We thank Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan, and Dr. Linda Callahan at the University of Rochester Multiphoton Core for technical advice throughout the completion of this protocol. We also thank Dr. Changyong Feng for expert statistical advice, and Dr. Maiken Nedergaard at the University of Rochester Medical Center for the headplate design used in this paper. This work was supported in part by grants T32GM007356 and R01DA026325 from the National Institutes of Health (NIH); and by the University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).

A Universidade do Comitê Universidade de Rochester em Recursos Animais aprovado todos os procedimentos realizados neste trabalho. Preparação 1. Pré-cirúrgica (e ratos) <ol><li> Prepare a área cirúrgica com todos os equipamentos necessários. Esterilizar todos os instrumentos utilizados durante o procedimento de antemão usando 70% de etanol. Opcionalmente, use um esterilizador de bolas de gude ou autoclave para esterilizar os instrumentos. </li><li> Posicione o mouse em uma câmara de indução isoflurano ligado a um vaporizador de isoflurano. Definir níveis de isoflurano a 4% a uma taxa de 1 L / min. Nota: para as experiências aqui relatadas, ratinhos com uma doxiciclina (DOX) indutível transgene HIV-1 Tat conduzida pela proteína glial fibrilar específicos de astrócitos (GFAP) promotor (ratinhos Tat de HIV-Tg) 10 foram utilizados para examinar o efeito do VIH -1 induzida neuroinflamaï¿½o em estrutura vascular cerebral, como descrito anteriormente 7,10. </li><li> Delicadamente incline a câmara de indução para observar o rato &amp;# 39; s reflexo de endireitamento. Uma vez que o reflexo de endireitamento foi suprimida, definir o nível de isoflurano a 2% e redireccionar o fluxo de ar a partir da câmara de indução para o cone de nariz na bancada cirúrgica. </li><li> Mova rapidamente o mouse da câmara de indução à infusão de água almofada de aquecimento. Continuar a aplicar isoflurano (1,5-2%), através do cone do nariz. Ajuste anestesia de acordo com a tolerância individual do mouse avaliada através freqüência respiratória (FR) de monitoramento. Nota: A depressão de RR pode perturbar parâmetros fisiológicos de gases que alteram o fluxo sanguíneo cerebral e avaliação diâmetro do vaso. Tentativa de manter RR entre 55-65 respirações por minuto. A frequência cardíaca (HR) também pode ser usado avaliar profundidade da anestesia; HR manter entre 300-450 batimentos por minuto para evitar alterações fisiológicas ao diâmetro do vaso. Tipicamente, a anestesia adequada será entre 1,5-2,0% de isoflurano em 1 L / min para um dado rato. </li><li> Realizar uma pitada dedo do pé para buscar ainda mais a profundidade da anestesia. Se o mouse não responder, commrência os procedimentos cirúrgicos. </li></ol> 2. Preparação do Cranial Janela Thin-crânio <ol><li> Aplique gel lágrima artificial para os olhos do mouse. Completamente remover os pêlos do couro cabeludo do rato usando uma tesoura ou um barbeador elétrico. </li><li> Esterilizar o couro cabeludo através da aplicação de solução de iodo-povidona; deixar secar. Então, sob um microscópio de luz, retire a pele do couro cabeludo do rato, expondo completamente os ossos parietais, ossos frontais caudais, e marcação Bregma. </li><li> Aplicar uma pequena quantidade de uma solução de cloreto férrico a 10% no crânio, a fim de secar as membranas para remoção fácil. Retirar as membranas secas com o # 5/45 fórceps raspando suavemente o crânio. </li><li> Aplicar uma fina camada de cola em torno da janela placa frontal. Pressionar suavemente a placa frontal contra o crânio do rato, mantendo a área de interesse no centro da janela. Aplicar uma gota de cimento dental para a placa frontal para polimerizar a cola. </li><li> Aplique uma camada finade cola ao longo da borda da janela de placa frontal para criar um reservatório em que a segurar salina. Uma vez que a cola secar, parafuso da placa frontal para o arnês do mouse placa frontal. Nota: o arnês de rato Headplate utilizado neste procedimento é uma estrutura com uma base de metal e duas colunas de metal. Em cada coluna há uma mola e uma porca de orelhas. A placa frontal é colocada no topo da mola, e a porca de orelhas é apertado até que a cabeça está nivelada e não se move. </li><li> Remova qualquer cola da janela placa frontal usando uma broca anexado a uma broca MicroTorque fixado em 6.000 rpm. Pare a cada 10-15 segundos para evitar o superaquecimento do rato crânio que pode resultar em danos estruturais aos navios. <ol><li> Utilizando uma nova broca, colocar a broca de 1,5 mm MicroTorque lateralmente a partir da linha média (um terço do diâmetro da janela da placa frontal). Começam a diluir o crânio em torno este local a 4.000 rpm. Mova a broca suavemente em todo o crânio sem pressão descendente direto. </li><li> Cease drilling cada 10-15 segundos para evitar o superaquecimento do crânio mouse. Durante este tempo, remover a poeira acumulada crânio utilizando um reservatório de ar comprimido. </li><li> Use gotas de solução salina RT para esfriar crânio para 5-10 seg. Remova cuidadosamente todo o líquido com um tecido macio para continuar afinamento crânio. </li></ol></li><li> Para a diluição final do crânio, colocar um pequeno volume de solução salina no reservatório placa frontal e levemente varrer uma micro-lâmina dentária através da área de interesse até pequenos vasos são claramente visíveis. </li></ol> 3. verificação de parâmetros fisiológicos <ol><li> Uma vez que o crânio é completamente diluído, retire o rato do suporte e colocá-lo em sua parte traseira. Gentilmente fita para baixo ambas as pernas traseiras para expor claramente as coxas medial. </li><li> Remova o cabelo sobre ambas as coxas medial com uma tesoura ou um barbeador elétrico. Desinfetar o local da cirurgia, cobrindo as coxas com iodopovidona. </li><li> Comprimir a pele na coxa medial à direita acima da veia femorale a artéria usando uma pinça # 5. Puxe delicadamente a pele para cima e usar uma tesoura para cortar e remover a pele. Nota: a coxa esquerda é reservada em caso de complicações cirúrgicas (anomalias vasculares, vasos rompidos). </li><li> Aplique aproximadamente 3-5 gotas de solução salina 0,9% ao sítio cirúrgico. Isto permite uma maior ampliação de navios, bem como mantendo o local hidratada e prevenir a secagem dos vasos. Separa-se a veia femoral a partir da artéria por sem rodeios dissecar no feixe neurovascular femoral usando dois # 5/45 fórceps. </li><li> Coloque dois, três peças cm de sutura cirúrgica por baixo da artéria femoral aproximadamente 1 cm de distância. Torça o horário de sutura superior para criar um torniquete vascular que vai ajudar a evitar a perda excessiva de sangue durante o cateterismo. </li><li> Faça uma pequena incisão na artéria femoral usando a tesoura primavera. Colocar o cateter na artéria através da incisão e avanço até que o cateter é segura no interior da artéria. </li><li&gt; Untwist a sutura superior (torniquete) para avaliar se há vazamentos e colocação do cateter adequado. Fixar o cateter na artéria femoral, amarrando dois nós em torno do cateter no interior do recipiente utilizando as suturas. </li><li> Injectam-se 10 uL de heparina (100 IU / ml) através do catéter para impedir a coagulação do sangue. Em seguida, feche cirurgicamente a coxa direita por costura a pele, juntamente com uma sutura 4-0 em um padrão simples interrompido. </li><li> Injecte 50 ul de uretano (1,2 mg / g) por via intraperitoneal no quadrante inferior direito. Cinco minutos mais tarde, repita com outra injecção de 50 uL para o quadrante inferior esquerdo para um total de 100 ul de uretano intraperitoneal. Lentamente reduzir os níveis de isoflurano para cerca de 0,25%, enquanto que concomitantemente rechecking rato para a profundidade de anestesia. Nota: Manter a agulha superficial dentro da cavidade peritoneal, ao longo da parede abdominal posterior de modo a que não perfure o intestino. Isto pode ser conseguido por beliscar o mu reto abdominalscles longe das vísceras e, em seguida, injetar. </li><li> Usando um tubo capilar, recolher uma amostra de 40 ul de sangue arterial a partir do catéter. Encaixe do cateter ao transdutor de pressão do sangue equipado com uma torneira de quatro vias cheio de solução salina e seringa cheia de heparina. </li><li> Tape o transdutor de pressão sanguínea para o aparelho cirúrgico para a remoção não intencional prevenir do cateter. Iniciar a monitoração da pressão arterial média. </li><li> Insira o sangue encheu tubo capilar em uma porta de entrada analisador de gases no sangue. Uma vez todo o sangue ter sido extraído, remover o tubo capilar a partir da porta de entrada. Os O 2 e CO 2 níveis de gases sanguíneos aparece em um papel impresso do analisador de gases no sangue. </li></ol> 4. Injecção do corante fluorescente <ol><li> Comprimir a pele na coxa esquerda medial usando o # 5 fórceps. Puxe delicadamente a pele para cima e usar uma tesoura para cortar e remover a pele. Prepare corante vermelho de rodamina conjugada com dextrano emissores(70 kDa) (10 mg / kg, dissolvidos em soro fisiológico). </li><li> Localizar a femoral vein.Using uma seringa de 1 ml com uma agulha G 30 anexado, desenhar uma solução previamente preparada de um corante fluorescente adequada para a imagiologia para a linha de 130 ul da seringa. Retirar as bolhas de ar através da elaboração o corante completamente para dentro da seringa e sacudindo firmemente parede da seringa. <ol><li> Dobre a agulha G 30 em um ângulo de aproximadamente 30 graus, pressionando-o contra uma superfície dura lado bisel para cima. Encher a agulha com o corante e eliminar qualquer excesso de líquido, deixando uma amostra de 100 ul. </li></ol></li><li> Injectar a amostra de 100 ul de corante lentamente para dentro da veia femoral. Após a remoção da agulha, aplicar constante, a pressão suavemente para o local da injecção para parar qualquer sangramento. Permitir que o corante circular durante 5 min. Nota: Alternativamente, a veia femoral direita pode ser usado em vez de a injecção de corante fluorescente para evitar a perda de sangue através da criação de um outro local cirúrgico. Além disso, se oanimais é a hemorragia descontrolada do local cirúrgico, este pode ser uma indicação de que o excesso de heparina foi determinada para lavar o cateter. Se não houver a coagulação dentro de 10-15 min e o mouse ainda está sangrando, considere reiniciar o experimento com um novo mouse. </li><li> Feche a coxa esquerda por costura a pele, juntamente com uma sutura 4-0, em seguida, virar cuidadosamente o mouse sobre seu estômago, e colocá-lo no arnês do mouse placa frontal. </li></ol> 5. In Vivo Two-Photon Imagens <ol><li> Mova o aparelho cirúrgico para o microscópio de dois fotões, certificando-se de manter os níveis de anestesia contínuas. Colocar uma pequena quantidade de 0,9% de solução salina para dentro do reservatório placa frontal e diminuir o objectivo do microscópio de modo que ele entra em contacto com a solução salina. Localize a área de interesse, utilizando o objetivo de visualização brightfield </li><li> Definir a excitação de dois fotões a um comprimento de onda de laser adequado para o corante fluorescente. Comece a imagem de dois fótons usando a 25x objective. Note-se que nestas experiências foi utilizado um dextrano conjugado com um corante rodamina vermelho emissor de que estava animado em um comprimento de onda de 780 nm. Um filtro passa banda 607/36 de emissão para detectar a fluorescência do corante, e um filtro de emissão de 480/20 passa banda foi utilizado para detectar a autofluorescência arterial </li><li> Localize um capilar cama na tela de exibição e ampliar essa área usando o zoom 2. Adquirir imagens ópticas dos capilares usando o software de imagem de dois fótons. </li><li> Depois de imagem estiver concluída, sacrificar o rato por deslocamento cervical seguido por decapitação. </li></ol> 6. Ex Vivo Two-Photon Imagens <ol><li> Usando a tesoura Extra Fino, fazer uma incisão no couro cabeludo dos ossos interparietais para os ossos frontais do mouse. Fixar a pele para os lados do crânio com o dedo indicador e o polegar. </li><li> Coloque a tesoura extra fino por baixo do osso interparietal medial e cortar o crânio ao longo da sutura sagital. Pare o corte do crânio de aproximadamente 3 mm após o bregma marcação. Nota: Aplicar uma pressão ascendente ao cortar o crânio para evitar o corte do cérebro. </li><li> Usando o # 5 fórceps, separar o crânio a partir do cérebro e cuidadosamente remover qualquer meninges a partir da superfície do cérebro. Meninges restantes podem acidentalmente lacerar o cérebro; deve ser tomado extremo cuidado para evitar isso. Deslize cuidadosamente os # 5 fórceps sob o cérebro avançando lentamente para a frente até que o cérebro está livre de crânio. Nota: se a pressão para baixo deve ser usado, a fim de evitar a perfuração do cérebro. </li><li> Coloque o cérebro de uma ferramenta de corte cerebral específico para ratos. Lave o cérebro através da aplicação de gotas de líquido cefalorraquidiano artificial sobre o cérebro. </li><li> Retirar a 2 mm Secção coronal do cérebro de bregma 0 a bregma -2. Coloque a secção coronal numa lâmina de vidro côncavo contendo líquido cefalorraquidiano artificial com a 0 bregma (maior parte cranial da secção) virado para cima. Gentilmente cobrir o cérebro slgelo com uma lamela de vidro. Nota: Evite pressionar o vidro uma vez colocado no seção do cérebro, pois isso pode deformar a arquitetura vascular. </li><li> Transferir as lâminas para o estágio do microscópio e coloque uma pequena quantidade de solução salina 0,9% sobre a lamela. Abaixe a objetiva do microscópio até que ele entra em contato com a solução salina. Localizar a linha média do cérebro utilizando a objectiva de campo claro. </li><li> Comece a imagem de dois fótons e localize a linha média novamente usando o objetivo de 25x. Conseguir isso, procurando a fissura longitudinal na superfície cortical da secção coronal. Coloque a borda direita da tela de imagem na linha média e mover a tela do espectador sobre lateralmente três quadros completos (aproximadamente 1,5 mm da linha média). Note-se que nestes experimentos, os parâmetros de imagem foram idênticos aos mencionados na nota no passo 5.2. </li><li> Localize a profundidade em que os capilares são pouco visíveis na tela de exibição. Abaixe o plano de foco mais 20iM para determinar o início do Z-pilha. </li><li> Defina a espessura imagem para 1 m. Abaixe a tela de visualização para 100 mm e ajustar a potência do laser ao longo de tal forma que menos de 1% dos pixels são oversaturated. Nota: as imagens z-stack são compilados a partir de uma série de 100 imagens 500x500x1 consecutivo M. Quanto maior a pilha z-os mais precisos os cálculos de pós-processamento será. Em geral, tentar recolher uma pilha de Z-100 um ou maior. </li><li> Pressione o ícone de repetição XY seguido pelo ícone XY adjacente. Uma vez que o z-stack for concluída, pressione o ícone Série Feito e salve o arquivo. </li></ol> 7. Processamento de Dados <ol><li> Abra uma imagem capilar vivo em no software ImageJ. Definir manualmente o pixel à relação de distância com base nos valores obtidos a partir do software de dois fótons. <ol><li> Selecione o ícone * * reta a partir do menu ferramentas. Desenhar uma linha que se estende a partir de uma parede capilar para o OPPOparede capilar local, e gravar o tamanho fornecido pelo ImageJ. Note-se que pode ser necessário para aumentar a imagem, a fim de visualizar claramente as bordas das paredes capilares. </li><li> Repetir o passo 7.1.1 em diferentes locais ao longo do capilar, assim como para múltiplos capilares na imagem. </li></ol></li><li> Abra o arquivo z-stack no software analítico, como Amira. Selecione o ícone Filament editor da barra de ferramentas sub-aplicação <ol><li> Defina a espessura do espectador a aproximadamente 20. Mova o espectador a parte superior ou inferior de z-stack. </li><li> Selecione o ícone de rastreamento e mova o cursor sobre a imagem carregada. Nós colocar no capilares nos locais descritos na Figura 2C; segmentos aparecerá automaticamente entre nós adjacentes. Seguir a capilares em todo o inteiro z-pilha. Nota: será necessário colocar os nós de entre os pontos finais e pontos de ramificação, a fim de traçar os capilares throughout o z-stack. </li><li> Para remover esses nós, clique no ícone Intermediate Remover. Nota: Isto pode criar segmentos em loop errôneas que devem ser removidos manualmente, selecionando o loop usando o ícone Individual Select, e em seguida, selecionando o ícone Remove Selected. Se lacetes continuam a aparecer na mesma área, durante o rastreio, é provável que os gânglios foram colocados em diferentes capilares. </li><li> Uma vez que o rastreamento estiver completo, selecione o ícone Graph informações para abrir uma planilha contendo os parâmetros vasculares extraídos automaticamente. O número de nós e segmentos estão disponíveis na tela de visualização principal. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O método aqui descrito pode ser aplicado para analisar as estruturas microvasculares cerebrais em uma ampla gama de modelos / configurações experimentais. Para o sucesso deste método, três passos críticos deve ser dominado. Em primeiro lugar, a janela crânio-fina não deve danificar o crânio ou cérebro subjacente. É fácil de perfurar o crânio durante o desbaste, ou causar perda vascular induzida pelo calor. Isto pode interferir com a formação de imagens conforme o corante fluorescente vai infiltrar-se no plano de foco e obscurecer os capilares. Se o crânio quebra com freqüência durante a preparação crânio-fino, ele é provavelmente causado por uma muito grande pressão para baixo. Segurando a broca MicroTorque o mais próximo possível para a rebarba permite maior controle tátil que irá diminuir a pressão sobre o crânio. Em segundo lugar, a cateterização arterial deve ocorrer o mais rapidamente possível uma vez que a artéria foi cortada. Deixar de inserir o cateter rapidamente pode causar perda excessiva de sangue que vai compromise a integridade fisiológica do mouse. Dificuldade de inserir o cateter é geralmente devido ao tamanho relativamente grande em comparação com o cateter da artéria femoral. Pode ser necessário para esticar o cateter, a fim de reduzir o seu diâmetro. Além disso, as pontas das pinças # 5 podem ser usadas para agarrar e ampliar a abertura feita na artéria para facilitar a colocação no do cateter. Em terceiro lugar, a duração dos procedimentos cirúrgicos in vivo deve ser minimizado de modo que a anestesia de uretano podem ser administradas tão rapidamente quanto possível. A anestesia isoflurano pode causar vasodilatação dos vasos sanguíneos cerebrais 13, desviando assim os dados de diâmetro capilar. Deve-se reconhecer que o software analítico Amira pode extrair automaticamente os raios de navios traçadas manualmente; no entanto, quando se utiliza esse recurso para analisar imagens de z-stack de ex vivo cérebros, o valor é impreciso. Isto é porque, afTer a remoção do cérebro, os capilares cerebrais não são pressurizadas, e pode tornar-se morfologicamente distorcida. A medida do diâmetro capilar in vivo contorna este problema, porque os capilares são pressurizadas em condições fisiológicas normais,. Deve também notar-se que este método não é sem limitações. Em primeiro lugar, a formação significativa é necessária para dominar a preparação in vivo de imagem. Um pesquisador deve aprender a executar de forma eficiente duas técnicas tecnicamente desafiadoras (crânio fino janela cortical e cateterismo arterial); um erro em qualquer técnica pode comprometer a experiência e invalida os dados. Em segundo lugar, a análise dos ex vivo z-stacks é demorada. A esqueletização uma imagem z-stack de pode levar até 2,5 horas. Além disso, é aconselhável que esta análise seja concluída por um investigador experiente para garantir a consistência do processo de esqueletização (que envolve tr manual do cuidadoacing dos vasos sanguíneos). Uma vez que todos os aspectos deste protocolo são dominados, os dados obtidos fornecem uma mais aprofundada e quantificação fisiologicamente exata dos parâmetros vasculares em comparação com outros métodos tradicionalmente utilizados que mostram a densidade capilar como capilares por unidade de volume, ou capilares por campo de visão. A técnica de imagiologia in vivo, permite o estudo de outros parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, velocidade das células vermelhas do sangue, a dilatação das arteríolas, e fluxo de glóbulos vermelhos 7,12, o que também pode ser capaz de ser examinadas em estudos longitudinais. Além disso, ele pode ser facilmente adaptada e modificada para estudar questões de investigação relacionadas com a estrutura microvascular cerebral. Tais estudos podem incluir quantificação de alterações na morfologia capilar patogênicos em outras doenças cognitivas, ou medir as mudanças relacionadas à idade na densidade capilar. Portanto, o método apresentado neste artigo é uma ferramenta versátil e poderosa para o Quantitätive análise da arquitetura vascular cerebral.

Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (VIH-1) invade o cérebro durante a fase aguda da infecção pelo vírus, e produtivamente infecta ambas as microglia e macrófagos residentes cérebro, que conduz à sua activação - e a libertação de ambos os mediadores inflamatórios derivados do hospedeiro e solúvel HIV-1 virotoxins como Tat e gp120 (revisto em 1,2). Como consequência, um estado neuroinflamatória crônica torna-se estabelecido no CNS, que é pensado para contribuir para a patogênese do HIV-1 Distúrbios Associated neurocognitivos (a mão) 3-5. Superexpressão crónica do HIV-1 Tat ou interleucina (IL) -17 no SNC de ratinhos foi mostrado para resultar em 6,7 rarefacção microvascular. Isto levanta a possibilidade de que neuroinflamaï¿½o crónica pode contribuir para a patogénese da mão através de efeitos sobre a vasculatura cerebral. A fim de analisar melhor esta questão, temos desenvolvido métodos para quantificar struc vasculares cerebraisturas. Este artigo descreve um método para a quantificação do número de nodos capilares, segmentos capilares, comprimento do segmento, o comprimento total do segmento dizer, o diâmetro médio do capilar, e o volume total do capilar utilizando imagiologia in vivo de redes capilares através de uma janela cortical crânio fina (modificado a partir do descrito anteriormente protocolos de 8,9), assim como ex vivo de imagens de secções do cérebro, utilizando microscopia de dois fotões. Esta abordagem combinada fornece para uma quantificação global de parâmetros vasculares cerebrais, desde fina-crânio janela cortical in vivo permite a preservação do meio ambiente cerebral, enquanto ex vivo de imagens de redes capilares em fatias de cérebro permite a reconstrução completa, tridimensional - redes capilares que pode, então, ser quantificada utilizando software disponível comercialmente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="630">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Leica Microscope</td>
			<td style="width:105px;">Leica Inc.</td>
			<td style="width:119px;">MZ8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High Intensity Illuminator</td>
			<td style="width:105px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Heating Pad</td>
			<td style="width:105px;">Stryker&#160;</td>
			<td style="width:119px;">TP3E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">T/PUMP</td>
			<td style="width:105px;">Gaymar Industries, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">TEC-4 Isoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:105px;">Datex Ohmeda</td>
			<td style="width:119px;">447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Artificial Tear Gel</td>
			<td style="width:105px;">Butler AHS</td>
			<td style="width:119px;">7312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Povidone-Iodine solution&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Aplicare</td>
			<td style="width:119px;">52380-1855-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Dumot #5 Forceps</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Ferric Chloride Solution</td>
			<td style="width:105px;">Ricca Chemical Company</td>
			<td style="width:119px;">3120-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel</td>
			<td style="width:105px;">Henkel</td>
			<td style="width:119px;">45404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dental Cement</td>
			<td style="width:105px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Microtoruqe II Handpiece Kit</td>
			<td style="width:105px;">Pearson Dental</td>
			<td style="width:119px;">R14-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">005 Burr for Micro Drill</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Norland Blade (Dental Microblade)</td>
			<td style="width:105px;">Salvin Dental</td>
			<td style="width:119px;">6900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Urethane</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U2500</td>
			<td>Group 2B Carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Braided Suture</td>
			<td style="width:105px;">Ethicon</td>
			<td style="width:119px;">735G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Vannas Spring Scissors</td>
			<td style="width:105px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">&#160;Arterial Catheter</td>
			<td style="width:105px;">SAI Infusion Technologies</td>
			<td style="width:119px;">MAC-01</td>
			<td>The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Blood Pressure Moniter</td>
			<td style="width:105px;">World Precision Intruments</td>
			<td style="width:119px;">SYS-BP1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Blood Pressure Transducer and Cable</td>
			<td style="width:105px;">World Precision Intruments</td>
			<td style="width:119px;">BLPR2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RAPIDLab Blood Gas Analyzer&#160;</td>
			<td style="width:105px;">Siemens&#160;</td>
			<td style="width:119px;">248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">40 &#956;l Capillary Tube</td>
			<td style="width:105px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">15401-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)</td>
			<td style="width:105px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Adult Mouse Brain Slicer Matrix</td>
			<td style="width:105px;">Zivic Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BSMAS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olypmus</td>
			<td style="width:119px;">FV-1000 MPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser</td>
			<td style="width:105px;">Spectra-Physics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:239px;">ImageJ Software</td>
			<td style="width:105px;">National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:239px;">Amira Software</td>
			<td style="width:105px;">Visage Imaging&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cerebral vascular architecture using two-photon microscopy in a mouse model of hiv-induced neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

A janela cortical crânio-fino permite in vivo de dois fotões imagiologia de capilares corticais (Figura 1). Uma área adequada para a imagem mostra numerosos capilares, distintos (Figura 1A). No mesmo campo de visão, não há nenhuma parede arterial autofluorescência celular, e podem existir outros sinais fluorescentes, tais como o colagénio, a fluorescência induzida por geração segunda harmónica 11 (Figura 1B). Uma vez que a preparação da fatia de cérebro é completa, uma área de aproximadamente 1,5 milímetros de imagem da linha média situa-se (Figura 2A). A 100 uM Z-pilha produz uma imagem tridimensional utilizado para análise no software analítico Amira (Figura 2B). A rede capilar é então rastreada manualmente, colocando os nós no início e no fim de um tubo capilar, ou qualquer local onde um capilar branchos para outra (Figura 2c). Isto produz uma imagem totalmente esqueletonizada a partir da qual os parâmetros morfológicos são automaticamente extraída (Figura 2D). O número de nós de capilares, segmentos, a média de comprimento de segmento, o comprimento total do segmento, e o volume total do capilar pode ser extraído usando dois fotões ex vivo de imagens de fatias do cérebro do rato (Figura 2). A Figura 3 mostra resultados representativos obtidos utilizando o método apresentado neste artigo. Nesta experiência, um modelo de ratinho transgénico de neuroinflamaï¿½o HIV foi utilizado 10. A produção do VIH virotoxin Tat foi induzida em ratinhos por Tat + alimentar infundido-doxiciclina durante 12 semanas. O grupo controle foi composto por ninhada Tat- alimentados com a mesma comida. Não houve diferença estatisticamente significativa entre Tat + e ratos Tat- em qualquer um dos parâmetros medidos capilares. Assim, a exposição do cérebro de 12 semanas &#39;Tisprocessar a Tat do HIV-1 é insuficiente para causar a rarefacção da microvasculatura cerebral. Em contraste, os nossos dados publicados anteriormente mostram que mais prolongado (20 semanas) CNS expressão crônica de resultados Tat em rarefação da vasculatura cerebral 7. Assim, os dados aqui mostrados (Figura 3) fornece nova informação valiosa no que respeita à cinética de remodelação vascular induzida por Tat no SNC de ratos. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53582/53582fig1.jpg" /> Figura 1. Aquisição de diâmetro capilar cortical. (A) Na sequência de uma preparação janela cortical fina crânio e injeção de corante fluorescente por via intravenosa, a microscopia de dois fótons foi usada para imagem vasculatura cerebral. Em nossos experimentos, utilizamos uma dextrano conjugado com um corante rodamina vermelho emissor de que estava animado em 780 nm, e fluorescência foi visualizado através de um filtro de emissão 607/36 passa banda. <strong&gt; (B) O mesmo campo de visão deve mostrar nenhum autofluorescência arterial como detectado através de um filtro de emissão 480/20 passa banda. Segunda geração harmônica pode induzir outros sinais fluorescentes para aparecer através dos filtros 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53582/53582fig2.jpg" /> Figura 2. Geração de redes capilares skeletonized. (A) Os ratinhos foram injectados intravenosamente com um corante fluorescente e sacrificados. A 2 mm de secção coronal do cérebro foi feita entre 0 e bregma bregma -2, e imagiologia foi realizada a 0 a bregma 1,5 mm a partir de cerca de linha média. UMA imagem representativa da localização cortical escolhido de imagem (caixa preta) para a partir de um C57BL / 6 do rato é mostrado. Nesta região, o somcórtex atosensory, foi escolhido porque temos mostrado anteriormente que a desregulação do sangue cerebral pode ocorrer neste local em Tat + camundongos 12. (B) Representação três imagens z-stack dimensionais de redes capilares. (C) Diagrama do método utilizado para traçar manualmente capilares durante quantificação navio. (D) imagem Representante imagem z-stack de skeletonized. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53582/53582fig3.jpg" /> Figura 3. A quantificação da arquitetura vascular cerebral em ratinhos Tat- face a ratinhos expostos ao VIH candidato virotoxin fo TatR 12 semanas. Os ratos com uma doxiciclina (DOX) indutível transgene HIV-1 Tat conduzida pela proteína fibrilar glial (GFAP) promotor específico de astrócitos (ratinhos Tat de HIV-Tg) foram utilizados para examinar o efeito do HIV-1 neuroinflamaï¿½o induzida sobre estrutura vascular cerebral, como descrito 7. Estes ratinhos (TAT +, n = 3) foram expostas a uma doença crónica (12 semanas) do regime de indução Tat (ie., 12 semanas de DOX). Tat- ratos (n = 4) foram utilizadas como controlos da mesma idade (estes ratos correspondem à mesma ninhada não-transgénica da Tat + ratinhos, e, portanto, não expressam o HIV-1 Tat). Tal como os ratinhos Tat +, os ratinhos Tat- também receberam 12 semanas de exposição DOX. Nos ratinhos expostos a Tat, durante 12 semanas (TAT +), em comparação com aqueles que não exposto a Tat (Tat-), não houve diferença estatisticamente significativa no número de nódulos (A), o número de segmentos (B), a média do comprimento de segmento (C), ou comprimento capilar total (D), o diâmetro capilar (poros ratos Tat +, foram analisados ​​14 capilares em 6 áreas de imagem; para os ratos Tat-, analisamos 7 capilares em 4 áreas de imagem) (E), ou volume total capilar (F). Uma vez que os dados não foram distribuídos normalmente (como determinado pelo teste de Shapiro-Wilk), foi utilizado o teste de soma de postos exato de Wilcoxon para calcular a significância estatística (determinado, neste caso, como P &lt;0,05). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53582/53582fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

quantification-cerebral-vascular-architecture-using-two-photon

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.2K visualizações.  University of Rochester Medical Center. This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Vídeo: Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Neurociência

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo Two-Photon Microscopia de terminações nervosas individuais em Pele

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor determining patient outcome and is therefore frequently taken as a study endpoint. However, in small animal studies on SAH, quantification of cerebral vasospasm is a major challenge. Here, an ex vivo method is presented that allows quantification of volumes of entire vessel segments, which can be used as an objective measure to quantify cerebral vasospasm. In a first step, endovascular casting of the cerebral vasculature is performed using a radiopaque casting agent. Then, cross-sectional imaging data are acquired by micro computed tomography. The final step involves 3-dimensional reconstruction of the virtual vascular tree, followed by an algorithm to calculate center lines and volumes of the selected vessel segments. The method resulted in a highly accurate virtual reconstruction of the cerebrovascular tree shown by a diameter-based comparison of anatomical samples with their virtual reconstructions. Compared with vessel diameters alone, the vessel volumes highlight the differences between vasospastic and non-vasospastic vessels shown in a series of SAH and sham-operated mice.

The goal of this article is to present a method that allows a 3-dimensional reconstruction of the cerebrovascular tree in mice after micro computed tomography and determination of volumes of entire vessel segments that can be used to quantify cerebral vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage.

Um método volumétrico para quantificação de vasoespasmo Cerebral em um modelo murino de hemorragia subaracnoide

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the regulation of cerebral blood flow (CBF) is incompletely understood, especially at the capillary level. Two-photon microscopy is a powerful tool widely used to study CBF and its regulation. Currently, this field is limited by the lack of in vivo two-photon microscopy studies examining (1) CBF responses in three-dimensions, (2) conducted vascular responses, and (3) localized interventions within the vascular network. Here, we describe a 3D in vivo method using two-photon microscopy to study conducted vascular responses elicited by&#160;local ejection of ATP with a glass micro-pipette. Our method uses fast and repetitive hyperstack two-photon imaging providing precise diameter measurements by maximal intensity projection of the obtained images. Furthermore, we show that this method can also be used to study 3D astrocytic calcium responses. We also discuss the advantages and limitations of glass micro-pipette insertion and two-photon hyperstack imaging.

We present an optimized local ejection procedure using a glass micro-pipette and a fast two-photon hyperstack imaging method, which allows precise measurement of capillary diameter changes and investigation of its regulation in three dimensions.

In vivo tridimensional microscopia de dois fótons para estudo conduzido respostas vasculares por ejeção ATP local usando uma micro-pipeta de vidro

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualizando proteína quinase uma atividade na cabeça-corrigido ratos comportando-se usando in vivo microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...