un&#39;indicazione che troppo eparina è stato dato per irrigare il catetere. Se non c&#39;è coagulazione entro 10-15 minuti e il mouse è ancora sanguinando, considerare riavviare l&#39;esperimento con un nuovo mouse. </li><li> Chiudere la coscia sinistra cucendo insieme la pelle con un 4-0 di sutura, poi capovolgere con attenzione il mouse sul suo stomaco, e inserirla nel cablaggio del mouse piastra di testa. </li></ol> 5. In Vivo a due Photon Imaging <ol><li> Spostare l&#39;apparato chirurgico al microscopio a due fotoni, avendo cura di mantenere i livelli di anestesia continui. Mettere una piccola quantità di soluzione salina allo 0,9% nel serbatoio piastra di testa e abbassare l&#39;obiettivo microscopio in modo che viene a contatto con la soluzione salina. Individuare l&#39;area di interesse con l&#39;obiettivo a campo chiaro visualizzazione </li><li> Posizionare il laser di eccitazione a due fotoni ad una lunghezza d&#39;onda appropriata per il colorante fluorescente. Iniziare due fotoni di imaging utilizzando il 25x oOBIETTIVO. Si noti che in questi esperimenti abbiamo usato un destrano coniugato al rosso emettono rodamina colorante che è stato eccitato alla lunghezza d&#39;onda di 780 nm. Una 607/36 banda passante del filtro di emissione per rilevare la fluorescenza della tintura, e una banda passante del filtro di emissione 480/20 è stato utilizzato per rilevare autofluorescenza arteriosa </li><li> Individuare una capillare letto sulla schermata di visualizzazione, e ingrandire l&#39;area utilizzando ottiche zoom 2. Immagini Acquisire dei capillari con il software di imaging a due fotoni. </li><li> Dopo l&#39;imaging è completo, sacrifica il mouse per dislocazione cervicale seguita da decapitazione. </li></ol> 6. Ex Vivo a due Photon Imaging <ol><li> Utilizzando le forbici finissimi, fare un&#39;incisione nel cuoio capelluto dalle ossa interparietale alle ossa frontali del mouse. Fissare la pelle ai lati del cranio con il dito indice e il pollice. </li><li> Posizionare le forbici in più sottili sotto l&#39;osso interparietale mediale e tagliare il cranio lungo la sutura sagittale. Fermare il taglio del cranio circa 3 mm dopo aver segnato il bregma. Nota: Applicare una pressione verso l&#39;alto quando il taglio del cranio, per evitare che il taglio del cervello. </li><li> Usando i # 5 pinze, separare il cranio dal cervello e rimuovere accuratamente eventuali meningi dalla superficie del cervello. Meningi rimanenti possono accidentalmente lacerare il cervello; estrema cura dovrebbe essere presa per evitare questo. Far scorrere delicatamente la # 5 pinze sotto il cervello avanza lentamente in avanti fino a quando il cervello è privo di cranio. Nota: che la pressione verso il basso deve essere usato per evitare la puntura del cervello. </li><li> Posizionare il cervello in uno strumento cerebrale sezionamento specifico per i topi. Lavare il cervello mediante l&#39;applicazione di gocce di liquido cerebrospinale artificiale nel cervello. </li><li> Rimuovere una sezione coronale 2 millimetri di cervello da bregma 0 a bregma -2. Posizionare la sezione coronale su un vetrino concava contenente liquido cerebrospinale artificiale con il bregma 0 (la maggior parte craniale della sezione) rivolto verso l&#39;alto. Coprire delicatamente il cervello slghiaccio con una scivolata copertura in vetro. Nota: Evitare di premere il vetro una volta posizionati sulla parte del cervello in quanto ciò potrebbe deformare l&#39;architettura vascolare. </li><li> Trasferire il vetrino al palco microscopio e mettere una piccola quantità di soluzione fisiologica 0,9% sul vetrino. Abbassare l&#39;obiettivo microscopio fino al perfetto contatto con la soluzione salina. Individuare la linea mediana del cervello con l&#39;obiettivo campo chiaro. </li><li> Iniziare l&#39;imaging a due fotoni e individuare la linea mediana di nuovo con l&#39;obiettivo 25x. Ottenere questo cercando la fessura longitudinale sulla superficie corticale della sezione coronale. Posizionare il bordo destro dello schermo per immagini sulla linea mediana e spostare lo schermo visualizzatore sopra lateralmente tre fotogrammi completi (circa 1,5 mm dalla linea mediana). Si noti che in questi esperimenti, i parametri di imaging erano identici a quelli indicati nella nota al punto 5.2. </li><li> Individuare la profondità alla quale i capillari sono appena visibili sullo schermo vista. Abbassare il piano di messa a fuoco un ulteriore 20micron per determinare all&#39;inizio della z-stack. </li><li> Impostare lo spessore di 1 micron immagine. Abbassare la schermata di visualizzazione per 100 micron e regolare la potenza del laser durante tale che meno dell&#39;1% dei pixel sono troppo saturi. Nota: le immagini z-stack sono compilati da una serie di 100 immagini consecutive 500x500x1 micron. Maggiore è lo z-stack più accurati calcoli di post processing sarà. Generalmente, tentare di raccogliere un z-stack di 100 micron o maggiore. </li><li> Premere l&#39;icona XY Ripeti seguita dall&#39;icona XY adiacente. Una volta che lo z-stack è completo, premere l&#39;icona della serie Fine e salvare il file. </li></ol> 7. Elaborazione Dati <ol><li> Aprire un vivo un&#39;immagine capillare nel software ImageJ. Impostare manualmente il pixel rapporto distanza in base ai valori ottenuti dal software due fotoni. <ol><li> Selezionare l&#39;icona del * * direttamente dal menu Strumenti. Tracciare una linea che si estende da una parete capillare al oppoparete capillare del sito, e registrare la lunghezza fornita da ImageJ. Si noti che può essere necessario per ingrandire l&#39;immagine in modo da visualizzare chiaramente i bordi delle pareti dei capillari. </li><li> Ripetere passaggio 7.1.1 in diverse posizioni lungo il capillare, così come per più capillari nell&#39;immagine. </li></ol></li><li> Aprire il file z-stack nel software analitico come Amira. Selezionare l&#39;icona filamento Editor dalla barra degli strumenti sotto-applicazione <ol><li> Impostare lo spessore spettatore a circa 20. Spostare lo spettatore a parte superiore o inferiore della z-stack. </li><li> Selezionare l&#39;icona Traccia e spostare il cursore sopra l&#39;immagine caricata. Nodi immettere sul capillari nelle posizioni descritte nella figura 2C; segmenti appariranno automaticamente tra i nodi adiacenti. Tracciare capillari durante l&#39;intero z-stack. Nota: sarà necessario inserire nodi tra i punti finali e punti di ramificazione per rintracciare i capillari thrOughout lo z-stack. </li><li> Per rimuovere questi nodi, fare clic sull&#39;icona Intermedio Rimuovi. Nota: Questo può creare segmenti erronee in loop che devono essere rimossi manualmente selezionando il ciclo utilizzando l&#39;icona Seleziona unico, e quindi selezionando l&#39;icona Elimina selezionati. Se loop continuano ad apparire nella stessa zona durante il tracciamento, è probabile che i nodi sono stati posti su diversi capillari. </li><li> Una volta che il tracciato è completo, selezionare l&#39;icona del grafico Info per aprire un foglio elettronico contenente i parametri vascolari estratti automaticamente. Il numero di nodi e segmenti sono disponibili nella schermata vista principale. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Il metodo qui descritto può essere applicato per analizzare strutture microvascolari cerebrali in un&#39;ampia gamma di modelli sperimentali / impostazioni. Per il successo di questo metodo, tre passaggi critici devono essere padroneggiato. In primo luogo, la finestra sottile cranio non deve danneggiare il cranio o cerebrale sottostante. E &#39;facile forare il cranio durante diradamento, o causare perdite di calore indotta vascolare. Questo può interferire con le immagini come il colorante fluorescente colerà nel piano di messa a fuoco e oscurare i capillari. Se il teschio si rompe frequentemente durante la preparazione sottile del cranio, è probabilmente causato da una troppo grande pressione al ribasso. Tenendo il trapano MicroTorque il più vicino possibile alla bava consente un maggiore controllo tattile che si riduce la pressione verso il basso sul cranio. In secondo luogo, la cateterizzazione arteriosa deve avvenire nel minor tempo possibile dopo l&#39;arteria è stato tagliato. La mancata inserire il catetere in fretta può causare eccessiva perdita di sangue che si compromise l&#39;integrità fisiologica del mouse. Difficoltà inserire il catetere è solitamente dovuto le dimensioni relativamente grandi del catetere rispetto all&#39;arteria femorale. Potrebbe essere necessario allungare il catetere in modo da ridurre il suo diametro. Inoltre, le punte delle # 5 pinze possono essere utilizzate per afferrare e allargare l&#39;apertura fatta nell&#39;arteria per facilitare nel posizionamento del catetere. In terzo luogo, la durata delle procedure chirurgiche in vivo dovrebbe essere minimizzato in modo che l&#39;anestesia uretano può essere somministrato appena possibile. L&#39;anestesia isoflurano può provocare vasodilatazione dei vasi sanguigni cerebrali 13, inclinazione così i dati di diametro capillare. Bisogna riconoscere che il software di analisi Amira può estrarre automaticamente i raggi delle navi tracciate a mano; Tuttavia, quando si utilizza questa funzione per analizzare le immagini z-stack da ex vivo il cervello, il valore è imprecisa. Questo perché, after rimuovendo il cervello, i capillari cerebrali non sono più in pressione, e può diventare morfologicamente distorta. La misurazione del diametro capillare in vivo elude questo problema perché i capillari sono posti sotto pressione, condizioni fisiologiche normali. Si deve anche notare che questo metodo non è senza limitazioni. In primo luogo, la formazione significativo è necessario per padroneggiare il vivo preparazione imaging. Un ricercatore deve imparare a eseguire in modo efficiente due tecniche tecnicamente impegnative (sottile cranio finestra corticale e cateterismo arterioso); un errore in entrambe tecnica può compromettere l&#39;esperimento e invalidare i dati. In secondo luogo, l&#39;analisi delle ex vivo z-stack è ad alta intensità di tempo. L&#39;scheletrizzazione un&#39;immagine z-stack di può durare fino a 2,5 ore. Inoltre, è consigliabile che tale analisi essere completato da un ricercatore esperto per garantire la coerenza del processo di scheletrizzazione (che comporta un&#39;attenta tr manualeacing dei vasi sanguigni). Una volta che tutti gli aspetti di questo protocollo sono padronanza, i dati ottenuti forniscono un più approfondito e la quantificazione fisiologicamente accurata dei parametri vascolari rispetto ad altri metodi tradizionalmente usati che mostrano densità capillare come capillari per unità di volume, o capillari per campo visivo. La tecnica di imaging in vivo in consente per lo studio di altri parametri tra cui, ma non solo, la velocità di globuli rossi, arteriole dilatazione, e rosso flusso di globuli 7,12, che può anche essere in grado di essere esaminata in studi longitudinali. Inoltre, può essere facilmente adattato e modificato per studiare le questioni di ricerca relative alla struttura del cervello microvascolare. Tali studi potrebbero includere quantificazione cambiamenti patogeni nelle capillare morfologia in altre malattie neurocognitivi, o misurando i cambiamenti legati all&#39;età densità capillare. Pertanto, il metodo presentato in questo documento è un attrezzo versatile e potente per la Quantitätanalisi ive dell&#39;architettura vascolare cerebrale.

Virus dell&#39;immunodeficienza umana 1 (HIV-1) invade il cervello durante la fase acuta di infezione da virus, e infetta produttivo sia microglia e macrofagi residenti del cervello, portando a loro attivazione - e il rilascio di entrambi mediatori dell&#39;infiammazione ospitanti di derivazione e l&#39;HIV-1 solubile virotoxins come la Tat e gp120 (rivisto in 1,2). Di conseguenza, uno stato cronico neuroinflammatory si stabilisce nel SNC, che è pensato per contribuire alla patogenesi di HIV-1 disturbi associati neurocognitivi (mano) 3-5. Sovraespressione cronica di HIV-1 Tat o interleuchina (IL) -17A nel SNC di topi ha mostrato di provocare microvascolare rarefazione 6,7. Ciò solleva la possibilità che neuroinfiammazione cronica può contribuire alla patogenesi di mano attraverso effetti sul sistema vascolare cerebrale. Al fine di esaminare ulteriormente la questione, abbiamo sviluppato metodi per quantificare strut vascolari cerebraliture. Questo documento descrive un metodo per quantificare il numero di nodi capillari, segmenti capillari, significa la lunghezza del segmento, la lunghezza totale del segmento, diametro medio capillare, e il volume totale capillare usando immagini in vivo di reti capillari attraverso una finestra corticale sottile cranio (modificato da precedentemente descritta protocolli) 8,9, nonché ex vivo imaging sezioni cerebrali, utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo approccio combinato prevede una quantificazione olistica parametri vascolari cerebrali, poiché il sottile cranio finestra corticale in vivo permette la preservazione dell&#39;ambiente cerebrale, mentre ex vivo imaging reti capillari in fettine di cervello permette la ricostruzione di completo, tridimensionale reti capillari - che possono poi essere quantificati utilizzando il software disponibile in commercio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:105px;">Leica Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MZ8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High Intensity Illuminator</td>
			<td style="width:105px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:105px;">Stryker&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TP3E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">T/PUMP</td>
			<td style="width:105px;">Gaymar Industries, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">TEC-4 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:105px;">Datex Ohmeda</td>
			<td style="width:119px;">447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Artificial Tear Gel</td>
			<td style="width:105px;">Butler AHS</td>
			<td style="width:119px;">7312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Povidone-Iodine solution&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aplicare</td>
			<td style="width:119px;">52380-1855-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Dumot #5 Forceps</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Ferric Chloride Solution</td>
			<td style="width:105px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:119px;">3120-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel</td>
			<td style="width:105px;">Henkel</td>
			<td style="width:119px;">45404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dental Cement</td>
			<td style="width:105px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Microtoruqe II Handpiece Kit</td>
			<td style="width:105px;">Pearson Dental</td>
			<td style="width:119px;">R14-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">005 Burr for Micro Drill</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Norland Blade (Dental Microblade)</td>
			<td style="width:105px;">Salvin Dental</td>
			<td style="width:119px;">6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Urethane</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td>Group 2B Carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Braided Suture</td>
			<td style="width:105px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">735G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">&#160;Arterial Catheter</td>
			<td style="width:105px;">SAI Infusion Technologies</td>
			<td style="width:119px;">MAC-01</td>
			<td>The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Blood Pressure Moniter</td>
			<td style="width:105px;">World Precision Intruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-BP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Blood Pressure Transducer and Cable</td>
			<td style="width:105px;">World Precision Intruments</td>
			<td style="width:119px;">BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RAPIDLab Blood Gas Analyzer&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Siemens&#160;</td>
			<td style="width:119px;">248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">40 &#956;l Capillary Tube</td>
			<td style="width:105px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">15401-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)</td>
			<td style="width:105px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Adult Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td style="width:105px;">Zivic Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BSMAS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olypmus</td>
			<td style="width:119px;">FV-1000 MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser</td>
			<td style="width:105px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">ImageJ Software</td>
			<td style="width:105px;">National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Amira Software</td>
			<td style="width:105px;">Visage Imaging&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cerebral vascular architecture using two-photon microscopy in a mouse model of hiv-induced neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

La finestra corticale sottile cranio permette in vivo due fotoni imaging capillari corticali (Figura 1). Una zona adatta per l&#39;immagine mostra numerosi, capillari distinti (Figura 1A). Nello stesso campo di vista, non c&#39;è arteriosa autofluorescenza parete cellulare, e ci possono essere altri segnali fluorescenti, quali il collagene, la fluorescenza indotte da generazione di seconda armonica 11 (Figura 1B). Dopo la preparazione della fetta cervello è completa, un area di esposizione di circa 1,5 millimetri dalla linea mediana si trova (Figura 2A). A 100 micron z-stack produce un&#39;immagine tridimensionale utilizzato per l&#39;analisi nel software analitico Amira (Figura 2B). La rete capillare viene quindi tracciata manualmente inserendo nodi all&#39;inizio e alla fine di un capillare, o in qualsiasi luogo in cui uno capillare branch in un altro (Figura 2C). Ciò produce un&#39;immagine completamente skeletonized da cui vengono estratti i parametri morfologici automaticamente (Figura 2D). Il numero di nodi capillari, segmenti, lunghezza media del segmento, lunghezza totale del segmento, e il volume totale capillare può essere estratto utilizzando due fotoni ex vivo imaging fettine cerebrali mouse (Figura 2). Figura 3 mostra i risultati rappresentativi ottenuti con il metodo presentato in questo documento. In questo esperimento, un modello di topo transgenico di neuroinfiammazione HIV è stato usato 10. La produzione del virus HIV virotoxin Tat è stata indotta a Tat + topi dal cibo doxiciclina infuso per 12 settimane. Il gruppo di controllo era costituito da littermates tat- alimentato lo stesso cibo. Non c&#39;era differenza statisticamente significativa tra Tat + e topi tat- in uno qualsiasi dei parametri misurati capillari. Pertanto, l&#39;esposizione di 12 settimane di cervello tiscausa di HIV-1 Tat non è sufficiente a provocare la rarefazione del microcircolo cerebrale. Al contrario, i nostri dati precedentemente pubblicati mostrano che più prolungata (20 settimane) espressione cronica del sistema nervoso centrale dei risultati Tat in rarefazione vasi cerebrali 7. Pertanto, i dati riportati qui (Figura 3) fornisce preziose nuove informazioni per quanto riguarda la cinetica del rimodellamento vascolare Tat-indotta all&#39;interno del sistema nervoso centrale di topi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53582/53582fig1.jpg" /> Figura 1. Acquisizione di diametro capillare corticale. (A) A seguito di una preparazione finestra corticale sottile cranio e iniezione endovenosa colorante fluorescente, microscopia a due fotoni è stato utilizzato per l&#39;immagine vascolarizzazione cerebrale. Nei nostri esperimenti, abbiamo usato un destrano coniugato con un rosso che emette rodamina colorante che è stato eccitato a 780 nm e la fluorescenza è stata visualizzata attraverso un passa-banda 607/36 filtro per le emissioni. <strong&gt; (B) Lo stesso campo di vista non deve mostrare alcuna autofluorescenza arteriosa rilevata attraverso un passa-banda 480/20 filtro per le emissioni. Generazione di seconda armonica può indurre altri segnali fluorescenti di apparire attraverso i filtri 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53582/53582fig2.jpg" /> Figura 2. Generazione di reti capillari scheletrato. (A) i topi sono stati iniettati per via endovenosa con un colorante fluorescente e sacrificato. Una sezione coronale 2 mm di cervello è stato preso tra 0 e bregma bregma -2, e di imaging è stata eseguita al bregma 0 circa 1,5 mm dalla linea mediana. UN viene mostrata un&#39;immagine rappresentativa della posizione scelta per l&#39;imaging corticale (scatola nera) da un C57BL / 6 del mouse. Questa regione, la somcorteccia atosensory, è stata scelta perché abbiamo precedentemente dimostrato che la disregolazione di sangue cerebrale può verificarsi in questo sito in Tat + topi 12. (B) rappresentazionali tre immagini z-stack dimensionali di reti capillari. (C) Schema del metodo utilizzato per tracciare manualmente capillari durante nave quantificazione. (D) immagini Rappresentante immagine z-stack di scheletrato. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53582/53582fig3.jpg" /> Figura 3. Quantificazione dell&#39;architettura vascolare cerebrale nel topo tat- contro topi esposti al candidato HIV virotoxin fo Tatr 12 settimane. I topi con una doxiciclina (DOX) inducibile di HIV-1 Tat transgene guidato dalla proteina gliale fibrillare (GFAP) promotore specifico-astrociti (HIV Tat-Tg topi) sono stati usati per esaminare l&#39;effetto dell&#39;infezione da HIV-1 neuroinfiammazione indotta struttura vascolare cerebrale, come descritto 7. Questi topi (Tat +, n = 3) sono stati esposti ad una malattia cronica (12 settimana) regime dell&#39;induzione Tat (es., 12 settimane di DOX). Topi tat- (n = 4) sono stati utilizzati come controlli di pari età (questi topi corrispondono ai fratellini non transgenici dei topi + Tat, e, pertanto, non esprimono HIV-1 Tat). Come i topi Tat +, i topi tat- anche ricevuto 12 settimane di esposizione DOX. Nei topi esposti a Tat per 12 settimane (Tat +), rispetto a quelli non esposti a Tat (tat-), non vi era alcuna differenza statisticamente significativa nel numero di nodi (A), il numero di segmenti (B), durata media del segmento (C), o la lunghezza capillare totale (D), diametro capillare (peri topi Tat +, abbiamo analizzato 14 capillari in 6 aree di imaging; per i topi tat-, abbiamo analizzato 7 capillari in 4 aree di imaging) (E), o il volume totale capillare (F). Dal momento che i dati non sono stati distribuiti normalmente (come determinato dal test di Shapiro-Wilk), il test esatto somma dei ranghi di Wilcoxon è stato utilizzato per calcolare la significatività statistica (determinato in questo caso come P &lt;0,05). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande questa cifra.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

quantification-cerebral-vascular-architecture-using-two-photon

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K Views.  University of Rochester Medical Center. This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Video: Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Un metodo volumetrico per la quantificazione di Vasospasm cerebrale in un modello murino di emorragia subaracnoidea

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the regulation of cerebral blood flow (CBF) is incompletely understood, especially at the capillary level. Two-photon microscopy is a powerful tool widely used to study CBF and its regulation. Currently, this field is limited by the lack of in vivo two-photon microscopy studies examining (1) CBF responses in three-dimensions, (2) conducted vascular responses, and (3) localized interventions within the vascular network. Here, we describe a 3D in vivo method using two-photon microscopy to study conducted vascular responses elicited by&#160;local ejection of ATP with a glass micro-pipette. Our method uses fast and repetitive hyperstack two-photon imaging providing precise diameter measurements by maximal intensity projection of the obtained images. Furthermore, we show that this method can also be used to study 3D astrocytic calcium responses. We also discuss the advantages and limitations of glass micro-pipette insertion and two-photon hyperstack imaging.

We present an optimized local ejection procedure using a glass micro-pipette and a fast two-photon hyperstack imaging method, which allows precise measurement of capillary diameter changes and investigation of its regulation in three dimensions.

In Vivo microscopia bidimensionale bidimensionale per studiare le risposte vascolari mediante l'espulsione locale dell'ATP utilizzando una micropipetta di vetro

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualizzazione della proteina Kinase un'attività nel mouse behaving fissato per la testa utilizzando la microscopia fluorescenza a due fotoinina in vivo

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...